多光谱切片分析系统

多光谱切片流式细胞分析系统真正实现组织切片的定量分析实现“高内涵”数据挖掘TRIO™多光谱成像系统Nuance™多光谱成像系统inForm™

-高级切片分析模块Vectra™智能组织切片分析系统多蛋白表达定量的意义癌症与多种蛋白相互作用有关SomeneuronaltumorsManycancersProteinsLeukemiamRNAGenesRetinoblastoma,bone,bladder,lung,breastLeukemia,brain,breast,stomach,lungSarcomasColon多蛋白表达定量——转化医学与个性化治疗对单个细胞内多种蛋白进行检测能更好确定细胞表型对多种蛋白进行定量分析可以促进:靶标确认临床试验受试人群选择治疗效果及反馈临床效果的相关性分析传统的多蛋白检测方法基于组织破碎的多蛋白检测方法组织破碎方法的局限性:形态学信息丢失组织环境信息丢失细胞表型无法判断多个细胞的平均信息非兴趣细胞信息混入培养的细胞不能代表真实组织中的细胞行为

正常的表皮细胞炎症细胞基质肿瘤细胞CellcultureTissuesection多靶点标记揭示了单个细胞内的共表达TissueNuclearCytoplasmicMembranousE.g.Ki-67E.g.PanCKE.g.CD45CD45/PanCKStainLNMetastasisCarcinomaPrimaryKi-67/PanCKDualStainMetastaticCellsProliferativeSerialsection#1图像细微差异图像配准困难样本体积局限性连续切片法无法获得单个细胞内的共表达信息Serialsection#2Serialsection#3单一靶点标记与细胞表型PR-stainedserialsection(VIP-purple)ER-stainedserialsection(SG-green)23%ofcellsarePR+(OD>0.1)10%ofcellsareER+(OD>0.1)Twoindependentcellphenotypesdetected多靶点标记与细胞表型ER/PRdouble-stainedsection(ER-SG,PR-VIP)确定4种共表达表型PR+/ER-15%PR+/ER+4%PR-/ER-81%PR-/ER+0%优势:电子可调谐带通滤光片随意调节扫描波长高质量成像快速调节（ms）高质量光谱数据多光谱成像：基于液晶可调谐滤光片（LCTF）Nuance™液晶可调谐滤光片

(LCTF)CCDLCTFNuanceModels:EX:450-950nmFX:420-720nmLCTF—液晶可调谐滤光系统型号:FX:420to720nmEX:450to950nm特征:电子可调谐带通滤光片随意调节扫描波长高质量成像：没有可移动部件相当于200个传统滤光片快速调谐光谱质量高可选择带通:20nmor40nm步进最小1nmLCTFQDotFWHM=50nmSpectra650nm625nm600nm575nm多光谱数据采集过程5Quantumdotvials550nmCCD采集不同波长下图像将采集数据储存在三维cube里CCD每个像素均得到光谱曲线xyz565nm655nmNuancecompositeimage光谱分离演示ColorimagecalculatedfromspectralimagedataNuanceunmixedimagesNuancesimulatedfluorescenceimageMonochrome(525nm,20-nmbandpass)Color前列腺特异性膜抗原(PSMA)Label:525-nmquantumdotCompositeimage提高信噪比、灵敏度和准确度Unmixed多光谱分离：去除组织切片中的强自发荧光细胞周期标志物:p21WAF-1/Cip1生长抑制标志物DAB(pseudo-coloredgreen)

p27Kip1–生长抑制标志物Liquidpermanentred

Ki67–细胞增殖标志物VectorVIP多光谱分离技术：明场“高内涵”数据挖掘Skinvesselmalformationdermal/epidermaljunctionHer-2andERimageHer-2only单一细胞的多靶点标记RGBimageER阳性细胞同时Her-2阳性可能性小多光谱分离技术在明场中的应用HematoxylinKi67—red细胞周期标志物pHH3—brownPhospho-histone3细胞周期标志物CC3—grayCleaved-caspase3血管再生抑制剂强大的光谱分离功能Example:Redvs.Redvs.RedLiquidpermanentredFastRedAEC常用染料光谱多分子靶点标记检测

NuancecompositeimageAutofluorescenceHoechstAF488Cy3三种荧光标记肝脏组织光谱分离的必要性58060062064066068070005101520253035Wavelength(nm)CCDCountsNarrowbandpassfilterAutofluorescenceplusQDotAutofluorescenceonlyColorImageMonochromeImage(630±15nm)Unmixedimage光谱分离提高图像信噪比和准确度多光谱成像显著提高信噪比colorimageNuancecompositeimage530-nmmonochromeimageNuanceimage纯光谱计算（

