核酸扩增技术（NAT）在生物制品外源因子检测中的应用

核酸扩增技术（NAT）在生物制品外源因子检测中的应用生物制品的生产依赖于微生物、动物或植物细胞、动物源或人源组织、体液等起始原材料，其安全核心在于严格控制外源因子污染。根据世界卫生组织（WHO）的定义，外源因子包括非预期存在于生产用原材料、生产过程或终产品中的任何生物性物质，如细菌、真菌、支原体、立克次体、病毒（含朊病毒）、寄生虫，以及具有感染性或干扰性的核酸、蛋白类物质等。外源因子的威胁不仅来自人类病原体，还包括各类动物病原体。即便这些病原体对人类无直接致病性，但也可能对生物制品的安全性与有效性构成不良影响。01历史教训：那些改变行业的污染事件外源因子污染的代价，往往使人触目惊心。生物制品一旦受到污染，造成的后果可能很严重，甚至导致患者死亡。比如1929年德国卡介苗事件导致72名婴儿死亡，1970-1990年英国凝血因子污染事件造成约2.5万人感染HIV/HCV。表1.生物制品历史上重大外源因子污染事件回顾这些事件揭示了一个共同的问题：外源因子污染的核心多为“隐性污染+原材料引入”，促使行业逐渐从“被动检测”转向“主动防控+全链条溯源”的管理模式。同时，CAR-T细胞治疗、AAV基因治疗、mRNA疫苗等新型生物制品的快速放行需求，也在加速推动检测技术的革新。02技术革新：核酸扩增技术NAT目前，生物制品外源因子检测方法主要有培养法（体外培养法、动物体内接种法）、透射电镜法、PCR法。不同方法各有优劣，需根据检测目标灵活选择。表2.生物制品外源因子检测方法培养法长期被视为细菌、真菌、支原体检查的“金标准”，但检测周期长。体外培养法依赖于指示细胞对特定病毒的敏感性，可能造成无法感染指示细胞的病毒漏检。动物体内接种法只能检出能感染动物且产生症状的病毒，且存在个体反应差异、周期长、伦理问题等局限性。核酸扩增技术（NucleicAcidAmplificationTechnology，NAT）凭借“精准识别、微量扩增、快速检测”的核心优势，已被多国药典收录为生物制品外源因子检测的替代方法或首选方法，成为生物安全检测领域的核心技术支撑。NAT技术有效弥补了传统培养法的不足：①无法识别灭活的外源因子②难以检测低活力病原体③检测周期长，如分枝杆菌的培养长达56天④受宿主细胞限制，存在漏检风险其中，聚合酶链式反应（PCR）技术和下一代测序（NGS）技术在病毒检测中最为常用。03法规依据：药典与监管机构的认可面对“PCR检测是否能够满足注册申报要求”的疑问，各国药典和工业指南已给出明确答案：NAT技术已成为外源因子检查的重要工具。接下来我们将列举一些药典或工业指南对NAT技术的支持依据。1，在病毒检测方面美国FDA：1993年《PointstoConsiderintheCharacterizationofCellLinesUsedtoProduceBiologicals》中提到：PCR扩增可为生物制品细胞系中是否存在特异性病毒污染提供更多有价值的信息，认可了PCR扩增在细胞系病毒污染物检测中的价值。2010年《CharacterizationandQualificationofCellSubstratesandOtherBiologicalMaterialsUsedintheProductionofViralVaccinesforInfectiousDiseaseIndications》中也明确提出：在病毒不易培养的情况下，PCR技术是评估细胞基质是否受此类病毒污染的有效工具，其中还强调了PCR技术在人源病毒、猴源病毒、昆虫病毒检测中发挥着重要作用。ICHQ5A（R2）：2023年更新发布的《来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价》中也明确规定：核酸扩增技术可用于检测种属特异性病毒，可用来替代部分动物实验且无需开展头对头比较，明确提出分子生物学方法可用于补充因干扰受限的细胞培养法，还可作为感染性试验细胞培养中无法生长的特异性病毒检测的有效工具。各国药典：《美国药典》USP41-NF36<1237>《VirologyTestMethods》指出，定量聚合酶链式反应（qPCR）可作为直接检测病毒感染的终点法之一，包括逆转录酶检测、鼠细小病毒（MVM）检测、虫媒病毒检测、人源病毒检测等；《欧洲药典》11.0版5.2.3章节《Cellsubstratesforthe

productionofvaccinesforhumanuse》中同样提到，核酸扩增（2.6.21章节）可检测种属特异性病毒。《中国药典》2025版通则0234《生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制》中规定，经验证的分子生物学方法可用于检测种属特异性病毒。2，其他外源因子检测支原体检测：《欧洲药典》11.0版2.6.7章节《Mycoplasmas》和《日本药典》XVIII<G3-14-170>《MycoplasmaTestingforCellSubstratesUsedfortheProductionofBiotechnological/BiologicalProducts》均提出，经验证的NAT法可用于支原体检测，同时提供相关验证流程。分枝杆菌检测：《欧洲药典》11.0版5.2.3章节和《中国药典》2025版通则0234同时提出，可采用经验证的核酸检测方法作为分枝杆菌培养法的替代方法。螺原体检测：《欧洲药典》11.0版和《中国药典》2025版也提出，检测支原体的NAT法在通过适当验证后，可用于螺原体检测。

结语：总之，核酸扩增技术（NAT）以其高灵敏度、高特异性、快速检测的核心优势，正在重塑生物制品外源因子检测的技术格局。从被动响应到主动防控，从单一方法到多元互补，NAT技术已成为生物安全领域不可或缺的“分子侦探”。面对日益复杂的生产原材料、不断缩短的放行周期要求，以及新型治疗技术的涌现，掌握并熟练运用NAT技术已成为生物安全检测人员的核心能力。

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