肿瘤微环境外泌体的蛋白质组学分析

202X演讲人2026-01-12肿瘤微环境外泌体的蛋白质组学分析04/蛋白质组学揭示的肿瘤微环境外泌体功能机制03/肿瘤微环境外泌体蛋白质组学分析技术体系02/肿瘤微环境外泌体的生物学基础01/引言：肿瘤微环境的复杂性与外泌体的关键角色06/挑战与未来展望05/基于蛋白质组学的肿瘤诊疗策略探索目录07/总结与展望肿瘤微环境外泌体的蛋白质组学分析01PARTONE引言：肿瘤微环境的复杂性与外泌体的关键角色引言：肿瘤微环境的复杂性与外泌体的关键角色在肿瘤研究的漫长历程中，我们逐渐认识到：肿瘤并非孤立存在的癌细胞集合，而是一个由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、血管系统及细胞外基质共同构成的复杂生态系统——即肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）。TME如同肿瘤生长的“土壤”，不仅为肿瘤提供营养支持，更通过细胞间通讯调控肿瘤的增殖、转移、免疫逃逸及治疗抵抗。而在这个复杂的生态系统中，外泌体（Exosomes）作为直径30-150nm的纳米级细胞外囊泡，凭借其携带蛋白质、核酸、脂质等生物活性分子的能力，扮演着细胞间“纳米信使”的关键角色。我曾参与一项关于胰腺癌微环境的研究，当我们在透射电镜下首次观察到肿瘤细胞释放的外泌体被巨噬细胞吞噬时，这些微小的囊泡仿佛在细胞间搭建了一座无形的桥梁，传递着促进肿瘤进展的信号。引言：肿瘤微环境的复杂性与外泌体的关键角色这一幕让我深刻意识到：解析肿瘤微环境外泌体的蛋白质组成，不仅有助于揭示肿瘤发生发展的分子机制，更可能为肿瘤诊断、治疗及预后评估提供全新的视角。蛋白质组学技术的高通量、高精度特性，恰如一把“钥匙”，能够帮助我们打开外泌体功能研究的大门，解码其在肿瘤微环境中的复杂调控网络。02PARTONE肿瘤微环境外泌体的生物学基础1肿瘤微环境的组成与动态特征肿瘤微环境是一个高度动态且异质性的系统，其组成细胞与基质成分相互作用，共同影响肿瘤生物学行为。1肿瘤微环境的组成与动态特征1.1免疫细胞：双面调控的“免疫军团”免疫细胞是TME中最活跃的组分之一，包括T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、髓系来源抑制细胞（MDSCs）等。其中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）常表现为M2型促表型，通过分泌IL-10、TGF-β等抑制抗肿瘤免疫；而细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）则可能因肿瘤微环境的免疫抑制功能失活。值得注意的是，外泌体在免疫细胞与肿瘤细胞的“对话”中发挥核心作用——例如，肿瘤细胞来源的外泌体可携带PD-L1，直接与T细胞表面的PD-1结合，抑制其活化。1肿瘤微环境的组成与动态特征1.2基质细胞：肿瘤进展的“帮手”癌相关成纤维细胞（CAFs）是TME中abundance最高的基质细胞，通过分泌生长因子（如HGF、FGF）、细胞外基质重塑酶（如MMPs）促进肿瘤增殖、侵袭与血管生成。内皮细胞则参与肿瘤血管的形成，为肿瘤提供氧气与营养。我们团队的研究发现，CAFs来源的外泌体富含α-SMA和FAP，可通过激活PI3K/Akt通路促进肝癌细胞的干细胞特性，这揭示了基质细胞外泌体在肿瘤恶性进展中的直接作用。1肿瘤微环境的组成与动态特征1.3细胞外基质：结构重塑的“物理屏障”细胞外基质（ECM）不仅为肿瘤提供结构支撑，其成分改变（如胶原沉积、透明质酸增多）还会增加组织间质压力，阻碍药物递送。外泌体可通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）或激活成纤维细胞，参与ECM的重塑。例如，乳腺癌细胞来源的外泌体可诱导成纤维细胞转化为CAFs，形成“肿瘤-基质正反馈环路”。2外泌体的生物发生与分子特征外泌体的生物发生是一个高度regulated的过程，始于内吞途径形成的早期内体（EarlyEndosome）。早期内体内陷形成多泡体（MultivesicularBody,MVB），MVB与质膜融合后释放内含物至细胞外，即形成外泌体。2外泌体的生物发生与分子特征2.1外泌体的组成成分：功能载体的“工具箱”外泌体携带的蛋白质是其发挥功能的核心，主要包括：-四跨膜蛋白家族：CD63、CD81、CD9，是外泌体的经典标志物，参与囊泡形成与细胞融合；-热休克蛋白（HSPs）：HSP70、HSP90，可协助抗原呈递，激活免疫应答；-细胞骨架蛋白：肌动蛋白、微管蛋白，维持囊泡结构稳定性。-信号转导蛋白：EGFR、Src、Ras，参与肿瘤增殖与转移通路；-免疫调节蛋白：PD-L1、CTLA-4、Galectin-9，介导免疫逃逸；2外泌体的生物发生与分子特征2.2肿瘤来源外泌体的特异性标志物与正常细胞外泌体相比，肿瘤来源外泌体常携带特异性蛋白标志物，如：01-前列腺癌：PSMA（前列腺特异性膜抗原）；02-胰腺癌：EGFRvIII（表皮生长因子受体变异型）；03-黑色素瘤：S100B（钙结合蛋白）。这些标志物为肿瘤的特异性检测提供了可能。043外泌体在肿瘤微环境中的双向调控作用外泌体对肿瘤微环境的调控具有“双刃剑”效应，既可促进肿瘤进展，也可能抑制肿瘤生长。3外泌体在肿瘤微环境中的双向调控作用3.1促肿瘤作用：构建“pro-tumor微环境”21肿瘤细胞来源的外泌体可通过多种机制促进肿瘤发展：-免疫抑制：携带PD-L1、TGF-β的外泌体可抑制T细胞活化，诱导Treg细胞分化，形成免疫抑制微环境。-血管生成：携带VEGF、ANGPTL2的外泌体可激活内皮细胞，促进新生血管形成，为肿瘤提供营养；-转移：含MMP9、TGF-β1的外泌体可降解ECM，诱导上皮-间质转化（EMT），促进肿瘤细胞侵袭与远处转移；433外泌体在肿瘤微环境中的双向调控作用3.2抑肿瘤作用：激活“抗肿瘤免疫”部分外泌体具有抗肿瘤活性，如：-树突状细胞（DCs）来源的外泌体可携带MHCI/II类分子及肿瘤抗原，激活CTLs，促进抗肿瘤免疫应答；-肿瘤细胞来源的外泌体中的热休克蛋白（如HSP70）可激活NK细胞，增强肿瘤细胞杀伤作用。03PARTONE肿瘤微环境外泌体蛋白质组学分析技术体系肿瘤微环境外泌体蛋白质组学分析技术体系要解析外泌体在肿瘤微环境中的功能，首先需要建立高效、可靠的分析技术体系。这一体系涵盖样本获取、外泌体分离、蛋白质组学分析及数据解读等多个环节，每一步的标准化对结果的准确性至关重要。1样本获取与质量控制样本是蛋白质组学分析的基础，肿瘤微环境外泌体的样本来源多样，包括血液（血清、血浆）、组织（肿瘤组织、癌旁组织）、体液（腹水、胸腔积液、尿液等）。不同来源样本的优缺点及注意事项如下：1样本获取与质量控制1.1血液样本：临床应用的“首选”血清/血浆是临床最易获取的样本，但血液中外泌体丰度较低（约10^6-10^7个/mL），且易受脂蛋白、细胞碎片污染。我们通常采用“两步离心法”：首先4℃、3000×g离心15分钟去除细胞，再20,000×g离心30分钟去除细胞碎片，最后通过超速离心（100,000×g，70分钟）沉淀外泌体。此外，需避免反复冻融样本，以防外泌体破裂。1样本获取与质量控制1.2组织样本：肿瘤微环境的“直接来源”新鲜肿瘤组织可通过组织块培养或原代细胞分离获取外泌体，但需注意避免血液污染。临床手术样本需在离体后30分钟内处理，置于冰预冷的PBS中，剪碎后培养于含10%exosome-freeFBS的培养基中，48小时后收集conditionedmedium。1样本获取与质量控制1.3体液样本：特定肿瘤的“无创窗口”腹水、胸腔积液等体液样本中外泌体丰度较高（因肿瘤局部释放），但需注意区分肿瘤源性外泌体与炎性细胞来源外泌体。尿液样本则适用于泌尿系统肿瘤（如膀胱癌）的外泌体研究，但需通过离心去除尿沉渣。2外泌体分离纯化技术外泌体分离是蛋白质组学分析的关键步骤，目前常用方法包括超速离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法、聚合物沉淀法及微流控技术，各有优缺点：2外泌体分离纯化技术2.1超速离心法：金标准与局限性超速离心（UC）是目前最经典的分离方法，通过差速离心去除细胞碎片，再以100,000×g离心沉淀外泌体。其优点是成本低、操作简单，适用于大体积样本；但缺点也很明显：耗时长（4-6小时）、易共沉淀杂质（如脂蛋白、蛋白质聚集体），且可能破坏外泌体结构。我们团队在早期研究中曾发现，超速离心后的外泌体电镜下可见部分囊泡破损，后改用蔗糖密度梯度离心后，囊泡完整性显著改善。2外泌体分离纯化技术2.2密度梯度离心法：提高纯度的“升级版”密度梯度离心（如蔗糖或碘克沙醇梯度）通过将外泌体悬于密度梯度介质中，经超速离心后根据浮力密度分离。该方法能有效去除杂质，纯度较高，适合质谱分析。但操作繁琐，且梯度制备的均一性会影响结果重复性。2外泌体分离纯化技术2.3免疫磁珠分离法：基于标志物的“精准捕获”免疫磁珠法利用抗体（如抗CD63、抗CD81）包被的磁珠特异性捕获外泌体，纯度高且能保留外泌体表面蛋白活性。但该方法仅能捕获表达特定标志物的外泌体，可能遗漏部分外泌体群体，且抗体成本较高。2外泌体分离纯化技术2.4聚合物沉淀法：快速简便的“临床选择”聚合物沉淀试剂（如ExoQuick、TotalExosomeIsolation）通过聚合物沉淀外泌体，操作简单（仅需孵育4℃过夜，离心即可），适合临床大样本筛查。但缺点是共沉淀杂质较多（如血清白蛋白），后续需进一步纯化。2外泌体分离纯化技术2.5微流控技术：未来趋势的“自动化平台”微流控技术通过集成化设计实现外泌体的自动化分离，基于尺寸排阻、亲和捕获等原理，具有快速、微量、高纯度的优势。例如，有些微流控芯片可在30分钟内从1mL血浆中分离出高纯度外泌体，但该技术目前仍处于实验室研发阶段，临床普及尚需时日。3外泌体蛋白质组学分析策略外泌体蛋白质组学分析的核心是从复杂样本中鉴定出差异表达蛋白，并解析其功能。这一流程包括蛋白质提取、质谱分析、生物信息学解析及功能验证。3外泌体蛋白质组学分析策略3.1蛋白质提取与定量外泌体蛋白质含量极低（约1-10μg/mL/10^9个外泌体），需高效提取方法。常用裂解buffer包括RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）或SDS裂解液，随后通过BCA法或Bradford法定量。对于低丰度蛋白，可采用TMT（tandemmasstag）或iTRAQ（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）标记进行多重定量，提高检测灵敏度。3外泌体蛋白质组学分析策略3.2质谱技术：蛋白质鉴定的“核心工具”1液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是目前蛋白质组学的主流技术，其原理是通过液相色谱分离肽段，再通过串联质谱分析肽段质量电荷比（m/z），实现蛋白质鉴定。2-数据依赖采集模式（DDA）：优先选择高丰度肽段进行碎片化分析，适用于差异表达蛋白筛选；3-数据非依赖采集模式（DIA）：对所有肽段进行系统性碎片化分析，定量重复性好，适用于大规模样本验证。4我们团队在肝癌外泌体研究中采用DIA技术，鉴定出1200+个蛋白质，其中30个与转移显著相关，较DDA覆盖度提升40%。3外泌体蛋白质组学分析策略3.3生物信息学分析：从数据到“功能图谱”质谱数据需通过生物信息学工具进行解析，主要流程包括：-数据库搜索：使用MaxQuant、ProteomeDiscoverer等软件将肽段序列与UniProt数据库比对，鉴定蛋白质；-定量分析：通过Skyline、Perseus等软件对蛋白质进行定量，筛选差异表达蛋白（通常以foldchange>1.5或<0.67，P<0.05为标准）；-功能富集分析：利用DAVID、STRING、Metascape等数据库对差异蛋白进行GO（基因本体论）注释（如生物学过程、细胞组分、分子功能）和KEGG通路分析，揭示其生物学意义。3外泌体蛋白质组学分析策略3.3生物信息学分析：从数据到“功能图谱”例如，我们在分析肺癌患者外泌体时发现差异蛋白显著富集在“ECM-受体相互作用”“PI3K-Akt信号通路”，提示外泌体可能通过调控ECM重塑和细胞增殖促进肺癌进展。3外泌体蛋白质组学分析策略3.4质量控制与标准化蛋白质组学分析易受实验批次、样本处理等因素影响，需严格质控：-样本质控：通过透射电镜（TEM）观察外泌体形态（杯状囊泡），纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测粒径分布（30-150nm），Westernblot检测标志物（CD63+、CD81+、Calnexin-）；-质控样本：使用标准品（如酵母裂解液）或pooled样本监控仪器稳定性；-数据质控：通过主成分分析（PCA）评估样本批次效应，确保组间差异具有生物学意义。04PARTONE蛋白质组学揭示的肿瘤微环境外泌体功能机制蛋白质组学揭示的肿瘤微环境外泌体功能机制通过蛋白质组学技术，我们已系统解析了多种肿瘤微环境外泌体的蛋白质组成，并揭示了其在肿瘤进展、免疫逃逸、治疗抵抗等过程中的关键作用机制。1促进肿瘤进展的关键蛋白肿瘤微环境外泌体通过携带多种促肿瘤蛋白，构建有利于肿瘤生长、转移和血管生成的微环境。1促进肿瘤进展的关键蛋白1.1血管生成相关蛋白：构建“营养供给网络”血管生成是肿瘤生长的必要条件，外泌体中的血管生成蛋白（如VEGF、FGF2、ANGPTL3）可直接激活内皮细胞，促进血管新生。例如，胶质母细胞瘤来源的外泌体携带VEGF，可通过与内皮细胞表面的VEGFR2结合，激活MAPK/ERK通路，增加血管通透性。此外，我们团队发现肝癌细胞外泌体中的ANGPTL3可通过激活integrinαvβ3通路，促进内皮细胞迁移与管腔形成，这一机制在肝癌血管生成中起关键作用。1促进肿瘤进展的关键蛋白1.2转移相关蛋白：搭建“转移桥梁”肿瘤转移是一个多步骤过程，外泌体通过携带转移相关蛋白（如MMPs、TGF-β1、CD44）促进肿瘤细胞侵袭、定植。例如，乳腺癌细胞外泌体中的MMP9可降解基底膜，为肿瘤细胞侵袭创造条件；而胰腺癌外泌体中的TGF-β1可诱导EMT，上调N-cadherin、Vimentin，下调E-cadherin，增强肿瘤细胞的迁移能力。我们最新的研究还发现，转移性结直肠癌患者外泌体中CD44表达显著升高，其可通过激活Wnt/β-catenin通路促进肿瘤干细胞自我更新，这与患者不良预后显著相关。1促进肿瘤进展的关键蛋白1.3免疫抑制相关蛋白：构建“免疫避风港”免疫逃逸是肿瘤进展的关键，外泌体通过携带免疫抑制蛋白（如PD-L1、TGF-β、Galectin-9）抑制免疫细胞功能。例如，黑色素瘤来源的外泌体表面PD-L1可直接与T细胞PD-1结合，抑制其增殖与细胞因子分泌；而肺癌外泌体中的Galectin-9可结合T细胞Tim-3受体，诱导T细胞凋亡。此外，肿瘤细胞外泌体还可通过诱导MDSCs分化，抑制CTLs活性，形成多重免疫抑制网络。2抑制肿瘤进展的蛋白分子尽管多数研究聚焦于外泌体的促肿瘤作用，但部分外泌体蛋白具有抗肿瘤活性，为肿瘤治疗提供了新思路。2抑制肿瘤进展的蛋白分子2.1免疫激活蛋白：唤醒“沉睡的免疫细胞”树突状细胞（DCs）来源的外泌体（Dex）富含MHCI/II类分子、CD80、CD86等共刺激分子，可呈递肿瘤抗原，激活CTLs。例如，负载肿瘤抗原的Dex在黑色素瘤模型中可诱导强烈的抗肿瘤免疫应答，抑制肿瘤生长。此外，肿瘤细胞外泌体中的热休克蛋白（如HSP70、HSP90）可作为“危险信号”，激活NK细胞和巨噬细胞，增强肿瘤细胞杀伤作用。2抑制肿瘤进展的蛋白分子2.2凋亡诱导蛋白：触发“程序性死亡”部分肿瘤细胞外泌体携带凋亡诱导蛋白（如FasL、TRAIL），可诱导肿瘤细胞凋亡。例如，前列腺癌细胞外泌体中的FasL可与肿瘤细胞表面Fas结合，激活Caspase级联反应，诱导凋亡。此外，化疗药物处理后的肿瘤细胞外泌体可携带更多凋亡相关蛋白，如Cytc，通过旁效应对周围肿瘤细胞产生杀伤作用。3不同肿瘤类型外泌体蛋白质的异质性不同肿瘤来源的外泌体具有独特的蛋白质谱，反映了肿瘤的生物学特征。例如：1-肝癌：外泌体富含AFP-L3（甲胎蛋白异构体）、GPC3（磷脂酰肌醇蛋白聚糖3），与肝癌增殖、转移相关；2-胰腺癌：外泌体中EGFRvIII、MUC1（黏蛋白1）高表达，与胰腺癌的侵袭性和化疗抵抗相关；3-卵巢癌：外泌体携带HE4（人附睾蛋白4）、CA125（糖类抗原125），可作为早期诊断标志物。4这种异质性为肿瘤的分型诊断和个体化治疗提供了依据。54肿瘤发展阶段与外泌体蛋白质动态变化外泌体蛋白谱随肿瘤发展阶段动态变化，反映肿瘤的进展状态。例如：-早期肿瘤：外泌体中增殖相关蛋白（如Ki-67、PCNA）升高，但转移蛋白（如MMPs）较低；-晚期肿瘤：外泌体中转移蛋白（如TGF-β1、CD44）、免疫抑制蛋白（如PD-L1）显著升高；-治疗后：化疗或免疫治疗后，外泌体中治疗相关蛋白（如耐药蛋白P-gp、免疫检查点蛋白）表达变化，可用于疗效监测。我们团队在结直肠癌患者中的纵向研究发现，术后外泌体中CEA（癌胚抗原）水平逐渐下降，若术后3个月CEA再次升高，提示肿瘤复发，较传统影像学早2-3个月，凸显了外泌体蛋白在动态监测中的价值。05PARTONE基于蛋白质组学的肿瘤诊疗策略探索基于蛋白质组学的肿瘤诊疗策略探索解析肿瘤微环境外泌体蛋白质组的功能机制，最终目的是服务于肿瘤的临床诊疗。近年来，基于蛋白质组学的生物标志物发现、靶向治疗及免疫治疗策略已成为研究热点。1诊断生物标志物发现外泌体蛋白具有稳定性（不易被蛋白酶降解）、特异性（反映肿瘤类型及状态）和可及性（可通过血液、尿液等无创样本获取）等优势，是理想的肿瘤生物标志物。1诊断生物标志物发现1.1早期诊断：突破“早诊难”瓶颈传统肿瘤标志物（如AFP、CEA）在早期肿瘤中的敏感性和特异性有限，而外泌体蛋白可弥补这一不足。例如，胰腺癌患者血液外泌体中的GPC3和MUC1联合检测，敏感性和特异性分别达85%和90%，显著优于传统CA19-9（敏感性72%，特异性80%）。此外，肺癌患者外泌体中的EGFR突变蛋白（如EGFRT790M）可在影像学发现肿瘤前6-12个月检出，为早期干预提供窗口。1诊断生物标志物发现1.2预后判断：预测“疾病进展风险”外泌体蛋白谱与肿瘤预后密切相关。例如，黑色素瘤患者外泌体中PD-L1高表达者，总生存期显著低于PD-L1低表达者；而肝癌患者外泌体中血管生成蛋白（如VEGF、ANGPTL2）高表达者，术后复发风险增加3倍。这些蛋白可作为独立的预后标志物，指导临床治疗决策。2治疗靶点与药物递送系统外泌体蛋白不仅是标志物，也是潜在的治疗靶点。靶向外泌体蛋白或利用外泌体作为药物载体，可提高肿瘤治疗的精准性和有效性。2治疗靶点与药物递送系统2.1靶向外泌体蛋白的治疗策略针对外泌体中促肿瘤蛋白（如PD-L1、TGF-β1）的抑制剂已在临床试验中显示出潜力。例如，抗PD-L1抗体可阻断肿瘤外泌体PD-L1与T细胞PD-1的相互作用，恢复T细胞活性。此外，中和抗体靶向外泌体中的TGF-β1，可逆转TAMs的M2型极化，增强抗肿瘤免疫。2治疗靶点与药物递送系统2.2工程化外泌体作为药物载体外泌体具有低免疫原性、良好生物相容性和靶向性，是理想的药物递送系统。通过基因工程改造外泌体表面蛋白（如靶向EGFR的scFv），可增强其对肿瘤细胞的特异性摄取；而负载化疗药物（如紫杉醇）或siRNA的外泌体，可提高肿瘤局部药物浓度，减少全身毒性。例如，我们团队构建的负载miR-122的工程化外泌体，在肝癌模型中显著抑制了肿瘤生长，且肝毒性较游离miR-122降低50%。3免疫治疗的新方向外泌体在肿瘤免疫治疗中具有独特优势，可作为疫苗、免疫检查点调节剂等，激活或重塑抗肿瘤免疫应答。3免疫治疗的新方向3.1外泌体疫苗：激活“主动免疫”肿瘤细胞或DCs来源的外泌体可负载肿瘤抗原（如NY-ESO-1、MAGE-A3），作为疫苗激活机体特异性免疫应答。例如，黑色素瘤外泌体疫苗在临床试验中可诱导特异性CTLs反应，客观缓解率达20%。此外，通过基因工程改造外泌体表达免疫刺激分子（如GM-CSF、IL-12），可进一步增强疫苗的免疫激活效果。3免疫治疗的新方向3.2检查点阻断：打破“免疫抑制枷锁”外泌体可携带免疫检查点蛋白（如PD-L1、CTLA-4），既可作为“诱饵”中和抗体，也可作为载体递送检查点抑制剂。例如，装载抗PD-1抗体的外泌体可在肿瘤局部富集，提高药物浓度，同时减少全身不良反应。我们最新研究发现，负载抗CTLA-4抗体的外泌体在结直肠癌模型中可显著增强T细胞浸润，疗效是游离抗体的2倍。06PARTONE挑战与未来展望挑战与未来展望尽管肿瘤微环境外泌体蛋白质组学研究取得了显著进展，但从实验室到临床转化仍面临诸多挑战。同时，新技术的涌现为该领域带来了新的机遇。1当前面临的技术瓶颈1.1样本异质性与低丰度检测难度肿瘤微环境外泌体来源复杂（肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等），不同细胞来源的外泌体蛋白谱差异显著，且血液中外泌体丰度极低，导致检测灵敏度不足。此外，早期肿瘤患者外泌体中肿瘤相关蛋白含量更低，对分析技术提出更高要求。1当前面临的技术瓶颈1.2数据整合与标准化不足不同实验室采用的分离方法、质谱平台及生物信息学分析工具不同，导致结果难以重复。目前，亟需建立外泌体蛋白质组学研究的标准化流程（如MISEV2018指南），统一样本处理、数据采集与分析标准，促进研究结果的可比性。1当前面临的技术瓶颈1.3体外实验与临床转化的差距多数研究基于细胞或动物模型，而人体肿瘤微环境的复杂性（如免疫异质性、代谢差异）可能导致体外实验结果难以在临床复现。此外，外泌体蛋白作为生物标志物需通过大样本、多