泛素化蛋白修饰课件

TheCentralDogma（Revised)DNARNAProteinBreakdownModification&DegradationE1-E1E2-E2底物E3ATPAMP+PPiUbUbUb蛋白酶体泛素－蛋白酶体通路Ub:

泛素(Ubiquitin)，一高度保守的，由76个氨基酸组成的多肽。E1:

泛素激活酶(Ubiquitin-activatingenzyme)，人类仅有2种E1。E2:

泛素载体蛋白(Ubiquitin-carrierprotein)，人类约有30种E2s。E3:

泛素－蛋白连接酶(Ubiquitin-proteinligase)，人类有500多种E3s。9泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素(ubiquitin，由76个氨基酸组成的多肽）共价修饰的过程，在几乎所有的真核细胞活动中起着关键作用。泛素–蛋白酶体(proteasome)通路则是真核细胞内最主要的蛋白质降解途径。泛素化调控的细胞活动至少包括:

细胞周期（Cellcycleprogression）

细胞凋亡（Apoptosis）

转录调控（Transcriptionalregulation）

DNA修复（DNArepair）

免疫应答（Immuneresponse）

蛋白质降解及质量控制（Protein

degradationandqualitycontrol)2TheNobelPrizeinChemistry2004

forthediscoveryofubiquitin-mediatedproteolysis

AaronCiechanover

AvramHershkoIrwinRose

阿龙.西查诺瓦阿夫拉姆.赫希科欧文.罗斯3近年与泛素－蛋白酶体相关的PubMed论文数在持续增长4篇数年份本专题内容1.泛素－蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白（SUMO,NEDD8,ISG15,APG8,APG12，PUP等）5中国协和医科大学出版社，2008年《泛素介导的蛋白质降解》Ubiquitin-MediatedProteolysis主编：邱小波王琛王琳芳参考书陈竺和诺贝尔奖得主AaronCiechanover作序蛋白质泛素化研究简史1975年，Goldstein误将泛素（Ubiquitin)当作胸腺激素而发现。1977年，Goldknopf和Busch认定组蛋白2A与泛素以异肽键（Isopeptide Bond）结合。1977年，Goldberg证明人类细胞中存在一可溶的，直接依赖于能量的非溶 酶体类蛋白酶。1978年，Ciechanover和Hershko发现了APF-1是Goldberg系统中蛋白酶 系的必要成分，结果发表在BBRC。1980年，Ciechanover，Hershko和Rose等人证明了APF-1与当时已被发 现的泛素是同一物质。1984年，Finley和Varshavsky等发现泛素在细胞周期中的重要性。1987年，Goldberg和Rechsteiner两个小组几乎同时分离出分子量很大的 依赖于ATP并降解泛素化底物的蛋白水解酶。1988年，Goldberg将这种蛋白水解酶命名为Proteasome（蛋白酶体）。1997年，Yeh等小组发现类泛素蛋白SUMO和NEDD8的功能。2003年，美国FDA批准了用Velcade来治疗多发性骨髓瘤；Velcade是 在Goldberg发明的蛋白酶体抑制剂MG132的基础上研发而成的。2004年，Ciechanover，Hershko和Rose因发现泛素介导的蛋白质降解共 同获得诺贝尔化学奖。2008年，Darwin等在细菌中发现类泛素化修饰。7Figure8-34Ubiquitin(泛素）泛素由76个氨基酸残基组成，其中包括7个赖氨酸残基(K),其C末端可与底物的赖氨酸残基形成异肽键，从而引起底物泛素化。泛素的K11、K29、K48和K63均能参与形成泛素与泛素间的异肽键(Isopeptidebond)。E1与ATP结合后，催化泛素羧基末端腺嘌呤化，同时释放无机焦磷酸（PPi）。E1活化位点的半胱氨酸硫醇激活泛素腺嘌呤核苷酸中间产物上的羧基，形成一个泛素硫酯键。E2激活的重要条件是位于UBC结构域的一个保守半胱氨酸催化位点与泛素羧基端形成一个硫酯键。E3催化被E2活化的泛素C-端甘氨酸与底物或下一个泛素的赖氨酸间形成泛素异肽键

(Isopeptidebond)。11调节蛋白质内吞，修饰和转录靶蛋白必须经多聚泛素(多于4个泛素分子)修饰才能被蛋白酶体识别与降解。泛素化模式（UbiquitinationModes）调节蛋白质的活性和定位K48polyubiquitylationK63polyubiquitylationMonoubiquitylationMultiplemonoubiquitylation12

a.RINGfingerdomain（SCF复合体，APC，MDM2，Parkin,和c-Cb1）

b.U-boxdomain（CHIP)

c.

