肿瘤微环境免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略

肿瘤微环境免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略演讲人01肿瘤微环境免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略肿瘤微环境免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略在肿瘤免疫治疗的浪潮中，免疫检查点抑制剂（ICIs）的问世为部分患者带来了长期缓解的曙光，但临床实践表明，多数患者仍面临原发或继发性耐药。深入研究发现，肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的“耗竭”（exhaustion）是导致抗肿瘤免疫应答失败的核心机制之一。作为长期暴露于慢性抗原刺激和抑制性信号的免疫细胞，耗竭的T细胞（尤其是CD8+T细胞）会逐渐丧失效应功能，表现为细胞因子分泌减少、增殖能力下降、表面抑制性受体表达上调，最终成为肿瘤免疫逃逸的“帮凶”。在实验室里，我曾见过这样的场景：将肿瘤浸润的CD8+T细胞分离培养，即使去除肿瘤细胞，这些T细胞的杀伤活性仍难以恢复——这正是耗竭的“不可逆性”特征。然而，随着对耗竭机制和标志物的深入研究，逆转免疫细胞耗竭已成为提升肿瘤免疫治疗效果的关键突破口。本文将从免疫细胞耗竭的分子特征出发，系统梳理当前针对耗竭标志物的逆转治疗策略，并探讨其挑战与未来方向。肿瘤微环境免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略1免疫细胞耗竭的定义、分子机制与核心标志物021免疫细胞耗竭的定义与动态特征1免疫细胞耗竭的定义与动态特征免疫细胞耗竭是T细胞在慢性抗原刺激（如持续病毒感染或肿瘤）下发生的渐进性功能耗损过程，不同于初始活化的“耗尽”（anergy）或活化诱导的细胞死亡（AICD），其核心特征是“功能异质性”和“可逆性窗口”。根据功能状态，耗竭T细胞可分为三个阶段：早期耗竭（PD-1hiTIM-3-）仍保留部分增殖和效应功能；中期耗竭（PD-1hiTIM-3hi）出现细胞因子分泌缺陷；晚期耗竭（PD-1hiTIM-3hiLAG-3hi）则完全丧失效应能力，且高表达多个抑制性受体。值得注意的是，耗竭并非“终点”——在早期阶段，通过干预抑制性信号，T细胞功能有望部分恢复；而晚期耗竭因表观遗传修饰的稳定化，逆转难度显著增加。这一动态特征提示我们：逆转耗竭的关键在于“早期识别”和“多靶点干预”。032免疫细胞耗竭的分子机制2免疫细胞耗竭的分子机制耗竭的发生是多因素协同作用的结果，涉及信号通路紊乱、表观遗传修饰异常、代谢重编程三个层面：2.1抑制性信号通路的持续激活慢性抗原刺激（如肿瘤抗原持续存在）会通过T细胞受体（TCR）和共刺激分子（如CD28）传递活化信号，同时激活抑制性受体通路，形成“踩刹车”与“踩油门”的失衡。其中，PD-1/PD-L1通路是核心：PD-1与PD-L1结合后，其胞内免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）被磷酸化，招募SHP-2磷酸酶，抑制TCR信号通路中的ZAP70、PKCθ等关键分子，阻断IL-2产生和细胞周期进程。除PD-1外，TIM-3（结合Galectin-9）、LAG-3（结合MHC-II）、TIGIT（结合CD155）等抑制性受体也会通过类似机制抑制T细胞功能，且这些受体常“共表达”于耗竭T细胞表面，形成“抑制性受体网络”。2.2表观遗传修饰的稳定化耗竭的“不可逆性”很大程度上源于表观遗传的改变。研究表明，耗竭T细胞中，抑制性基因（如PDCD1、HAVCR2/TIM-3、LAG-3）的启动子区域会出现组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）和DNA甲基化，导致这些基因“永久性”高表达；同时，效应基因（如IFNG、TNF、GZMB）的启动子则被组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）和乙酰化（H3K27ac）清除，形成“转录沉默”。更关键的是，这些表观遗传修饰会通过DNA甲基转移酶（DNMTs）、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）等“维持酶”稳定传递，即使在抑制性信号解除后，耗竭状态仍难以逆转。2.3代谢重编程与线粒体功能障碍初始T细胞活化后以有氧糖酵解为主，而耗竭T细胞则出现“代谢崩溃”：糖酵解关键酶（如HK2、PKM2）表达下调，糖酵解产物无法进入三羧酸循环（TCA），导致ATP生成不足；同时，脂肪酸氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS）也因线粒体功能障碍（如mtDNA减少、膜电位降低）而受限。代谢紊乱进一步加剧功能耗竭——例如，TCA循环中间产物α-酮戊二酸（α-KG）的缺乏会抑制表观遗传调控酶TET家族，使抑制性基因的甲基化水平难以降低；而乳酸积累则通过抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs），进一步沉默效应基因。043免疫细胞耗竭的核心标志物3免疫细胞耗竭的核心标志物基于上述机制，免疫细胞耗竭的标志物可分为“表面标志物”“转录因子标志物”和“功能标志物”三类，这三类标志物的联合检测是识别耗竭状态、评估逆转效果的关键：3.1表面标志物：抑制性受体的动态组合1-PD-1（CD279）：最经典的耗竭标志物，在早期耗竭即开始高表达，但其特异性不足（活化的T细胞也表达PD-1）。2-TIM-3（HAVCR2）：与PD-1共表达时提示中度至重度耗竭，其配体Galectin-9可诱导T细胞凋亡。3-LAG-3（CD223）：高表达于晚期耗竭T细胞，通过结合MHC-II干扰抗原呈递，抑制T细胞活化。4-TIGIT（VSIG9）：在耗竭T细胞与调节性T细胞（Treg）中均高表达，通过竞争结合CD155阻断共刺激信号。5-CD39/CD73：外切酶复合物，将ATP转化为腺苷，通过腺苷A2A受体抑制T细胞功能，是耗竭T细胞的“代谢标志物”。3.1表面标志物：抑制性受体的动态组合临床意义：联合检测多个抑制性受体（如PD-1+TIM-3+LAG-3）可更精准地识别耗竭T细胞，例如“三阳性”T细胞在黑色素瘤患者外周血中的比例与ICIs治疗响应率呈负相关。3.2转录因子标志物：耗竭的“调控核心”-TOX：耗竭的关键转录因子，由TCR信号和PD-1通路诱导表达，通过抑制T-bet（Th1细胞关键转录因子）和促进Eomesodermin（Eomes）表达，驱动耗竭程序。敲除TOX可逆转耗竭T细胞的表观遗传状态，恢复效应功能。-NR4A家族（NR4A1/Nur77、NR4A2/Nurr1、NR4A3/Nor1）：被慢性抗原刺激诱导，通过抑制IL-2信号和促进抑制性受体表达，维持耗竭状态。NR4A1缺失的T细胞在肿瘤中浸润增加且功能更强。-TCF1（TCF7）：耗竭T细胞的“干细胞样”标志物，高表达于早期耗竭T细胞，维持其自我更新和可逆性潜力。TCF1+耗竭T细胞是ICIs治疗响应的关键细胞亚群，其缺失与原发耐药相关。3.2转录因子标志物：耗竭的“调控核心”临床意义：检测TOX、NR4A1等转录因子的表达水平，可预测耗竭的“可逆性”——例如，TCF1高表达的肿瘤浸润T细胞（TILs）在PD-1抑制剂治疗后更易恢复功能。3.3功能标志物：效应能力的直接体现-细胞因子分泌：IFN-γ、TNF-α、IL-2是CD8+T细胞效应功能的核心指标，耗竭T细胞分泌的细胞因子数量显著减少，且分泌模式从“多因子联合分泌”变为“单因子低水平分泌”。-细胞毒性颗粒酶：颗粒酶B（GzmB）、穿孔素（PRF1）的表达水平反映T细胞的直接杀伤能力，耗竭T细胞中GzmB和PRF1的mRNA和蛋白水平均显著降低。-增殖能力：Ki-67（细胞增殖标志物）阳性率低是耗竭T细胞的特征之一，其与TCR信号强度和IL-2敏感性下降相关。临床意义：通过流式细胞术检测TILs的IFN-γ+TNF-α+IL-2+“三阳性”比例和Ki-67表达，可评估肿瘤免疫微环境的“功能状态”，是预测免疫治疗效果的重要生物标志物。3.3功能标志物：效应能力的直接体现免疫细胞耗竭标志物的逆转治疗策略基于对耗竭机制和标志物的深入理解，近年来多种“逆转耗竭”策略应运而生，其核心逻辑是“阻断抑制性信号、恢复表观遗传平衡、重编程代谢微环境”，从而恢复T细胞的抗肿瘤功能。这些策略可归纳为以下六类：051免疫检查点抑制剂的联合应用：打破“抑制性受体网络”1免疫检查点抑制剂的联合应用：打破“抑制性受体网络”免疫检查点抑制剂是当前逆转耗竭最成熟的策略，但单药治疗常因抑制性受体的“代偿性上调”而疗效有限。因此，“多靶点联合阻断”成为克服耐药的关键方向：1.1PD-1/PD-L1抑制剂联合CTLA-4抑制剂CTLA-4是T细胞活化早期的抑制性受体，主要表达于初始T细胞和Treg细胞，通过竞争结合CD80/CD86抑制T细胞活化。PD-1抑制剂（如帕博利珠单抗）靶向T细胞效应阶段的抑制信号，CTLA-4抑制剂（如伊匹木单抗）则靶向T细胞活化阶段的抑制信号，二者联合可形成“全程阻断”。CheckMate067研究显示，联合治疗在晚期黑色素瘤中的客观缓解率（ORR）达57%，中位总生存期（OS）达72.1个月，显著优于单药治疗。然而，联合治疗也增加了免疫相关不良反应（irAEs）风险（如3-4级irAEs发生率达55%），提示需通过生物标志物筛选优势人群。1.1PD-1/PD-L1抑制剂联合CTLA-4抑制剂2.1.2PD-1抑制剂联合TIM-3/LAG-3/TIGIT抑制剂针对PD-1抑制剂的继发耐药（常伴随TIM-3、LAG-3等抑制性受体的高表达），靶向第二抑制性受体的联合策略显示出潜力：-抗TIM-3抗体（如sabalinuxatamab）联合PD-1抑制剂：I期临床试验显示，在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，联合治疗的ORR达25%，且TIM-3高表达患者响应率更高。-抗LAG-3抗体（如relatlimab）联合PD-1抑制剂：RELATIVITY-047研究证实，联合治疗在晚期黑色素瘤中的中位无进展生存期（PFS）达10.1个月，显著优于PD-1单抗的4.6个月，该方案已获FDA批准。1.1PD-1/PD-L1抑制剂联合CTLA-4抑制剂-抗TIGIT抗体（如tiragolumab）联合PD-1抑制剂：SKYSCRAPER-02研究在NSCLC中显示，联合治疗的中位PFS为8.3个月，较安慰剂联合PD-1延长2.1个月，但总生存期获益未达统计学差异，提示需进一步优化患者选择。挑战与思考：多靶点联合虽可提高疗效，但如何平衡疗效与毒性？通过单细胞测序分析耗竭T细胞的“受体共表达谱”，识别“主要抑制性受体”，可能实现“精准联合”——例如，对TIM-3高表达患者优先选择抗TIM-3联合PD-1抑制剂。1.3双特异性抗体的“桥接”作用双特异性抗体（BsAb）可同时靶向肿瘤抗原（如HER2、EGFR）和T细胞活化分子（如CD3），或靶向抑制性受体（如PD-1）和共刺激分子（如CD28），实现“靶向激活”和“阻断抑制”的双重功能。例如：-CD3×PD-L1双抗（如cadonilimab）：通过阻断PD-L1与PD-1的结合，同时激活CD3信号，逆转耗竭T细胞的抑制状态。I期研究显示，在晚期实体瘤中，ORR达31%，且安全性优于PD-1抑制剂联合CTLA-4抑制剂。-TIGIT×PD-L1双抗（如orelimab）：同时阻断TIGIT和PD-L1通路，在淋巴瘤中显示出初步疗效，ORR达40%。优势：双抗的“桥接”作用可使T细胞直接靶向肿瘤，避免系统性激活导致的irAEs，是未来联合治疗的重要方向。062表观遗传修饰剂的应用：恢复耗竭T细胞的“转录可塑性”2表观遗传修饰剂的应用：恢复耗竭T细胞的“转录可塑性”耗竭T细胞的表观遗传稳定化是逆转困难的核心原因，因此表观遗传修饰剂（如HDAC抑制剂、DNMT抑制剂、EZH2抑制剂）可通过“打开”效应基因、“关闭”抑制性基因，恢复T细胞的转录可塑性：2.1组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）HDACs通过去除组蛋白乙酰基，导致染色质压缩和基因沉默。HDACi（如伏立诺他、帕比司他）可增加组蛋白乙酰化，开放染色质结构，促进效应基因（如IFNG、TNF）表达。临床前研究显示，HDACi联合PD-1抑制剂可显著增加肿瘤浸润CD8+T细胞的IFN-γ分泌和细胞毒性，抑制肿瘤生长。I期临床试验（NCT02093361）显示，vorinostat联合帕博利珠单抗在晚期NSCLC中ORR达15%，且T细胞表观遗传标志物（如H3K27ac水平）显著升高。2.2DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTi）DNMTs通过甲基化DNA沉默基因表达。DNMTi（如阿扎胞苷、地西他滨）可抑制DNA甲基化，重新激活效应基因。例如，azacitidine可耗竭Treg细胞，同时增强CD8+T细胞的IFN-γ分泌和肿瘤杀伤能力。I期研究（NCT03404960）显示，地西他滨联合nivolumab在晚期实体瘤中ORR达22%，且PD-L1低表达患者响应率更高。2.3EZH2抑制剂EZH2是H3K27me3的催化酶，可沉默效应基因。EZH2抑制剂（如tazemetostat）通过降低H3K27me3水平，恢复T细胞的效应功能。临床前研究表明，tazemetostat联合PD-1抑制剂可显著抑制淋巴瘤生长，且CD8+T细胞的IFN-γ和颗粒酶B表达上调。挑战与思考：表观遗传修饰剂的“非特异性”是其主要局限——它们不仅作用于T细胞，还会影响肿瘤细胞和其他免疫细胞，导致潜在毒性。开发“T细胞靶向”的表观遗传修饰剂（如纳米颗粒递送系统），是提高安全性的关键方向。073代谢微环境的调控：逆转耗竭T细胞的“代谢崩溃”3代谢微环境的调控：逆转耗竭T细胞的“代谢崩溃”代谢重编程是耗竭T细胞功能丧失的核心机制之一，因此通过调节代谢通路（如糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢），可恢复T细胞的能量供应和效应功能：3.1糖代谢重编程耗竭T细胞的糖酵解和TCA循环受阻，因此“增强糖酵解”或“补充TCA中间产物”是潜在策略：-PI3K/AKT/mTOR通路激活剂：该通路是糖酵解的关键调控者，激活后可上调GLUT1（葡萄糖转运蛋白）和HK2（己糖激酶2），促进葡萄糖摄取和糖酵解。例如，IL-7可通过激活PI3K/AKT通路，逆转耗竭T细胞的代谢缺陷，增强其抗肿瘤活性。-二氯乙酸（DCA）：抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK），促进丙酮酸进入TCA循环，增加ATP生成。临床前研究显示，DCA联合PD-1抑制剂可显著改善耗竭T细胞的线粒体功能，抑制肿瘤生长。3.2脂肪酸氧化（FAO）抑制剂耗竭T细胞的FAO过度激活，导致能量消耗和氧化应激增加。FAO抑制剂（如etomoxir）可通过抑制CPT1（肉碱棕榈酰转移酶1），阻断脂肪酸进入线粒体，逆转耗竭状态。临床前研究表明，etomoxir联合PD-1抑制剂可显著增加肿瘤浸润CD8+T细胞的IFN-γ分泌，延长生存期。3.3氨基酸代谢调节-精氨酸补充：精氨酸是NO和多胺合成的底物，耗竭T细胞中精氨酸酶1（ARG1）高表达（由肿瘤相关巨噬细胞TAMs分泌），消耗精氨酸，导致T细胞功能障碍。补充L-精氨酸可恢复T细胞的增殖和效应功能。-色氨酸代谢调节：吲胺-2,3-双加氧酶（IDO）将色氨酸转化为犬尿氨酸，抑制T细胞活化。IDO抑制剂（如epacadostat）联合PD-1抑制剂在I期研究中显示出初步疗效，但III期（ECHO-301）未达主要终点，提示需进一步探索生物标志物（如IDO高表达患者）。挑战与思考：肿瘤微环境的代谢异质性（如不同肿瘤、不同部位的代谢特征差异）是代谢调控的主要障碍。通过代谢组学技术分析肿瘤浸润T细胞的代谢特征，实现“个体化代谢干预”，是未来方向。084细胞因子网络的再平衡：增强T细胞的“生存与活化信号”4细胞因子网络的再平衡：增强T细胞的“生存与活化信号”细胞因子是调节T细胞功能的关键介质，通过补充促炎性细胞因子或中和抑制性细胞因子，可逆转耗竭T细胞的抑制状态：4.1IL-2及其改良版本IL-2是T细胞存活和增殖的关键因子，但天然IL-2易激活Treg细胞（高表达CD25），抑制抗肿瘤免疫。因此，“IL-2改良版”成为研究热点：-长效IL-2（NKTR-214）：聚乙二醇化IL-2，优先激活效应T细胞（CD25中等表达）而非Treg细胞（CD25高表达）。I期研究显示，联合PD-1抑制剂在晚期实体瘤中ORR达29%，且Treg/Teff比例降低。-IL-2突变体（例如“免疫细胞选择性IL-2”，IL-2v）：通过突变IL-2的α链结合位点，降低与CD25的亲和力，选择性激活效应T细胞。临床前研究显示，IL-2v联合PD-1抑制剂可显著增强抗肿瘤活性，且Treg细胞扩增减少。4.2IL-7和IL-15-IL-7：促进T细胞存活和增殖，减少凋亡。临床前研究表明，IL-7可逆转耗竭T细胞的PD-1高表达，恢复IFN-γ分泌。I期研究（NCT00740913）显示，IL-7在晚期实体瘤中安全且可增加T细胞数量。-IL-15：促进CD8+T细胞和NK细胞的活化与增殖。改良版IL-15（如N-803，IL-15N72D/IL-15Rα-Fc融合蛋白）在I期研究中显示出良好疗效，OR达33%，且与PD-1抑制剂联合可进一步提高响应率。4.3中和抑制性细胞因子-TGF-β抑制剂：TGF-β是免疫抑制性细胞因子，诱导Treg细胞分化，抑制CD8+T细胞功能。TGF-β中和抗体（如fresolimumab）联合PD-1抑制剂在I期研究中显示出初步疗效，ORR达21%。-IL-10抑制剂：IL-10抑制抗原呈递细胞（APC）的功能，促进Treg细胞分化。抗IL-10抗体（如clidolimab）联合PD-1抑制剂在晚期黑色素瘤中ORR达17%。挑战与思考：细胞因子的“全身性激活”易导致严重毒性（如IL-2的毛细血管渗漏综合征）。开发“局部递送系统”（如肿瘤靶向的细胞因子纳米颗粒），是提高安全性的关键。123095细胞治疗策略的优化：生成“耗竭抵抗型”T细胞5细胞治疗策略的优化：生成“耗竭抵抗型”T细胞过继性细胞治疗（ACT），如肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）治疗和CAR-T细胞治疗，是逆转耗竭的“主动”策略，但肿瘤微环境的抑制性信号仍可导致回输T细胞的功能耗竭。因此，优化细胞治疗策略，生成“耗竭抵抗型”T细胞，是当前研究热点：5.1TIL治疗的改进-选择“干细胞样”TILs：TCF1+、干性标志物（如CD62L、CCR7）高表达的TILs具有更强的自我更新和分化能力，是ACT的理想细胞来源。临床研究表明，输注TCF1+TILs的患者，无进展生存期显著延长。-体外扩增中添加表观遗传修饰剂：在TILs扩增过程中添加HDACi或DNMTi，可逆转其耗竭状态，增强效应功能。例如，vorinostat预处理的TILs在回输后，肿瘤浸润能力和IFN-γ分泌显著增加。5.2CAR-T细胞的“耗竭抵抗”改造-敲除抑制性受体：通过CRISPR/Cas9技术敲除CAR-T细胞的PD-1、TIM-3等抑制性受体，可增强其在肿瘤微环境中的持久性。例如，PD-1敲除的CAR-T细胞在实体瘤模型中显示出更强的抗肿瘤活性。-共表达共刺激分子：在CAR结构中共表达4-1BB或CD28等共刺激分子，可增强CAR-T细胞的活化信号，抵抗耗竭。例如，4-1BB共刺激的CAR-T细胞在血液肿瘤中显示出更持久的疗效。-表达细胞因子：将IL-7、IL-15等细胞因子基因导入CAR-T细胞，可提供“自分泌”活化信号，改善其存活和功能。例如，IL-15基因修饰的CAR-T细胞在实体瘤模型中浸润显著增加。5.2CAR-T细胞的“耗竭抵抗”改造挑战与思考：CAR-T细胞在实体瘤中的耗竭问题仍未完全解决——肿瘤微环境的物理屏障（如纤维化）、免疫抑制细胞（如TAMs、MDSCs）仍可抑制CAR-T细胞功能。开发“多靶点CAR-T”（如同时靶向肿瘤抗原和免疫抑制细胞）或“armoredCAR-T”（表达免疫调节分子），是未来方向。106其他新兴策略：靶向耗竭微环境的“非免疫细胞”6其他新兴策略：靶向耗竭微环境的“非免疫细胞”除了直接作用于T细胞，靶向肿瘤微环境中的非免疫细胞（如肿瘤相关成纤维细胞CAFs、肿瘤相关巨噬细胞TAMs、髓系来源抑制细胞MDSCs），可间接逆转耗竭T细胞的抑制状态：6.1靶向CAFsCAFs通过分泌TGF-β、IL-6、CXCL12等因子，抑制T细胞浸润和功能。靶向CAFs的策略包括：-抑制CAFs活化：通过阻断TGF-β信号（如galunisertib）或FAP（成纤维细胞激活蛋白）抗体，减少CAFs的免疫抑制因子分泌。-重编程CAFs：将“抑制性CAFs”转化为“支持性CAFs”（如通过Wnt信号激活），促进T细胞浸润。6.2重极化TAMsTAMs可分为M1型（抗肿瘤）和M2型（免疫抑制），M2型TAMs通过分泌IL-10、TGF-β和精氨酸酶1，抑制T细胞功能。CSF-1R抑制剂（如pexidartinib）可减少M2型TAMs的浸润，联合PD-1抑制剂在晚期实体瘤中显示出初步疗效（ORR达18%）。6.3清除MDSCsMDSCs通过产生活性氧（ROS）、精氨酸酶1和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），抑制T细胞活化。磷酸二酯酶-5抑制剂（如西地那非）可减少MDSCs的积累，联合PD-1抑制剂在晚期黑色素瘤中ORR达25%。6.3清除MDSCs逆转治疗的挑战与未来方向尽管针对免疫细胞耗竭标志物的逆转策略已取得显著进展，但临床转化仍面临多重挑战：111耗竭异质性与患者个体化差异1耗竭异质性与患者个体化差异不同肿瘤（如血液肿瘤vs实体瘤）、不同患者（如PD-L1表达状态、肿瘤突变负荷TMB）、甚至同一肿瘤的不同区域，耗竭T细胞的标志物表达和分子机制均存在显著差异。例如，黑色素