CPSTM

）colorimagePureautofluorescenceMixedFITC+Autofluorescence光谱分离精确定量——去除假阳性Signal(Cts)membrane23.4nuclear1.3Offsample0.4Signal(Cts)membrane69.1nuclear99.9Offsample6.9UnmixedEGFRsignalMonochromebandpassimage23.41.30.469.199.96.9ConventionalDetectingEGFRinbreasttissueMultispectralRGBimageAutofluorescenceGFAPDAPINFTUnmixedNuanceimage强自发荧光组织中多靶点标记图像分离多靶点标记分离ColorimageDAPIphospho-EGFREGFRAutofluorescenceNuancecompositeimageNuanceimage:EGFRgreen,p-EGFRred活体成像的交叉验证靶点分子是否存在于肿瘤细胞中？是否在整个研究过程中都在肿瘤细胞中？在整个过程中表达水平是否变化？是否与只与抗体特异性结合？与探针特异性结合还是仅仅包裹探针？两种交叉验证方法：直接验证和间接验证IndirectvalidationDirectvalidation只能证明抗原存在无法证明抗体抗原的特异性结合通过荧光信号可以判断抗体抗原的结合情况ColorimageNuancecompositeimage(DAPI+GFP)AutofluorescenceDAPIGFP多光谱成像提高GFP标记的信噪比和准确度

活体成像的体外交叉验证Injectionof100µgHerceptin-Cy5i.v.intoSCIDbeigemicewiths.c.growingBT474tumors.NIRFwasmeasuredfor2secatindicatedtimepoints.15min 1day 4days 5days11days荧光标记的抗体与抗原是否特异性结合？x40x40x40x40x40x40Herceptin-Cy5Pertuzumab-Cy5Xolair-Cy5x40x40Erbitux-Cy5前三个结果验证荧光标记抗体与抗原确实发生特异性结合，只是存在强度的差别，切片的强度结果也反过来验证了活体的结果第四个结果，活体成像有信号检测到，微观验证表明抗体与抗原未发生特异性结合CourtesyRoche,Penzberg,Germany

invivosignalNuanceimageof

excisedtumor(H&E)Nuanceimage(Her2/Cy5inred)Nuanceimage(Her2/Cy5inbrown)活体到细胞水平成像体外交叉验证1483celltumors435ScelltumorsEGFRpositiveEGFRnegativeBeforeSpectralUnmixing多光谱成像在肿瘤干细胞研究中的应用IntraductalcarcinomaCSCphenotype:CD44+,CD24-CD44v6(QD655)CD24(QD605)Snyder,Loda,etal.“IdentificationofCD44v6+/CD24-breastcarcinomacellsinprimaryhumantumorsbyquantumdot-conjugatedantibodies”LaboratoryInvestigation(2009)89,857-866.Nuancespectrallyunmixedimagesshowingtheheterogeneityof

CD44andCD24expressioninasingleHer2-amplifiedtumorCD44v6-QD655CD24-QD605AfterSpectralUnmixingCD44v6(QD655)CD24(QD605)Nuance™系统明场表达方式多光谱分离技术:“高内涵信息挖掘”成为现实形态学检测(无多靶点标记)(非多光谱技术)IHC:切片中单一蛋白表达水平检测H&E染色:解剖学和形态学信息形态学和多靶点信息NuanceTMinForm™和

Vectra™多光谱成像技术在荧光和明场中的应用IVIS™和MaestroTM从活体中采集采集多靶点标记的高灵敏度定量信息.多靶点标记(无形态学信息)inForm™高级切片分析模块培养的细胞不能代表真实组织中的细胞行为

正常的表皮细胞炎症细胞基质肿瘤细胞CellcultureTissuesectioninForm™实现用户自定义图像识别inForm™：简明的示例学习界面inForm™图像定量分析模块无需编程基础快速确定现识别标准区域分割可靠图像处理快速(数秒/张)

可兼容笔记本电脑兴趣区域分割

2.5x下胰腺中的胰岛细胞兴趣区域统计信息20x4x测量肝脏切片中肉芽肿区域所占比例inFormclassification31%32%组织切片区域分割前列腺肿瘤组织兴趣区域分割H&E染色的乳腺组织切片肿瘤分级及评分系统Score040%1+24%2+19%3+17%乳腺组织中的PR肿瘤分级及评分系统

Score093%1+5%2+2%3+1%P53阴性的乳腺组织细胞统计ClassifiedImage(red=cancer,green=other)inForm™图像定量准确性验证

目标：

缩短研究时间:100张每天的速度处理500-4000张图片一致性期望:起始一致性达0.7-0.8,一段时间后达到0.6-0.7ConcordancebetweenManualandAutomatedAssessments