HECTdomain（能与底物形成硫酯键)d.N-EndRule

E3的种类13E3泛素连接酶以单体和复合体两种形式存在14AmerikandHochstrasser,2004去泛素化作用（Deubiquitination）15泛素-C-末端水解酶

，通常参与蛋白降解后泛素分子的再利用及对多聚泛素链的修饰，也参与由泛素前体产生泛素单体的过程（如UCH37、UCH-L1)。泛素特异性蛋白酶

，参与去除蛋白质上的多聚泛素链，也可从短泛素链的末端去掉单个泛素（如USP8)。去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现90多种。去泛素化酶可分为两类：去泛素化酶

(Deubiquitinatingenzyme)16泛素化途径的异常与人类重大疾病神经退行性疾病（如帕金森氏症）： Parkin,UCH-L1癌症: BRCA1,CYLD,Mdm2,Nrdp1,pVHL

传染病病原体的入侵、致病机制: E6-AP17泛素连接酶Parkin的失活与帕金森氏症（AR-JP)CurrentOpinioninNeurobiology2004,14:384–38918CurrentOpinioninNeurobiology2004,14:384–389ParkinSubstrates19UCH-L1为一去泛素化酶，它在帕金森氏症病人中的突变可能导致其酶活性的丧失，减少了泛素自由单体的供应及底物蛋白的降解，进而导致黑质病变。帕金森氏症中的去泛素化20—————————————————————————————————————————失调蛋白底物修饰肿瘤类别

————————————————————————————————————————SKP2

p27(KIP) Polyubiquitylation MalignantmelanomaMDM2

p53 Polyubiquitylation Non-small-celllungcancer, soft-tissuecarcinoma, colorectalcancer HAUSP

p53,MDM2 De-ubiquitylation Non-small-celllungcancer lymphoma APC

CyclinB, Polyubiquitylation Colorectalcancer securin FANCL

FANCD2 Monoubiquitylation Fanconianaemia-related cancers CYLD

IKKγ De-ubiquitylation Cylindromatosis IAP2

BCL10 Polyubiquitylation MALTlymphomas CBL

RTKs Multiple Lymphoma,AMLand monoubiquitylation gastriccarcinoma pVHL

HIF Polyubiquitination vonHippel-Lindaudisease—————————————————————————————————————————泛素化失调与肿瘤21

1394470684956N末端C末端

TRAF2结合位点

CYLD具有TRAF2（TNF-receptor-associatedfactor2，为IκB的泛素连接酶)

结合位点，可促进IκB的去泛素化。去泛素化酶CYLD的突变与圆柱瘤Cylindromatos的发生相关22CYLD促进IκB的去泛素化，从而抑制NF-κB的活性23NENGLJMED2004,350:187-188圆柱瘤Cylindromatos也称“头帕肿瘤综合症”(turbantumoursyndrome),其患者细胞CYLD的两个等位基因都发生了突变，结果使患者细胞中CYLD丧失功能，导致核转录因子NF-κB的过度活化；启动基因的转录，导致细胞的过度增殖24泛素连接酶Mdm2和E6-AP与p53的降解和癌症25UbiquitinationoccursonhistonesH1,H2A,H2BandH3.

Thismodificationondifferenthistonesplaysdistinctrolesinregulationofchromatinstructures,andhencegeneexpressionandgenomestabilityUbiquitinationandtranscriptionalregulationUbiquitinationofhistoneH2AandH2Bhasoppositeeffectsontranscription.

UbiquitinationofH2Bisassociatedwithgeneactivation,whileH2Aubiquitinationcontributestogenesilencing

Wangetal.,NATURE|VOL431|14OCTOBER2004Leeetal.,Cell131,1084–1096,2007HistoneCrosstalkbetweenH2BMono-ubiquitinationandH3MethylationMediatedbyCOMPASSCps35IsRequiredforTranslatingHistoneCrosstalkbetweenH2BMonoubiquitinationandH3MethylationbyCOMPASS1.Nrdp1是一新的含有RINGfinger结构域的泛素连接酶

。RINGFingerSubstrate-BindingRegionNrdp1是一促进ErbB3及BRUCE泛素化和降解的泛素连接酶2.ErbB3是表皮生长因子受体家族(EGFRfamily)成员之一，在生长，发育及细胞存活中起着关键的作用。该家族与许多肿瘤密切相关，已成为癌症治疗的重要标靶之一。3.BRUCE/Apollon是一含有BIRdomain（凋亡抑制蛋白的标志性结构域）和E2domain的巨型(530kDa)膜蛋白BIRdomainE2(ubiquitin-carrier)domain26Nrdp1促进细胞凋亡并可能与癌症和帕金森氏症相关Nrdp1ApoptoticStimuliPI3kinaseAKT/PKBIKKabErbB3I-

BPNF-

BactivationApoptosis

Caspase-3/7Pro-casp-9Caspase-9OtherIAPs(e.g.,c-IAP1)SmacSmacprecursorParkinBRUCE?p53SpermDifferentiation

NIP

1.Qiu*&Goldberg*(2002),PNAS2.Qiu*etal.(2004),EMBOJ

3.Qiu*&Goldberg*(2005),J.Biol.Chem.

4.

Liu,Qiu*etal.

Manuscriptinpreparation27促进抑制本专题内容1.泛素－蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白28TheBiochemicalRolesofProteinDegradationinaCell1.溶酶体(Lysosomes) Non-selectiveHydrolyzeproteinsfromautophagyDigestproteinsfromendocytosisMembraneproteins Extracellularproteins

2.泛素-蛋白酶体通路 Selectiveand

(Ubiquitin-ProteasomePathway) ATP-Dependent

Regulatebiochemicalreactions

DiscardunnecessaryproteinsDegradedamagedormisfoldedproteinsPresentinternalizedantigensinimmunologicalresponses29

20S催化颗粒19S调节颗粒19S10nm电镜下的26S蛋白酶体(Proteasome)YifanCheng,Xiao-BoQiuetal.,unpublisheddata3026S蛋白酶体的亚基组成3132免疫蛋白酶体(Immunoproteasome)负责抗原提呈(AntigenPresentation)免疫蛋白酶体的催化颗粒(20S)

有三个特殊亚单位LMP2、LMP7和MECL-1。其调节颗粒为PA28（11S）。20S颗粒33MHCclassIantigenpresentationpathwayTcellPeptideMHCclassIProteinantigenProteasome+/-UbiquitinPeptides(2-24a.a.)TAP(8-16a.a.)EndoplasmicReticulumCD8+Golgi8-10a.a.AminoacidsERAP13435Theproteasomeinhibitor,Velcade(Botezomib/PS-341),hasbeenapprovedbyFDAtotreatmultiplemyelomaandmantlecelllymphoma

.36中药雷公藤中的抗癌活性成分—雷公藤红素Celastrol是一种蛋白酶体抑制剂，它能通过控制癌细胞的蛋白酶体活性进而诱发癌细胞凋亡。

Yang,H.etal.,CancerRes.(2006)

371、蛋白酶体亚单位hRpn13能激活存在于蛋白酶

体的去泛素化酶UCH37。

2、c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性。蛋白酶体的调控38hRpn13能激活去泛素化酶UCH37control+hRpn13S5a+hRpn13+Ub-HQiu,X.B.*etal.,

EMBOJ.

（2006）25:5742-5753.

39其它研究表明Rpn13可作为泛素受体而结合于泛素链的近端Husnjaketal.Nature453:481,2008Schreneretal.Nature453:548,200841c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性Liu,X.,Huang,W.,Li.,C.,Li,P.,Yuan,J.,Li,X.,Qiu,X.B.,Ma,Q.,andCao,C.(2006).MolecularCell.22,317-327.42The26Sproteasomeisamultisubunitcomplex,consistingofthe20Scatalyticparticleandthe19Sregulatoryparticle,andselectivelydegradesubiquitinatedproteinsinthepresenceofATP.Proteasomesareresponsiblefordegradationofmostcellularproteins,whilelysosomesdegradeextracellularproteinsandmostmembraneproteins.Uponimmuneresponses,cellsgeneratespecialtypesofproteasomes,immunoproteasomes,whichpossessdistinctregulatoryparticle(11S)andcatalyticparticle(withdifferentcatalyticsubunits),formoreefficientantigenpresentation.Proteasomesareresponsiblefordegradationofmostcellularproteins本专题内容1.泛素－蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白（SUMO,NEDD8,ISG15,ATG8,PUP等）43类泛素蛋白及其同源性44Ubiquitin-LikeProteinInvolvedintheProteasomePathwayofMycobacteriumtuberculosis

Pearceetal.(2008)Science322:1104

PUP-conjugationisfoundremarkablyinmycobacteriaandalliedactinobacterias,andissporadicallypresentinotherlineages,suchasverrucomicrobia,nitrospirae,deltaproteobacteriaandplanctomycetes.

Iyeretal.(2008)BiologyDirect,3:45Proteinmodificationbyubiquitin-likeprotein,PUP,inprokaryotesPUPispredictedtoencodea64–aminoacidproteinwithamolecularsizeof6.9kD类泛素蛋白的结构高度相似UbiquitinISG15SumoNEDD845ActivatingenzymecomplexhastwosubunitsAOS1issimilartotheN-terminalhalfofUbE1UBA2ishomologoustotheC-terminalhalfofUbE1andcontainsthecysteinenecessaryforlinkagewithSUMOConjugatingenzyme:UBC9SUMO(Smallubiquitin-likemodifier)－101aminoacids46SUMO修饰的功能47SUMO化修饰的底物48DesumoylatingenzymesUlp1HasbothisopeptidaseandC-terminalhydrolaseactivityRequiredforG2/MtransitionSumoC-terminalhydrolases,e.g.SENP149Nedd8(neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownr