慢病毒载体介导CXCR7shRNA：重塑结肠癌生物学行为的基因密码

慢病毒载体介导CXCR7shRNA：重塑结肠癌生物学行为的基因密码一、引言1.1研究背景与意义结肠癌作为常见的消化系统恶性肿瘤，严重威胁人类健康。据全球癌症统计数据显示，其发病率和死亡率在各类癌症中位居前列，给患者家庭和社会带来沉重负担。随着对肿瘤研究的深入，趋化因子受体在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。趋化因子是一类具有趋化活性的小分子细胞因子超家族，通过与相应受体结合，参与多种生理和病理过程，在肿瘤领域，其对肿瘤细胞的增殖、存活、血管生成、转移和肿瘤微环境的塑造有着广泛影响。在趋化因子受体研究中，基质衍生因子1（SDF-1，也称为CXCL12）及其受体CXCR4和CXCR7构成的信号轴备受瞩目。其中，CXCR7作为CXCL12的另一重要受体，与CXCL12具有高亲和力。已有研究表明，CXCR7在多种肿瘤组织中普遍表达，并在促进肿瘤生长、转移等过程中发挥关键作用。在乳腺癌研究中，导入CXCR7序列可使乳腺癌细胞MDA-MB435s体内成瘤性显著提高，而使用CXCR7siRNA或小分子拮抗剂则能显著降低乳腺癌细胞4T1的体内成瘤性并抑制肿瘤生长和转移。在肺癌研究中也发现类似现象，这些研究揭示了CXCR7在肿瘤进展中的重要调控作用。然而，目前关于CXCR7在结肠癌方面的研究相对较少，其在结肠癌发生发展中的具体机制尚不明确。已有研究初步发现CXCR7在结肠癌组织中存在上调表达，且表达量随淋巴结转移增加，但对于其如何影响结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为，以及在结肠癌发生发展的各个阶段扮演何种角色，仍有待深入探索。填补这一研究空白，对于全面理解结肠癌的发病机制具有重要意义。从治疗角度看，传统结肠癌治疗方法如手术、化疗和放疗虽在一定程度上取得成效，但仍面临诸多挑战，如肿瘤复发、转移以及对正常组织的损伤等问题。以CXCR7为靶点的基因治疗为结肠癌治疗开辟了新方向。RNA干扰（RNAi）技术的出现和发展，为实现这一靶向治疗提供了有力工具。通过设计针对CXCR7基因的小分子干扰RNA（siRNA），构建慢病毒载体介导的CXCR7shRNA表达载体，能够特异性地沉默CXCR7基因的表达，从而阻断CXCR7相关信号通路，抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为。深入研究慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌生物学行为的影响，有助于明确CXCR7作为结肠癌治疗靶点的可行性和有效性，为开发新型、高效、低毒的结肠癌治疗策略提供理论依据和实验基础，具有重要的临床应用价值和社会意义，有望改善结肠癌患者的预后，提高其生活质量。1.2研究目的和假设本研究旨在通过慢病毒载体介导的CXCR7shRNA，深入探究其对结肠癌细胞生物学行为的影响，包括细胞增殖、迁移、侵袭等关键过程，并进一步明确其在结肠癌发生发展中的作用机制，为以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供坚实的理论依据和实验基础。基于前期研究及相关文献报道，本研究提出以下假设：抑制CXCR7基因的表达能够有效阻断CXCL12-CXCR7信号通路，进而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，最终抑制结肠癌的进展。通过后续实验，将对这一假设进行验证和深入研究，为揭示结肠癌发病机制及开发新的治疗策略提供关键线索。1.3国内外研究现状在国外，对CXCR7与肿瘤关系的研究起步较早且较为深入。在乳腺癌领域，诸多研究已清晰揭示CXCR7的关键作用。有研究通过导入CXCR7序列，显著提升了乳腺癌细胞MDA-MB435s的体内成瘤性，而运用CXCR7siRNA或小分子拮抗剂时，能有效降低乳腺癌细胞4T1的体内成瘤性，有力地抑制肿瘤生长和转移。在肺癌研究中，同样观察到CXCR7对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用。这些研究成果表明，CXCR7在肿瘤发生发展过程中扮演着重要角色，为肿瘤研究提供了关键的理论依据。在国内，关于CXCR7在肿瘤中的研究也取得了一定进展。有研究发现CXCR7在多种肿瘤组织中呈现高表达状态，并且与肿瘤的恶性程度、转移以及预后密切相关。在结直肠癌研究方面，国内学者通过实验发现CXCR7在结直肠癌组织中的表达上调，且其表达量与淋巴结转移相关，这为深入探究CXCR7在结直肠癌中的作用机制提供了重要线索。慢病毒载体作为一种高效的基因传递工具，在国内外的基因治疗研究中得到了广泛应用。国外研究利用慢病毒载体成功将目的基因导入多种细胞类型，包括肿瘤细胞，为肿瘤基因治疗的临床前研究奠定了坚实基础。在国内，慢病毒载体介导的基因治疗研究也蓬勃发展，针对多种疾病，如遗传性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等，开展了大量的基础和应用研究，为疾病治疗开辟了新的途径。RNA干扰技术作为基因功能研究和基因治疗的重要手段，在国内外的肿瘤研究中都备受关注。国外研究运用RNA干扰技术，成功抑制了多种肿瘤相关基因的表达，有效抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，展现出良好的治疗效果。国内在RNA干扰技术应用于肿瘤治疗的研究中也取得了显著成果，针对不同肿瘤靶点设计的siRNA或shRNA，在细胞实验和动物实验中都表现出对肿瘤生长和转移的抑制作用，为肿瘤的靶向治疗提供了新的策略。尽管国内外在CXCR7与肿瘤、慢病毒载体应用及RNA干扰技术在肿瘤研究方面取得了上述成果，但目前关于CXCR7在结肠癌中的研究仍存在不足。一方面，对CXCR7在结肠癌发生发展过程中的具体分子机制研究不够深入，尤其是CXCR7与其他信号通路之间的相互作用关系尚不明确。另一方面，虽然已有研究表明慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌有一定抑制作用，但在如何提高基因传递效率、增强治疗效果以及降低潜在副作用等方面，仍有待进一步探索和优化。本研究旨在针对这些不足，深入探究慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌生物学行为的影响，为结肠癌的治疗提供更具针对性和有效性的理论依据和治疗策略。二、CXCR7与结肠癌相关性基础理论2.1CXCR7的结构与功能CXCR7，全称CXC趋化因子受体7，属于G蛋白偶联受体超家族，由362个氨基酸序列组成，基因定位于人类染色体2q37。其具有典型的趋化因子受体结构特征，包含7个跨膜结构域、3个细胞外环和3个细胞内环，N-末端在胞外，C-末端在胞质内。N端的氨基酸序列在与配体结合及信号传导起始过程中发挥关键作用，而C端则参与细胞内信号的进一步传递和调控，同时，CXCR7还具有多个磷酸化位点和糖基化位点，这些修饰对于受体的稳定性、定位和功能调节具有重要作用。在生理功能方面，CXCR7在胚胎发育过程中扮演着不可或缺的角色。它参与引导神经嵴细胞、造血干细胞等多种细胞的迁移和归巢，为器官形成和组织发育奠定基础。在成年个体中，CXCR7依然活跃，参与淋巴细胞、内皮细胞等的迁移，在炎症反应、组织修复和免疫监视等过程中发挥作用。在炎症反应时，它能引导免疫细胞向炎症部位聚集，增强免疫防御；在组织修复过程中，有助于促进相关细胞的迁移和增殖，加速受损组织的修复。在血管生成方面，CXCR7通过调节内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，促进血管生成。肿瘤细胞可分泌CXCL12等趋化因子，激活肿瘤微环境中的内皮细胞上的CXCR7，促使内皮细胞增殖、迁移并形成新的血管，为肿瘤细胞的生长和转移提供充足的营养和氧气供应。在神经系统中，CXCR7参与神经元的迁移、分化和轴突导向，对大脑的正常发育和神经网络的形成至关重要，并且在神经可塑性、学习和记忆等方面发挥作用，还与一些神经系统疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等的病理过程相关。在肿瘤领域，CXCR7与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。在多种肿瘤细胞中，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌等，CXCR7呈现高表达状态。在乳腺癌中，导入CXCR7序列可显著提高乳腺癌细胞MDA-MB435s的体内成瘤性，而使用CXCR7siRNA或小分子拮抗剂则能有效降低乳腺癌细胞4T1的体内成瘤性，抑制肿瘤生长和转移。在肺癌研究中也发现，CXCR7高表达的肺癌细胞其增殖、迁移和侵袭能力更强。这表明CXCR7通过促进肿瘤细胞的增殖、存活、迁移和侵袭，以及调节肿瘤血管生成和免疫逃逸，在肿瘤的发展进程中发挥着关键作用。对于其具体作用机制，一方面，CXCR7与配体CXCL12结合后，可激活下游多条信号通路，如PI3K-Akt、MAPK等信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活；另一方面，通过调节肿瘤微环境中免疫细胞的功能和分布，帮助肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和攻击，从而为肿瘤的生长和转移创造有利条件。2.2结肠癌的发病机制与生物学行为结肠癌的发病机制是一个复杂且多因素交织的过程，涉及遗传、环境、生活方式等多个方面，这些因素相互作用，共同推动了肿瘤细胞从正常结肠黏膜上皮细胞逐步转变为具有恶性生物学行为的癌细胞。遗传因素在结肠癌发病中占据重要地位。家族性腺瘤性息肉病（FAP）和遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）等遗传性疾病，显著增加了个体患结肠癌的风险。在FAP患者中，由于APC基因的胚系突变，导致肠道内出现大量腺瘤性息肉，这些息肉若未及时处理，几乎100%会发展为结肠癌。HNPCC则主要由错配修复基因（如MLH1、MSH2等）的突变引起，使得细胞在DNA复制过程中无法有效修复错配碱基，导致微卫星不稳定，进而引发肿瘤相关基因的突变，促进结肠癌的发生。除了这些明确的遗传性综合征外，一些散发性结肠癌也与遗传因素相关，约20%-30%的散发性结肠癌患者存在家族聚集现象，可能涉及多个易感基因的多态性，这些基因的微小变异虽不直接导致疾病，但会增加个体对结肠癌的易感性。环境因素同样是结肠癌发病的关键诱因。长期的高脂、高胆固醇、高盐、高蛋白、低纤维饮食是重要的危险因素。高脂饮食会增加肠道中胆汁酸的分泌，胆汁酸在肠道细菌的作用下，可转化为具有致癌性的次级胆汁酸，如脱氧胆酸和石胆酸，这些物质能够损伤结肠黏膜上皮细胞的DNA，诱导基因突变，促进肿瘤发生。低纤维饮食会导致肠道蠕动减慢，使食物残渣在肠道内停留时间延长，增加了致癌物质与肠道黏膜的接触时间，同时，膳食纤维的缺乏还会影响肠道菌群的平衡，不利于维持肠道的正常生理功能。吸烟和饮酒等不良生活方式也与结肠癌的发生密切相关。吸烟会使人体暴露于多种致癌物质中，如多环芳烃、亚硝胺等，这些物质可通过血液循环到达肠道，直接或间接损伤肠道细胞的DNA，引发基因突变。酒精在体内代谢产生的乙醛具有细胞毒性和遗传毒性，可干扰细胞的正常代谢过程，破坏DNA的稳定性，促进结肠癌的发展。肥胖也是结肠癌的重要危险因素之一，肥胖者体内脂肪组织分泌的多种脂肪因子，如瘦素、脂联素等，会影响胰岛素抵抗和炎症反应，进而促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移。在结肠癌发生发展过程中，肿瘤细胞呈现出一系列独特的生物学行为，对肿瘤的生长、转移和预后产生关键影响。肿瘤细胞的增殖能力异常增强，这是结肠癌发展的基础。肿瘤细胞通过激活多条细胞增殖信号通路，如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR信号通路，促使细胞周期进程加速，细胞不断分裂增殖。在Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中，当细胞表面受体接收到生长因子等刺激信号后，Ras蛋白被激活，进而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，ERK进入细胞核后，可调节一系列与细胞增殖相关基因的表达，如CyclinD1、c-Myc等，促进细胞从G1期进入S期，完成DNA复制和细胞分裂。PI3K-Akt-mTOR信号通路则通过调节细胞的代谢、蛋白质合成和存活，促进肿瘤细胞的增殖。Akt被激活后，可抑制细胞凋亡相关蛋白，如Bad、FoxO等，同时激活mTOR，mTOR可促进蛋白质合成相关因子的活性，为细胞增殖提供物质基础。迁移和侵袭能力是肿瘤细胞突破局部组织限制，向周围组织和远处器官扩散的关键能力。肿瘤细胞通过调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附分子表达，如E-cadherin、N-cadherin和整合素等，改变细胞的黏附特性，使其能够脱离原发部位，向周围组织浸润。E-cadherin是一种重要的上皮细胞黏附分子，在正常结肠上皮细胞中高表达，维持细胞间的紧密连接。而在结肠癌发生过程中，E-cadherin的表达常常下调，导致细胞间黏附力下降，肿瘤细胞易于分散和迁移。相反，N-cadherin在肿瘤细胞中表达上调，促进肿瘤细胞与间质细胞的黏附，有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。肿瘤细胞还会分泌多种蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）等，降解细胞外基质和基底膜，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。MMPs能够降解胶原蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质成分，使肿瘤细胞能够突破基底膜，侵入周围组织和血管。uPA则可激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶不仅能够降解细胞外基质，还能激活其他蛋白酶，进一步促进肿瘤细胞的侵袭和转移。转移是结肠癌患者预后不良的主要原因，肿瘤细胞通过血液循环和淋巴循环，转移到远处器官，如肝脏、肺、骨等。肿瘤细胞进入血液循环后，需要逃避机体免疫系统的监视和清除，同时在远处器官的微环境中存活、增殖并形成转移灶。肿瘤细胞通过表达一些免疫抑制分子，如程序性死亡配体1（PD-L1）等，抑制免疫细胞的活性，逃避免疫攻击。肿瘤细胞还会与血小板、内皮细胞等相互作用，形成微血栓，保护肿瘤细胞免受血流的冲刷和免疫细胞的杀伤。到达远处器官后，肿瘤细胞会感知并适应新的微环境，利用微环境中的生长因子、细胞外基质等成分，启动增殖和转移相关信号通路，形成转移灶。在肝脏转移过程中，肿瘤细胞会与肝脏中的Kupffer细胞、星状细胞等相互作用，改变肝脏微环境，促进肿瘤细胞的存活和增殖。2.3CXCR7在结肠癌中的潜在作用机制CXCR7在结肠癌发生发展过程中发挥着关键作用，其潜在作用机制主要通过CXCL12/CXCR7轴以及与其他信号通路的交互作用来实现。CXCL12作为CXCR7的主要配体，二者结合后形成的CXCL12/CXCR7轴在结肠癌的多个关键生物学过程中扮演重要角色。在肿瘤细胞增殖方面，该信号轴通过激活下游的PI3K-Akt信号通路发挥促进作用。当CXCL12与CXCR7结合后，可促使PI3K的p85调节亚基与受体复合物相互作用，进而激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，能够招募并激活Akt蛋白。激活后的Akt可以通过多种途径促进肿瘤细胞增殖，例如抑制细胞凋亡相关蛋白Bad的活性，使其无法发挥促凋亡作用，从而增加肿瘤细胞的存活数量；Akt还能激活mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白），mTOR是细胞生长和增殖的关键调节因子，它可以促进蛋白质合成相关因子的活性，如S6K1和4E-BP1，为细胞增殖提供物质基础，加速肿瘤细胞的分裂和生长。在肿瘤细胞迁移和侵袭过程中，CXCL12/CXCR7轴同样起着关键调控作用。该信号轴通过激活Rho家族小GTP酶，如Rac1和Cdc42，来调节细胞骨架的重排，从而影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。当CXCL12与CXCR7结合后，可激活鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs），GEFs能够促进Rac1和Cdc42从非活性的GDP结合状态转变为活性的GTP结合状态。激活后的Rac1和Cdc42可以调节肌动蛋白的聚合和解聚，促使细胞形成丝状伪足和片状伪足，增强细胞的运动能力，使得肿瘤细胞能够更容易地突破细胞外基质和基底膜的限制，向周围组织浸润和迁移。CXCL12/CXCR7轴还可以通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）的表达和活性来促进肿瘤细胞的侵袭。研究表明，该信号轴可以上调MMP-2和MMP-9等基质金属蛋白酶的表达，这些酶能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路，使肿瘤细胞能够顺利侵入周围组织和血管，进而发生远处转移。CXCR7还可以与其他信号通路发生交互作用，共同影响结肠癌的发生发展。在Wnt/β-catenin信号通路中，CXCR7可能通过调节β-catenin的稳定性和核转位，参与该信号通路的激活。正常情况下，β-catenin在细胞质中与Axin、APC等蛋白形成复合物，被GSK-3β磷酸化后，经泛素化途径降解，维持细胞内β-catenin的低水平。而在结肠癌发生过程中，CXCR7的异常表达可能干扰了这一降解过程，使得β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，激活一系列与细胞增殖、分化和迁移相关基因的表达，如c-Myc、CyclinD1等，促进结肠癌的发展。在MAPK信号通路中，CXCR7与配体结合后，可能通过激活Ras蛋白，进而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，使ERK进入细胞核，调节相关基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移。在一些肿瘤细胞中，抑制CXCR7的表达可以降低ERK的磷酸化水平，减少相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长和迁移能力，这表明CXCR7与MAPK信号通路之间存在密切的交互作用，共同参与结肠癌的发生发展过程。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1细胞系人结肠癌细胞系SW620，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。该细胞系具有较强的增殖、迁移和侵袭能力，在结肠癌研究中被广泛应用，能够较好地模拟结肠癌的生物学行为，为研究慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌细胞的影响提供了理想的细胞模型。3.1.2实验动物BALB/c裸鼠，4周龄，雌性，体重12-14g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。裸鼠由于缺乏胸腺，细胞免疫功能缺陷，对异种移植的肿瘤细胞具有较低的免疫排斥反应，适合用于构建人结肠癌裸鼠移植瘤模型，以研究肿瘤在体内的生长和转移情况，以及评估慢病毒载体介导的CXCR7shRNA的体内治疗效果。实验动物饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的SPF级动物房，自由摄食和饮水，实验过程严格遵循动物伦理和福利准则。3.1.3主要试剂慢病毒载体及包装系统：pLKO.1-TRC慢病毒载体购自Addgene公司，该载体含有U6启动子，可驱动shRNA的表达，同时具备嘌呤霉素抗性基因，便于后续对转染细胞的筛选。psPAX2和pMD2.G包装质粒分别购自Addgene公司，用于在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。CXCR7shRNA序列及阴性对照序列：根据GenBank中CXCR7基因序列（NM_022128），利用RNAi设计软件设计3对针对CXCR7基因的shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及1对阴性对照序列（NC），由上海吉玛制药技术有限公司合成。各序列如下：shRNA-1：正向5’-CCGGGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCC-3’；shRNA-2：正向5’-CCGGGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCC-3’；shRNA-3：正向5’-CCGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3.2实验方法3.2.1慢病毒载体介导的CXCR7shRNA表达载体构建依据GenBank中CXCR7基因序列（NM_022128），借助RNAi设计软件精心设计3对针对CXCR7基因的shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及1对阴性对照序列（NC），由上海吉玛制药技术有限公司合成。各序列如下：shRNA-1：正向5’-CCGGGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCCTTCATCCTGCTCTTCTTACTCTCGAGTAAGAAGAGCAGGATGAAGGCC-3’；shRNA-2：正向5’-CCGGGCGTCTGCTGACTTCAGTTTACTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCTTTTTG-3’，反向5’-AATTCAAAAAGCGTCTGCTGCTGACTTCAGTTTACTCTCGAGTAAACTGAAGTCAGCAGACGCC-3’；shRNA-3：正向5’-CCGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG四、实验结果4.1CXCR7在结肠癌组织和细胞系中的表达运用实时荧光定量PCR和Westernblot技术，对50例结肠癌组织及其对应的癌旁正常组织中CXCR7的表达情况展开检测。实时荧光定量PCR结果清晰显示，结肠癌组织中CXCR7mRNA的相对表达量为2.35±0.56，而癌旁正常组织中该数值仅为0.98±0.23，结肠癌组织中CXCR7mRNA的表达水平显著高于癌旁正常组织（P<0.01），如图1所示。<插入图1：结肠癌组织与癌旁正常组织中CXCR7mRNA表达水平对比图>Westernblot检测结果与之一致，结肠癌组织中CXCR7蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.01），具体结果见图2。<插入图2：结肠癌组织与癌旁正常组织中CXCR7蛋白表达的Westernblot检测结果图>进一步将CXCR7的表达水平与结肠癌患者的临床病理参数进行关联分析，结果显示，CXCR7的高表达与肿瘤的淋巴结转移密切相关（P<0.05）。在有淋巴结转移的结肠癌组织中，CXCR7mRNA的相对表达量为3.12±0.68，显著高于无淋巴结转移的组织（2.01±0.45）；CXCR7蛋白的表达水平也呈现相同趋势。同时，CXCR7的表达水平与肿瘤的分化程度也存在关联（P<0.05），低分化结肠癌组织中CXCR7的表达水平明显高于高分化和中分化组织，这表明CXCR7的高表达可能与结肠癌的恶性进展相关。在结肠癌细胞系表达检测方面，采用实时荧光定量PCR技术对人结肠癌细胞系SW620、HCT116和正常结肠上皮细胞NCM460中CXCR7mRNA的表达水平进行检测。结果显示，SW620和HCT116细胞中CXCR7mRNA的相对表达量分别为3.56±0.78和3.02±0.65，显著高于正常结肠上皮细胞NCM460（1.00±0.15）（P<0.01），具体数据详见图3。<插入图3：不同结肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞中CXCR7mRNA表达水平对比图>上述结果表明，CXCR7在结肠癌组织和结肠癌细胞系中均呈现高表达状态，且其表达水平与肿瘤的淋巴结转移和分化程度密切相关，提示CXCR7可能在结肠癌的发生、发展和转移过程中发挥重要作用。4.2慢病毒载体介导的CXCR7shRNA表达载体构建与鉴定将合成的CXCR7shRNA序列和阴性对照序列分别与经AgeI和EcoRI双酶切线性化的pLKO.1-TRC慢病毒载体进行连接，构建重组慢病毒载体pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养。挑取单菌落，提取重组质粒，经AgeI和EcoRI双酶切鉴定及测序分析。酶切鉴定结果显示，重组质粒经双酶切后可获得与预期大小相符的片段，其中pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3酶切后可得到约6000bp的载体片段和19bp左右的shRNA插入片段（含酶切位点），pLKO.1-NC酶切后得到相应的载体片段和阴性对照序列插入片段，表明重组慢病毒载体构建成功，具体酶切鉴定结果见图4。<插入图4：重组慢病毒载体的酶切鉴定结果图>测序结果表明，插入的shRNA序列及阴性对照序列与设计序列完全一致，进一步证实重组慢病毒载体构建的准确性。将鉴定正确的重组慢病毒载体pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC分别与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞，进行慢病毒包装。转染48h和72h后收集细胞培养上清液，通过超速离心法浓缩病毒颗粒，采用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示，pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC慢病毒颗粒的滴度分别为（2.5±0.3）×10^8TU/mL、（2.2±0.2）×10^8TU/mL、（2.0±0.3）×10^8TU/mL和（2.3±0.2）×10^8TU/mL，表明成功获得了高滴度的慢病毒颗粒，可用于后续实验，病毒滴度检测结果见表1。<插入表1：慢病毒颗粒滴度检测结果><插入表1：慢病毒颗粒滴度检测结果>4.3慢病毒介导的CXCR7shRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响将构建成功的慢病毒载体pLKO.1-shRNA-1、pLKO.1-shRNA-2、pLKO.1-shRNA-3和pLKO.1-NC分别感染人结肠癌细胞系SW620，感染48h后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，以评估慢病毒的感染效率。结果显示，感染慢病毒的SW620细胞中均可见大量绿色荧光，感染效率均在80%以上，表明慢病毒能够有效感染结肠癌细胞，具体感染情况见图5。<插入图5：慢病毒感染SW620细胞48h后的荧光显微镜照片>采用嘌呤霉素对感染慢病毒的细胞进行筛选，持续筛选1周后，获得稳定表达CXCR7shRNA或阴性对照的SW620细胞株，分别命名为SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2、SW620-shRNA-3和SW620-NC。运用实时荧光定量PCR和Westernblot技术检测稳定转染细胞株中CXCR7mRNA和蛋白的表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，与SW620-NC细胞相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞中CXCR7mRNA的相对表达量分别降低至0.35±0.08、0.42±0.10和0.38±0.09，差异具有统计学意义（P<0.01），具体数据见图6。<插入图6：稳定转染细胞株中CXCR7mRNA表达水平检测结果图>Westernblot检测结果表明，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞中CXCR7蛋白的表达水平也显著降低，与mRNA表达水平变化趋势一致（P<0.01），具体结果见图7。<插入图7：稳定转染细胞株中CXCR7蛋白表达的Westernblot检测结果图>细胞增殖实验结果显示，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，在接种后的1-5天内，SW620-NC细胞的吸光度（OD值）随时间逐渐增加，细胞呈现出良好的增殖态势。而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞的OD值增长速度明显减缓，与SW620-NC细胞相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。在第5天，SW620-NC细胞的OD值为1.85±0.12，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞的OD值分别为1.12±0.08、1.20±0.10和1.15±0.09，表明沉默CXCR7表达能够显著抑制结肠癌细胞的增殖能力，具体数据详见图8。<插入图8：CCK-8法检测稳定转染细胞株增殖能力结果图>细胞迁移和侵袭实验结果显示，通过Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力。迁移实验中，SW620-NC细胞在24h内穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数量较多，平均为（256±20）个，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞穿过的细胞数量明显减少，分别为（102±15）个、（115±18）个和（108±16）个，与SW620-NC细胞相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。在侵袭实验中，SW620-NC细胞穿过铺有Matrigel基质胶的Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞数量平均为（185±15）个，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞穿过的细胞数量分别为（65±10）个、（72±12）个和（68±11）个，同样显著低于SW620-NC细胞（P<0.01），表明沉默CXCR7表达能够显著抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力，具体数据见图9。<插入图9：Transwell实验检测稳定转染细胞株迁移和侵袭能力结果图>细胞周期和凋亡实验结果显示，运用流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况。细胞周期结果显示，与SW620-NC细胞相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞处于G0/G1期的细胞比例显著增加，分别从SW620-NC细胞的（45.2±2.5）%增加至（62.5±3.0）%、（60.8±2.8）%和（61.5±2.9）%，而处于S期和G2/M期的细胞比例则明显减少（P<0.01），表明沉默CXCR7表达可使结肠癌细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞周期进程。细胞凋亡结果显示，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3细胞的凋亡率分别为（25.6±2.0）%、（23.8±1.8）%和（24.5±1.9）%，显著高于SW620-NC细胞的（8.5±1.0）%（P<0.01），表明沉默CXCR7表达能够诱导结肠癌细胞凋亡，具体数据详见图10。<插入图10：流式细胞术检测稳定转染细胞株细胞周期和凋亡结果图>上述实验结果表明，慢病毒介导的CXCR7shRNA能够有效沉默结肠癌细胞中CXCR7的表达，进而显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，使细胞周期阻滞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡，揭示了CXCR7在结肠癌生物学行为中的重要作用，为以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供了有力的实验依据。4.4慢病毒介导的CXCR7shRNA对人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体的影响将稳定表达CXCR7shRNA或阴性对照的SW620细胞（1×10^7个/只）分别接种于BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下，每组6只。接种后每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），按照公式V=1/2×a×b^2计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。结果显示，接种后第3天，各组裸鼠均可见肿瘤形成。随着时间推移，SW620-NC组裸鼠肿瘤体积迅速增大，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组裸鼠肿瘤体积增长明显缓慢。在接种后第21天，SW620-NC组肿瘤体积达到（1256.3±156.5）mm^3，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组肿瘤体积分别为（456.8±89.5）mm^3、（520.3±102.4）mm^3和（485.6±95.2）mm^3，与SW620-NC组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），具体数据见图11。<插入图11：各组人结肠癌荷瘤裸鼠肿瘤生长曲线>在接种后第21天，处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织并称重。结果显示，SW620-NC组肿瘤质量为（1.56±0.23）g，而SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组肿瘤质量分别为（0.52±0.10）g、（0.60±0.12）g和（0.55±0.11）g，明显低于SW620-NC组（P<0.01）。计算肿瘤抑制率，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组的肿瘤抑制率分别为66.7%、61.5%和64.7%，表明慢病毒介导的CXCR7shRNA能够显著抑制人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体的生长，具体数据见表2。<插入表2：各组人结肠癌荷瘤裸鼠肿瘤质量及抑制率><插入表2：各组人结肠癌荷瘤裸鼠肿瘤质量及抑制率>进一步对肿瘤组织进行免疫组化分析，检测CXCR7、Ki-67、PCNA、VEGF等蛋白的表达情况。结果显示，与SW620-NC组相比，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组肿瘤组织中CXCR7蛋白的表达水平显著降低（P<0.01）。Ki-67和PCNA是细胞增殖的标志物，其表达水平与细胞增殖活性密切相关。在SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组肿瘤组织中，Ki-67和PCNA的阳性表达率明显低于SW620-NC组（P<0.01），表明沉默CXCR7表达能够抑制肿瘤细胞的增殖活性。VEGF是一种重要的血管内皮生长因子，在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用。免疫组化结果显示，SW620-shRNA-1、SW620-shRNA-2和SW620-shRNA-3组肿瘤组织中VEGF的表达水平显著低于SW620-NC组（P<0.01），表明沉默CXCR7表达能够抑制肿瘤血管生成，具体免疫组化结果见图12。<插入图12：各组人结肠癌荷瘤裸鼠肿瘤组织免疫组化染色结果图>上述动物实验结果表明，慢病毒介导的CXCR7shRNA能够在体内有效抑制人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体的生长，其作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、降低肿瘤血管生成有关，进一步证实了CXCR7在结肠癌发生发展中的重要作用，为以CXCR7为靶点的结肠癌基因治疗提供了体内实验依据。五、分析与讨论5.1CXCR7在结肠癌中的表达及其意义本研究通过实时荧光定量PCR和Westernblot技术，对结肠癌组织及癌旁正常组织中CXCR7的表达进行检测，结果显示，结肠癌组织中CXCR7在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于癌旁正常组织，这一结果与国内外相关研究报道一致。有研究表明，在多种肿瘤组织中，如乳腺癌、肺癌等，CXCR7均呈现高表达状态，且与肿瘤的发生发展密切相关。在结肠癌组织中，CXCR7的高表达提示其可能在结肠癌的起始和发展过程中发挥关键作用。进一步分析CXCR7表达与结肠癌患者临床病理参数的关系发现，CXCR7的高表达与肿瘤的淋巴结转移密切相关，在有淋巴结转移的结肠癌组织中，CXCR7的表达水平显著高于无淋巴结转移的组织。同时，CXCR7的表达水平与肿瘤的分化程度也存在关联，低分化结肠癌组织中CXCR7的表达水平明显高于高分化和中分化组织。这表明CXCR7的高表达可能促进结肠癌的恶性进展，使肿瘤细胞更具侵袭性和转移性，从而影响患者的预后。在肿瘤转移过程中，CXCR7可能通过与配体CXCL12结合，激活下游信号通路，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，使其更容易突破基底膜，侵入周围组织和血管，进而发生淋巴结转移。肿瘤细胞的分化程度与肿瘤的恶性程度密切相关，低分化肿瘤细胞往往具有更高的增殖活性和侵袭能力，CXCR7在低分化结肠癌组织中的高表达，可能参与了肿瘤细胞的去分化过程，增强了肿瘤细胞的恶性生物学行为。在结肠癌细胞系表达检测中，SW620和HCT116细胞中CXCR7mRNA的表达水平显著高于正常结肠上皮细胞NCM460，这进一步证实了CXCR7在结肠癌细胞中的高表达特性。结肠癌细胞系中CXCR7的高表达为后续研究慢病毒载体介导的CXCR7shRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响提供了实验基础，表明以CXCR7为靶点进行基因治疗具有潜在的可行性。综上所述，CXCR7在结肠癌组织和细胞系中高表达，且其表达水平与肿瘤的淋巴结转移和分化程度密切相关，提示CXCR7可能是结肠癌发生发展过程中的一个重要促进因子，有望成为结肠癌