(semi-automatedanalysis:>200/hr!)R=0.75R=0.82R=0.68ManualAssessment(HScore,PathologistB)AutomatedAssessment(HScore)定量分析对于病理学的意义细胞水平多信息定量统计人工视觉评估统计制药公司通过乳腺癌研究验证:速度更快：从100张/天到200张/小时分辨率更高：可以识别人眼无法分辨的图像信息病人分类更细：通过单个细胞内多蛋白表达分类*WithpermissionfromNovartisRGBrepresentationofspectralcubeWithcancermask多靶点共定位分析WithcancermaskandnucleisegmentationRed=cancermaskGreen=cancernucleiBlue=backgroundPR-RedER-DABScatterplotofERvsPRexpressionER/PR染色揭示了组织差异性PR-RedER-DABRGBrepresentationofspectralcubePR-RedER-DABScatterplotofERvsPRexpressionPR-RedER-DAB17.23.978.20.50.11.854.243.88.450.633.76.3MostlyDoubleNegativeSignificantPRSinglePositiveSignificantDoublePositiveImagesfromasinglebreasttumorsection肺癌中细胞信号通路研究：pERK,pAKT,pS6

ColorimageofsampleDAPIComponentDAPIandpERK(Alexa555)DAPIandpS6(Alexa647)DAPI,pERKandpS6WithinFormTumorMask(red)WithinFormNuclearSegmentationWithinFormCellSegmentation另外一组肺癌组织实验DAPIComponentAutofluorescenceDAPIandpERK(Alexa555)DAPIandpS6(Alexa647)DAPI,pERKandpS6WithinFormtumormaskWithinFormnuclearsegmentationWithinFormnuclearandcytoplasmsegmentationVectra™智能切片分析系统智能化信息挖掘VectraTM实现高精确度和灵敏度数据的挖掘，极大促进了医学、药物研究和疾病诊断的发展Vectra组织切片分析实例肿瘤中信号通路活性研究老年痴呆症研究肿瘤转移的炎症反应研究BRCA1有关的乳腺癌研究肾病、肺部纤维化和骨髓损伤的用药反应研究肿瘤微环境研究肺癌组织的信号节点分析ConventionalColorImage光谱分离细胞定量分析pS6、pERK、pAKTSignalCompositeImageAnalyzedImageVectraTM单个细胞内的多参数数据去除自发荧光肝脏组织生物标记分析VectraTMinFormTM多靶点免疫荧光标记肾脏组织肾小球系膜区域分析autofluorescenceIHCVectraTMinFormTMSlideNo.totalareaoftufts(pixels)%mesangialfiber1M0048230,27245%1M0050183,96843%1M0051213,95244%1M0082202,68842%1M0083173,63242%2M0052196,89644%2M0079210,08045%2M0081166,20843%2M0084357,50444%2M0085206,78445%VectraTM在安全性和毒性研究中应用Vectra采集到的4倍镜下全切片单色图像inForm进行区域分析，Vectra获取样本MosaiccolorBMPVectra采集4倍镜下样本图像inForm进行肿瘤区域分割选择成像视野Vectra在20倍镜下采集选择区域的多光谱图像OneoftheHPFszoomedintofullscreeninForm进行定量分析OneoftheHPFszoomedintofullscreenwithtumormaskinForm肿瘤区域分割OneoftheHPFszoomedintofullscreenwithtumormaskandcellsegmentationinForm肿瘤细胞统计4个选择区域的20倍成像肿瘤细胞统计ExtractedmultiparameterpercelldataER+veDouble+ve17%24%Double-vePR+ve1%59%ER+veDouble+ve59%24%Double-vePR+ve1%17%ER+veDouble+ve77%16%Double-vePR+ve3%4%ER+veDouble+ve18%28%Double-vePR+ve6%47%ExtractedmultiparameterpercelldataER+veDouble+ve17%24%Double-vePR+ve1%59%ER+veDouble+ve59%24%Double-vePR+ve1%17%ER+veDouble+ve77%16%Double-vePR+ve3%4%ER+veDouble+ve18%28%Double-vePR+ve6%47%Extractedmultiparameterpercelldata4321Vectra™优势：数据更准确全面基于单个细胞数据分析分析速度更快灵活性更强Core(12,6)Core(7,7)Core(2,11)Core(10,3)Vectra™全切片分析取样方法：1全切片取样，忽略空白区域Vectra™全切片分析取样方法：2全切片规则网格中取一定比例的区域(例如

10%)Vectra™全切片分析取样方法：inFormSegmentation:Redmask=tumorGreenmask=stroma3inFrom™识别感兴趣区域，只采集感兴趣区域Vectra全切片分析取样方法：4inFormSegmentation: