扶正抑癌方调控结肠癌Iovo细胞EMT的机制探究：解锁抗癌新密码

扶正抑癌方调控结肠癌Iovo细胞EMT的机制探究：解锁抗癌新密码一、引言1.1研究背景与意义1.1.1结肠癌的现状与挑战结肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症负担数据，结直肠癌目前居全球发病谱第三位和死因谱第二位，分别占癌症发病和死亡总数的10%和9.4%。2019年，全球范围内的结直肠癌发病例数为217万例，死亡例数达109万例。其中，东亚地区结直肠癌的负担最重，而中国的结直肠癌发病数及死亡数均居世界首位，2019年新发病例607,900例，死亡病例261,777例。在中国，结直肠癌一直被认作最常见的、严重损害健康和寿命的恶性肿瘤之一，已成为威胁生命健康的三大恶性肿瘤之一。不仅如此，早发性结直肠癌发病率呈上升趋势，已成为公共卫生领域的重点问题，在中国，早发性结直肠癌的发病率为6.4/10万人，年百分比变化为0.4%。目前，结肠癌的治疗手段主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等。手术是结肠癌的主要治疗方法，但对于中晚期患者，手术往往难以彻底切除肿瘤，且术后复发率较高。化疗是结肠癌综合治疗的重要组成部分，然而，化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，引发一系列副作用，如恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等，严重影响患者的生活质量。此外，部分患者对化疗药物不敏感，导致化疗效果不佳。放疗主要用于局部晚期或复发的结肠癌患者，其局限性在于对正常组织的损伤较大，且可能引发放射性肠炎等并发症。靶向治疗和免疫治疗虽然为结肠癌患者带来了新的希望，但这些治疗方法的适用人群有限，且价格昂贵，限制了其广泛应用。因此，寻找新的治疗方法和药物，提高结肠癌的治疗效果，改善患者的生存质量，已成为当前肿瘤研究领域的迫切任务。1.1.2扶正抑癌方的研究现状扶正抑癌方是一种基于中医理论研发的复方中药制剂，由多种具有扶正固本、清热解毒、活血化瘀等功效的中药组成。该方中的人参、黄芪等具有益气扶正的作用，能够增强机体的免疫力，提高机体对肿瘤的抵抗力；白花蛇舌草、半枝莲等具有清热解毒的功效，可抑制肿瘤细胞的生长和增殖；莪术、丹参等具有活血化瘀的作用，能够改善肿瘤组织的血液循环，抑制肿瘤的转移。扶正抑癌方在临床上已被广泛应用于多种癌症的治疗，如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等，并取得了一定的疗效。研究表明，扶正抑癌方能够提高癌症患者的生活质量，延长生存期，减轻放化疗的副作用，增强机体对放化疗的耐受性。在结肠癌的治疗中，扶正抑癌方也展现出了一定的潜力。一些临床研究发现，扶正抑癌方联合化疗能够提高结肠癌患者的近期疗效，降低肿瘤标志物水平，改善患者的免疫功能和生活质量。然而，目前关于扶正抑癌方治疗结肠癌的研究仍相对较少，其作用机制尚未完全明确，需要进一步深入研究。1.1.3EMT在结肠癌中的关键作用上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下，向间质细胞转化的过程。在这个过程中，上皮细胞逐渐失去其极性和细胞间连接，获得间质细胞的特性，如迁移和侵袭能力增强。EMT在胚胎发育、组织修复和再生等生理过程中发挥着重要作用，但在肿瘤的发生和发展中，EMT却扮演着关键的促癌角色。在结肠癌中，EMT与肿瘤的侵袭和转移密切相关。当结肠癌细胞发生EMT时，细胞间的黏附力下降，使得癌细胞能够脱离原发肿瘤部位，进入血液循环或淋巴循环，进而发生远处转移。同时，EMT还能赋予癌细胞更强的耐药性，使得肿瘤细胞对化疗药物和靶向药物的敏感性降低，增加了治疗的难度。研究表明，EMT相关基因的表达水平与结肠癌的临床分期、淋巴结转移和预后密切相关，高表达EMT相关基因的结肠癌患者往往预后较差。因此，深入研究EMT在结肠癌中的作用机制，寻找有效的干预靶点，对于抑制结肠癌的侵袭和转移，提高患者的生存率具有重要意义。本研究旨在探讨扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT的影响及其作用机制，为结肠癌的治疗提供新的理论依据和治疗策略。通过研究扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT相关蛋白和信号通路的影响，有望揭示扶正抑癌方抑制结肠癌侵袭和转移的分子机制，为开发新型的抗结肠癌药物提供实验基础。同时，本研究的结果也可能为临床应用扶正抑癌方治疗结肠癌提供科学指导，提高结肠癌的治疗效果，改善患者的生活质量。1.2研究目的与内容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞上皮-间质转化（EMT）的影响，并揭示其潜在的作用机制。通过细胞实验，观察扶正抑癌方对Iovo细胞形态、迁移和侵袭能力的影响，明确其对EMT过程的调控作用。从分子生物学层面，研究扶正抑癌方对EMT相关蛋白（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）表达水平的影响，以及对相关信号通路（如Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等信号通路）的调控机制，为扶正抑癌方在结肠癌治疗中的应用提供坚实的理论基础和实验依据，推动结肠癌治疗的新进展。1.2.2研究内容本研究将从细胞实验和机制研究两个方面展开，全面深入地探讨扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT的影响及作用机制。在细胞实验方面，首先，我们将选取对数生长期的结肠癌Iovo细胞，将其随机分为对照组、不同浓度扶正抑癌方处理组。对照组给予常规的细胞培养液，而扶正抑癌方处理组则分别加入不同浓度梯度的扶正抑癌方溶液进行培养。在培养过程中，我们会密切观察不同处理组细胞的形态变化。通过光学显微镜，我们可以直观地看到细胞形态的改变，如上皮细胞典型的多边形形态是否逐渐向间质细胞的梭形形态转变。同时，我们还会运用细胞划痕实验和Transwell实验来定量分析细胞的迁移和侵袭能力。在细胞划痕实验中，我们在细胞单层上制造划痕，然后观察不同处理组细胞在一定时间内对划痕的愈合情况，以此来评估细胞的迁移能力。而在Transwell实验中，我们将细胞接种在上室，下室加入含有趋化因子的培养液，通过检测穿过小室膜的细胞数量，来准确衡量细胞的侵袭能力。通过这些实验，我们可以明确扶正抑癌方对Iovo细胞迁移和侵袭能力的影响，进而初步判断其对EMT过程的调控作用。在机制研究方面，我们将运用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，来深入研究扶正抑癌方对EMT相关蛋白和基因表达水平的影响。在Westernblot实验中，我们会提取不同处理组细胞的总蛋白，然后通过电泳、转膜等一系列步骤，将蛋白转移到固相支持物上，再用特异性抗体检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相关蛋白的表达水平。E-cadherin是上皮细胞的标志性蛋白，其表达水平的降低通常意味着上皮细胞极性和细胞间连接的丧失，是EMT发生的重要标志之一；而N-cadherin和Vimentin则是间质细胞的标志性蛋白，它们表达水平的升高往往与细胞获得间质细胞特性，如迁移和侵袭能力增强密切相关。通过检测这些蛋白表达水平的变化，我们可以进一步明确扶正抑癌方对EMT的影响。同时，我们还会运用qRT-PCR技术检测相关基因的mRNA表达水平，从基因转录层面进一步验证蛋白表达水平的变化。此外，我们还将通过相关实验探究扶正抑癌方对EMT相关信号通路的调控机制。我们会运用免疫荧光染色、激酶活性检测等技术，研究扶正抑癌方对Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等信号通路关键分子的影响。在Wnt/β-catenin信号通路中，我们会检测β-catenin的核转位情况以及相关靶基因的表达变化；在TGF-β/Smad信号通路中，我们会检测Smad蛋白的磷酸化水平以及其下游基因的表达变化。通过这些实验，我们可以深入揭示扶正抑癌方抑制结肠癌Iovo细胞EMT的分子机制，为结肠癌的治疗提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。1.3研究方法与技术路线1.3.1研究方法细胞培养：从细胞库获取结肠癌Iovo细胞，将其置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中进行常规培养。定期观察细胞的生长状态，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代处理，以确保细胞的活性和正常生长。通过细胞计数板和台盼蓝染色法对细胞数量和活力进行检测，保证实验所用细胞的质量。MTT法：将处于对数生长期的Iovo细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的扶正抑癌方溶液，同时设置对照组加入等量的培养基。在培养箱中孵育24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h。然后小心吸去上清液，加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），根据OD值计算细胞的增殖抑制率，以此评估扶正抑癌方对Iovo细胞增殖的影响。免疫荧光法：将Iovo细胞接种于预先放置有盖玻片的6孔板中，待细胞贴壁后，进行不同处理。用4%多聚甲醛固定细胞15min，0.1%TritonX-100通透10min，然后用5%BSA封闭30min。分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT相关蛋白的一抗，4℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤3次，加入相应的荧光二抗，室温避光孵育1h。再次用PBS洗涤后，用DAPI染核5min。最后，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照，分析EMT相关蛋白的表达和定位情况。Transwell实验：Transwell小室分为上下两层，上层为聚碳酸酯膜，孔径为8μm。实验前，将Matrigel基质胶用无血清培养基稀释后，均匀铺在Transwell小室的上室底部，37℃孵育1h，使其凝固形成基质膜，用于模拟体内细胞外基质，以检测细胞的侵袭能力；若不铺Matrigel基质胶，则用于检测细胞的迁移能力。将处于对数生长期的Iovo细胞用无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁵个/mL，取200μL细胞悬液加入上室。下室加入600μL含有20%胎牛血清的培养基作为趋化因子。将Transwell小室放入培养箱中孵育24h（迁移实验）或48h（侵袭实验）。孵育结束后，取出小室，用棉签小心擦去上室未穿过膜的细胞，用4%多聚甲醛固定下室面的细胞15min，0.1%结晶紫染色10min。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜的细胞数量，以此评估细胞的迁移和侵袭能力。WesternBlot：收集不同处理组的Iovo细胞，加入适量的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min条件下离心15min，取上清液作为总蛋白样品。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，使各样本蛋白浓度一致。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5min。通过SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离，然后将分离后的蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Smad2/3等目的蛋白的一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤3次，每次10min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1h。再次用TBST洗涤后，加入ECL化学发光试剂，在化学发光成像系统中曝光显影，分析目的蛋白的表达水平。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）：使用Trizol试剂提取不同处理组Iovo细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒的操作说明将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据目的基因（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）和内参基因（如GAPDH）的序列设计特异性引物。采用SYBRGreen荧光染料法进行qRT-PCR反应，反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMix和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s。反应结束后，根据Ct值采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量，分析扶正抑癌方对EMT相关基因表达的影响。1.3.2技术路线本研究技术路线如下：首先复苏结肠癌Iovo细胞并进行常规培养，待细胞生长状态良好且处于对数生长期时，将其随机分组。对照组加入常规培养基，实验组加入不同浓度的扶正抑癌方溶液进行处理。通过光学显微镜观察不同处理组细胞的形态变化，以初步判断扶正抑癌方对细胞的影响。接着运用MTT法检测细胞增殖情况，明确扶正抑癌方对Iovo细胞增殖的作用。然后利用细胞划痕实验和Transwell实验分别评估细胞的迁移和侵袭能力，确定扶正抑癌方对细胞迁移和侵袭的影响。同时，采用免疫荧光法和WesternBlot检测EMT相关蛋白的表达和定位变化，从蛋白层面探究扶正抑癌方对EMT的调控作用。运用qRT-PCR技术检测相关基因的mRNA表达水平，从基因转录层面进一步验证扶正抑癌方对EMT的影响。最后，通过免疫荧光染色、激酶活性检测等实验研究扶正抑癌方对EMT相关信号通路关键分子的影响，深入揭示扶正抑癌方抑制结肠癌Iovo细胞EMT的分子机制。具体技术路线流程如图1所示：[此处插入技术路线图，图中清晰展示从细胞培养开始，到各个实验步骤以及最终结果分析的整个流程，各步骤之间用箭头清晰连接，标注好每个步骤的关键操作和检测指标]二、理论基础与研究现状2.1结肠癌概述2.1.1结肠癌的流行病学特征结肠癌是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在不同地区和人群中存在显著差异。近年来，随着全球人口老龄化的加剧、生活方式和饮食习惯的改变，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的GLOBOCAN2020数据显示，2020年全球结直肠癌新发病例数达193.16万，死亡病例数达93.52万，结直肠癌已成为全球第三大常见癌症和第二大癌症死因。从地区分布来看，结肠癌的发病率在发达国家普遍高于发展中国家。在北美、欧洲等地区，结肠癌的发病率较高，如北欧地区的年龄标准化发病率（ASIR）高达33.61/10万，澳大利亚和新西兰地区为33.17/10万，南欧地区为31.95/10万。而在中南亚、非洲等部分地区，结肠癌的发病率相对较低，中南亚地区的ASIR仅为5.46/10万。这种地区差异主要与不同地区的经济发展水平、生活方式、饮食结构以及医疗卫生条件等因素密切相关。在中国，随着经济的快速发展和居民生活方式的西方化，结肠癌的发病率也呈现出明显的上升趋势。2020年，中国结直肠癌新发病例达55.55万，ASIR为24.07/10万；死亡病例达28.62万，ASMR为12.07/10万。中国结直肠癌新发病例数及死亡病例数均占全球约30%，占东亚地区的75%以上，已成为全球结直肠癌疾病负担较为沉重的国家之一。从国内不同地区来看，结肠癌的发病率在经济发达的城市和地区明显高于农村地区。以上海为例，结直肠癌发病率约为40/10万，已接近西方发达国家水平，在肿瘤发病排名中已由第6位上升至第2位。此外，近年来结肠癌的发病年龄有逐渐年轻化的趋势，早发性结直肠癌（发病年龄小于50岁）的发病率呈上升态势，已引起广泛关注。这可能与年轻人群中不良生活方式的流行，如久坐不动、高热量低纤维饮食、吸烟、过量饮酒等因素有关。2.1.2结肠癌的发病机制结肠癌的发病是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及遗传、环境、生活方式等多个方面，目前其确切的发病机制尚未完全明确。遗传因素在结肠癌的发生中起着重要作用。约10%-30%的结肠癌患者具有遗传背景，其中家族性腺瘤性息肉病（FAP）和遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）是两种常见的遗传性结肠癌综合征。FAP是一种常染色体显性遗传病，由APC基因（adenomatouspolyposiscoligene）突变引起。APC基因是一种抑癌基因，其突变会导致肠道内大量腺瘤性息肉的形成，若不及时治疗，几乎100%会发展为结肠癌。HNPCC则是由于DNA错配修复基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等）的突变所致。这些基因的突变会导致细胞DNA错配修复功能缺陷，使细胞内的基因突变无法得到及时纠正，从而增加了结肠癌的发病风险。此外，一些其他基因的突变，如KRAS、BRAF、PIK3CA等，也与结肠癌的发生发展密切相关。这些基因参与细胞的增殖、分化、凋亡等重要生物学过程，其突变会导致细胞生长失控，进而引发肿瘤。环境因素也是结肠癌发生的重要危险因素。饮食因素在结肠癌的发病中占据重要地位。长期高脂肪、低纤维的饮食习惯被认为是结肠癌的重要诱因。高脂肪食物会增加肠道中胆汁酸的分泌，胆汁酸在肠道细菌的作用下可转化为次级胆汁酸，如脱氧胆酸和石胆酸，这些次级胆汁酸具有较强的细胞毒性和促癌作用。它们可以损伤肠道黏膜上皮细胞的DNA，诱导细胞发生基因突变，促进肿瘤的发生。同时，低纤维饮食会导致肠道蠕动减慢，使粪便在肠道内停留时间延长，致癌物质与肠道黏膜的接触时间增加，从而增加了结肠癌的发病风险。此外，微量元素和维生素的缺乏，如钙、硒、维生素D、维生素E等，也可能与结肠癌的发生有关。钙可以与肠道中的胆酸和脂肪酸结合，形成不溶性复合物，减少它们对肠道黏膜的刺激和损伤；硒具有抗氧化作用，能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖；维生素D可以调节细胞的增殖和分化，抑制肿瘤细胞的活性；维生素E则具有抗氧化和抗凋亡的作用，有助于维持细胞的正常功能。生活方式因素对结肠癌的发生也有显著影响。缺乏体育锻炼是结肠癌的一个重要危险因素。长期久坐不动会导致身体代谢减缓，脂肪堆积，肥胖发生率增加，而肥胖与结肠癌的发病风险呈正相关。研究表明，肥胖会引起体内激素水平的改变，如胰岛素抵抗增加，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）水平升高，这些激素变化会促进肿瘤细胞的生长和增殖。此外，肥胖还会导致慢性炎症反应的激活，炎症细胞分泌的细胞因子和趋化因子等可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移。吸烟和过量饮酒也是结肠癌的重要危险因素。吸烟会导致体内致癌物质的增加，如多环芳烃、亚硝胺等，这些致癌物质可以直接损伤细胞DNA，引发基因突变。饮酒则会干扰肝脏的正常代谢功能，影响维生素和微量元素的吸收和利用，同时酒精还可以直接刺激肠道黏膜，增加结肠癌的发病风险。肠道慢性炎症和息肉等病变与结肠癌的发生密切相关。长期的肠道慢性炎症，如溃疡性结肠炎和克罗恩病，会导致肠道黏膜反复损伤和修复，在这个过程中，细胞容易发生基因突变，从而增加患结肠癌的风险。据研究，溃疡性结肠炎患者患结肠癌的风险比正常人高10-30倍。肠道息肉是结肠癌的重要癌前病变，尤其是腺瘤性息肉。腺瘤性息肉的上皮细胞具有异常的增殖和分化能力，随着时间的推移，这些息肉可能会发生恶变，转变为结肠癌。息肉的大小、数量、形态以及病理类型等都与恶变的风险有关，一般来说，息肉越大、数量越多、形态越不规则、病理类型为绒毛状腺瘤，其恶变的风险就越高。2.1.3结肠癌的治疗现状目前，结肠癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等，医生会根据患者的肿瘤分期、病理类型、身体状况等因素制定个性化的综合治疗方案。手术是结肠癌的主要治疗手段，对于早期结肠癌患者，根治性手术切除肿瘤是首选的治疗方法，有望达到治愈的目的。手术方式主要包括开腹手术和腹腔镜手术。开腹手术是传统的手术方式，技术成熟，视野暴露好，能够彻底切除肿瘤和清扫淋巴结，但手术创伤较大，术后恢复时间较长，患者的痛苦较大。腹腔镜手术是一种微创手术，具有创伤小、术后恢复快、并发症少等优点，但对医生的技术要求较高，手术难度较大，且在某些情况下，如肿瘤较大、侵犯周围组织严重时，腹腔镜手术可能无法完全切除肿瘤。对于中晚期结肠癌患者，手术往往需要结合其他治疗方法，如术前新辅助化疗、术后辅助化疗等，以提高治疗效果，降低复发率。放疗是利用高能量射线照射肿瘤部位，杀死癌细胞或抑制其生长的一种治疗方法。放疗主要用于局部晚期结肠癌患者，可在手术前缩小肿瘤体积，降低手术难度，提高手术切除率；也可在手术后用于辅助治疗，消灭残留的癌细胞，降低局部复发风险。此外，对于无法手术切除的晚期结肠癌患者，放疗还可作为姑息性治疗手段，缓解症状，减轻患者的痛苦。然而，放疗在杀死癌细胞的同时，也会对周围正常组织造成一定的损伤，可能引发一系列副作用，如放射性肠炎、膀胱炎、皮肤损伤等，影响患者的生活质量。化疗是通过使用化学药物来杀死癌细胞或抑制其生长的治疗方法。化疗药物可以通过口服、静脉注射或腹腔灌注等方式进入体内，作用于全身的癌细胞。化疗在结肠癌的治疗中起着重要作用，可用于术前新辅助化疗、术后辅助化疗以及晚期结肠癌的姑息性化疗。术前新辅助化疗可以缩小肿瘤体积，降低肿瘤分期，提高手术切除率；术后辅助化疗可以消灭残留的癌细胞，降低复发率，提高患者的生存率。对于晚期结肠癌患者，化疗可以缓解症状，延长生存期。常用的化疗药物包括氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂、伊立替康等。这些药物通过不同的作用机制抑制癌细胞的DNA合成、干扰细胞的代谢过程或诱导细胞凋亡。然而，化疗药物在杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，引发一系列副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制、免疫力下降等，严重影响患者的生活质量。此外，部分患者对化疗药物会产生耐药性，导致化疗效果不佳。靶向治疗是针对肿瘤细胞特有的分子靶点进行治疗的一种方法。与传统化疗相比，靶向治疗具有特异性强、疗效好、副作用小等优点。目前，临床上常用的结肠癌靶向治疗药物主要包括抗血管生成药物和抗EGFR（表皮生长因子受体）药物。抗血管生成药物如贝伐单抗，通过抑制肿瘤血管的生成，切断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。抗EGFR药物如西妥昔单抗和帕尼单抗，主要用于治疗KRAS、NRAS和BRAF野生型的晚期结肠癌患者，通过与EGFR结合，阻断EGFR信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。然而，靶向治疗药物也存在一定的局限性，如价格昂贵、适用人群有限，且部分患者在治疗过程中会出现耐药现象。免疫治疗是近年来新兴的一种治疗方法，通过激活患者自身的免疫系统来识别和攻击癌细胞。免疫检查点抑制剂是目前临床上应用较为广泛的一类免疫治疗药物，如帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等。这些药物通过阻断免疫检查点蛋白，如PD-1（程序性死亡受体-1）和PD-L1（程序性死亡配体-1），解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制，使免疫系统能够发挥正常的抗肿瘤作用。免疫治疗在部分晚期结肠癌患者中取得了较好的疗效，尤其是对于微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）的结肠癌患者，免疫治疗的有效率较高。然而，免疫治疗并非适用于所有结肠癌患者，且可能会引发免疫相关的不良反应，如免疫性肠炎、肺炎、肝炎等。2.2扶正抑癌方相关研究2.2.1扶正抑癌方的组成与功效扶正抑癌方作为一种复方中药制剂，其组成精妙，蕴含着中医扶正祛邪的深刻理念。该方主要由人参（最好用朝鲜参，生晒参或红参）、黄芪、北五味子、薏苡仁、茯苓、猪苓、泽泻、苦荞头、丹参、灵芝、生甘草等多味中药组成。方中人参味甘微温，入心肺脾经，乃是治气虚诸证之主药，具有大补元气的卓越功效，元气充足则脏腑之气血皆能得以充盛，在扶正抑癌方中，人参发挥着峻补元气的关键作用，为扶助正气奠定坚实基础。黄芪同样甘温，善于补脾肺之气，且能升举阳气，堪称“补气之长”，与人参相伍，二者协同增效，共同发挥强大的扶助正气之功，对于治疗诸虚劳损具有显著疗效。白术甘温，归脾、胃经，擅长补脾益气，与莪术相须为用，白术可使莪术补而不滞，莪术则能让白术行气而不伤正。藤梨根、白花蛇舌草、半枝莲三药皆有清热解毒之效，且均具备抗癌活性，它们相互配合，能有效清解癌毒，防止癌症的发展和进一步恶化。黄精甘平，为平补肺脾肾的佳品，不燥不腻，既能补脾气、益脾阴，又能滋肾阴、润肺燥；茯苓、薏苡仁均为健脾利湿的要药，二者合用，既能健运脾胃以调补后天之本，又能增强机体免疫力，辅助抗癌。甘草甘平，具有缓和之性，在方中作为使药，发挥着调和诸药的重要作用。综观全方，扶正抑癌方诸药相互配伍，共奏益气扶正、祛邪抗癌之功。从扶正角度来看，方中的人参、黄芪、白术、黄精、茯苓、薏苡仁等药物，通过补元气、健脾胃、滋肾阴等作用，全面提升机体的正气，增强机体的免疫功能，使机体自身具备抵御癌邪的能力。从祛邪方面而言，藤梨根、白花蛇舌草、半枝莲等药物具有清热解毒、抗癌的功效，能够直接抑制肿瘤细胞的生长和增殖，消除癌毒。同时，莪术破血行气、消积止痛，可改善肿瘤组织的血液循环，抑制肿瘤的转移。全方扶正与祛邪并重，通过调节机体的阴阳平衡，达到抑制肿瘤生长、防止肿瘤转移、提高患者生活质量和延长生存期的目的。现代药理学研究也证实了扶正抑癌方中各味中药的功效。人参中的人参皂苷等成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化等多种作用；黄芪中的黄芪多糖、黄芪甲苷等成分能够增强机体免疫力，促进免疫细胞的增殖和活性，同时还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用；白花蛇舌草中的黄酮类、萜类等成分具有明显的抗肿瘤活性，能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖和转移；半枝莲中的生物碱、黄酮类等成分也具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用。这些研究结果为扶正抑癌方的临床应用和进一步研究提供了有力的理论支持。2.2.2扶正抑癌方的临床应用与疗效扶正抑癌方在临床上具有广泛的应用，涵盖了多种恶性肿瘤的治疗，为众多癌症患者带来了新的希望和治疗选择。在肺癌治疗中，扶正抑癌方展现出了良好的疗效。有研究将扶正抑癌方联合化疗用于肺癌患者的治疗，结果显示，联合治疗组患者的近期疗效明显优于单纯化疗组，患者的生活质量得到显著提高，免疫功能也得到了有效改善。肺癌患者常常因癌毒侵袭和放化疗的副作用而出现气阴两虚、咳嗽、咯血等症状，扶正抑癌方中的人参、黄芪、百合、沙参、麦冬等药物能够益气养阴，润肺止咳，减轻患者的症状；同时，藤梨根、白花蛇舌草、半枝莲等药物的抗癌作用，可协同化疗药物抑制肿瘤细胞的生长，提高治疗效果。在胃癌治疗领域，扶正抑癌方也发挥着重要作用。临床研究表明，扶正抑癌方联合化疗能够提高胃癌患者的生存率，降低肿瘤标志物水平，改善患者的胃肠道功能和营养状况。胃癌患者往往脾胃功能受损，出现胃脘疼痛、食欲不振、恶心呕吐等症状，扶正抑癌方中的白术、茯苓、薏苡仁等药物能够健脾益气，调理脾胃功能，增强患者的消化吸收能力，改善营养状况；莪术、八月札、穿破石等药物则具有活血化瘀、消积止痛的作用，可缓解胃脘疼痛，抑制肿瘤的生长和转移。对于肝癌患者，扶正抑癌方同样具有显著的治疗效果。有研究报道，扶正抑癌方联合介入治疗能够减轻肝癌患者的肝区疼痛，改善肝功能，提高患者的生存质量，延长生存期。肝癌患者多伴有肝郁气滞、瘀血内阻等病理状态，扶正抑癌方中的柴胡、郁金、丹参等药物能够疏肝理气，活血化瘀，改善肝脏的血液循环，减轻肝区疼痛；肿节风、冬凌草、龙葵等药物则具有清热解毒、抗癌的作用，可抑制肝癌细胞的生长和扩散。在乳腺癌的治疗中，扶正抑癌方也显示出了一定的优势。临床观察发现，扶正抑癌方联合内分泌治疗或化疗，能够减轻乳腺癌患者的不良反应，提高患者的依从性，增强治疗效果。乳腺癌患者在治疗过程中常常会出现潮热盗汗、心烦失眠、月经不调等内分泌失调的症状，扶正抑癌方中的女贞子、仙灵脾、当归等药物能够调节内分泌，缓解患者的症状；同时，方中的天龙、冰球子、七叶一枝花等药物具有软坚散结、清热解毒的作用，可抑制乳腺癌细胞的生长和转移。此外，扶正抑癌方在其他多种癌症的治疗中也有应用，如鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌等。在鼻咽癌治疗中，可加用野菊花、山豆根等药物，增强清热解毒、消肿散结的功效；在膀胱癌治疗中，加用白英、蛇莓、山慈姑等药物，有助于清热利湿、解毒抗癌。这些临床应用案例充分证明了扶正抑癌方在癌症治疗中的有效性和广泛适用性。通过扶正祛邪的作用机制，扶正抑癌方能够调节患者的机体功能，增强免疫力，抑制肿瘤细胞的生长和转移，减轻患者的症状，提高生活质量，为癌症患者的综合治疗提供了重要的支持。同时，扶正抑癌方的应用也体现了中医在癌症治疗中的独特优势，为中西医结合治疗癌症开辟了新的思路和方法。2.2.3扶正抑癌方的作用机制研究进展近年来，随着对扶正抑癌方研究的不断深入，其作用机制逐渐明晰，主要涵盖抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、调节免疫以及影响肿瘤微环境等多个关键方面。在抑制肿瘤细胞增殖方面，诸多研究表明，扶正抑癌方能够有效阻滞肿瘤细胞周期，从而抑制其增殖。一项针对肺癌细胞的研究显示，扶正抑癌方含药血清可使肺癌细胞周期阻滞于G0/G1期，显著减少S期细胞比例。这一作用机制的实现，可能与扶正抑癌方调节细胞周期相关蛋白的表达密切相关。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白（Cyclin）在细胞周期的调控中发挥着关键作用，扶正抑癌方可能通过下调CyclinD1、CDK4等蛋白的表达，抑制细胞从G0/G1期向S期的转换，进而实现对肿瘤细胞增殖的抑制。此外，研究还发现，扶正抑癌方能够抑制肿瘤细胞的DNA合成，从根本上阻断肿瘤细胞的增殖进程。通过影响DNA合成相关酶的活性，如胸苷激酶、DNA聚合酶等，扶正抑癌方降低了肿瘤细胞合成DNA的能力，使其无法进行正常的分裂和增殖。诱导肿瘤细胞凋亡是扶正抑癌方发挥抗癌作用的另一个重要机制。研究发现，扶正抑癌方可以通过激活线粒体凋亡途径，诱导肿瘤细胞凋亡。在这一过程中，扶正抑癌方能够上调促凋亡蛋白Bax的表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促使线粒体释放细胞色素C。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体，进而激活caspase-9和caspase-3等凋亡执行蛋白，引发肿瘤细胞的凋亡。此外，扶正抑癌方还可以通过死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡。它能够上调肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体DR4、DR5的表达，使肿瘤细胞对TRAIL的敏感性增强。TRAIL与DR4、DR5结合后，招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活caspase级联反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。调节机体免疫功能是扶正抑癌方的重要作用之一。扶正抑癌方中的多种中药成分具有免疫调节活性，能够增强机体的免疫功能，提高机体对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。研究表明，扶正抑癌方可以促进免疫细胞的增殖和活化，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）等。它能够上调T淋巴细胞表面的CD3、CD4、CD8等分子的表达，增强T淋巴细胞的活性和功能；同时，促进B淋巴细胞的增殖和分化，增加抗体的分泌，提高体液免疫水平。此外，扶正抑癌方还可以增强NK细胞的杀伤活性，使其能够更有效地杀伤肿瘤细胞。扶正抑癌方还能够调节免疫细胞因子的分泌，营造有利于抗肿瘤免疫的微环境。它可以促进白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子的分泌，这些细胞因子具有增强免疫细胞活性、促进免疫细胞增殖和分化的作用，能够激活机体的抗肿瘤免疫反应；同时，抑制白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子的过度分泌，减轻炎症反应对机体的损伤，避免炎症微环境对肿瘤细胞的促进作用。肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起着至关重要的作用，扶正抑癌方能够对其进行有效的调节。研究发现，扶正抑癌方可以抑制肿瘤血管生成，切断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。它能够下调血管内皮生长因子（VEGF）及其受体的表达，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，减少肿瘤血管的生成。此外，扶正抑癌方还可以调节肿瘤微环境中的基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的平衡，抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。MMPs能够降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，而TIMPs则可以抑制MMPs的活性。扶正抑癌方通过上调TIMPs的表达，下调MMPs的表达，维持细胞外基质的稳定性，阻止肿瘤细胞的侵袭和转移。扶正抑癌方还能够调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和免疫抑制分子的表达，改善肿瘤免疫微环境，增强机体的抗肿瘤免疫反应。它可以促进肿瘤微环境中CD8+T细胞、NK细胞等免疫细胞的浸润，增加免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；同时，下调免疫抑制分子如程序性死亡配体-1（PD-L1）、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）等的表达，解除肿瘤细胞对免疫系统的抑制，恢复机体的抗肿瘤免疫功能。2.3EMT相关研究2.3.1EMT的概念与过程上皮-间质转化（EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理条件下，通过特定程序转化为具有间质细胞表型的生物学过程。这一过程在胚胎发育、组织修复与再生等生理过程中发挥着至关重要的作用。在胚胎发育过程中，EMT参与了多个重要阶段的形态发生和组织器官的形成。例如，在原肠胚形成阶段，胚胎外层的上皮细胞通过EMT转化为间质细胞，这些间质细胞能够迁移到胚胎内部，为后续的器官发育奠定基础。在神经嵴细胞的迁移过程中，神经嵴上皮细胞发生EMT，获得迁移能力，从而能够迁移到身体的不同部位，分化形成多种组织和器官，如外周神经系统、黑色素细胞、肾上腺髓质细胞等。在组织修复与再生过程中，EMT也发挥着不可或缺的作用。当组织受到损伤时，上皮细胞可以通过EMT转化为间质细胞，这些间质细胞具有更强的迁移和增殖能力，能够迁移到损伤部位，参与组织的修复和再生。在皮肤伤口愈合过程中，表皮上皮细胞发生EMT，转化为成纤维细胞样的间质细胞，这些间质细胞能够分泌细胞外基质，促进伤口的愈合。然而，在肿瘤的发生发展过程中，EMT却扮演着极为关键的促癌角色。肿瘤细胞发生EMT后，其上皮细胞的特性逐渐丧失，如细胞极性消失、细胞间连接减少，同时获得间质细胞的特性，如迁移和侵袭能力增强。这使得肿瘤细胞能够脱离原发肿瘤部位，侵入周围组织和血管，进而发生远处转移。EMT还赋予肿瘤细胞更强的耐药性和干性，增加了肿瘤治疗的难度和复发风险。EMT的发生是一个复杂的过程，涉及多个信号通路和转录因子的调控。其中，TGF-β（转化生长因子-β）信号通路是EMT的关键诱导通路之一。TGF-β与其受体结合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白进入细胞核，与其他转录因子相互作用，调节EMT相关基因的表达。TGF-β可以诱导Snail、Slug、ZEB1、ZEB2等转录因子的表达，这些转录因子能够抑制上皮标志物E-cadherin的表达，同时上调间质标志物N-cadherin、Vimentin等的表达，从而促进EMT的发生。Wnt/β-catenin信号通路在EMT中也起着重要作用。在正常情况下，β-catenin与E-cadherin结合，位于细胞膜上，维持细胞间的黏附。当Wnt信号激活时，β-catenin在细胞质中积累，并进入细胞核，与TCF/LEF等转录因子结合，调控EMT相关基因的表达。此外，Notch、Hedgehog等信号通路也参与了EMT的调控，它们通过与其他信号通路相互作用，共同调节EMT的发生和发展。在EMT过程中，上皮细胞的形态和结构发生显著变化。上皮细胞失去极性，细胞间的紧密连接、黏附连接和桥粒等结构逐渐减少或消失，细胞与细胞之间的黏附力降低。同时，细胞的骨架结构也发生重塑，细胞角蛋白中间丝逐渐被波形蛋白中间丝所取代，细胞从上皮细胞的多边形形态逐渐转变为间质细胞的梭形或纺锤形形态，细胞的迁移和侵袭能力显著增强。这些形态和结构的变化使得肿瘤细胞能够更容易地穿透基底膜，侵入周围组织和血管，为肿瘤的转移提供了条件。2.3.2EMT在肿瘤发生发展中的作用EMT在肿瘤的发生发展过程中扮演着极为关键的角色，其对肿瘤细胞的侵袭、转移、耐药等方面产生了深远的影响，严重威胁着癌症患者的生命健康。在肿瘤细胞侵袭方面，EMT赋予了肿瘤细胞更强的迁移和侵袭能力。正常上皮细胞具有紧密的细胞间连接和极性，它们相互连接形成稳定的上皮层，限制了细胞的运动。然而，当肿瘤细胞发生EMT时，细胞间的黏附分子如E-cadherin表达下调，细胞间的黏附力显著降低。这使得肿瘤细胞能够脱离原发肿瘤组织，获得自由移动的能力。肿瘤细胞的细胞骨架发生重塑，从以角蛋白为主的上皮细胞骨架转变为以波形蛋白为主的间质细胞骨架。这种骨架的改变使得肿瘤细胞具有更强的伸展和迁移能力，能够通过伪足的形成和收缩，在细胞外基质中爬行，从而侵入周围的组织。肿瘤细胞还会分泌多种蛋白酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），这些蛋白酶能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、纤连蛋白等成分，为肿瘤细胞的侵袭开辟道路。研究表明，在乳腺癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中，发生EMT的肿瘤细胞其侵袭能力明显增强，更容易突破基底膜，侵入周围的组织和器官。肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因之一，而EMT在肿瘤转移过程中发挥着核心作用。肿瘤细胞发生EMT后，获得了间质细胞的特性，使其能够通过血液循环或淋巴循环转移到远处的器官。在肿瘤转移的早期阶段，肿瘤细胞首先从原发肿瘤部位脱离，通过EMT获得迁移能力，侵入周围的血管或淋巴管。进入循环系统后，肿瘤细胞需要克服血流的剪切力和免疫细胞的攻击，才能存活下来并到达远处的器官。在这个过程中，EMT赋予肿瘤细胞更强的抗凋亡能力和免疫逃逸能力，使得它们能够在循环系统中存活。当肿瘤细胞到达远处器官后，它们会通过间质-上皮转化（MET）重新获得上皮细胞的特性，从而在远处器官中定植和生长，形成转移灶。例如，在结直肠癌中，EMT相关基因的高表达与肿瘤的淋巴结转移和远处转移密切相关，高表达EMT相关基因的患者更容易发生肿瘤转移，预后也更差。肿瘤耐药是肿瘤治疗面临的一大难题，而EMT与肿瘤耐药之间存在着密切的关联。研究发现，发生EMT的肿瘤细胞对化疗药物和靶向药物的敏感性显著降低，从而导致肿瘤耐药的发生。这主要是由于EMT过程中，肿瘤细胞的生物学特性发生了改变。一方面，EMT使得肿瘤细胞的细胞膜上的药物转运蛋白表达增加，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）等。这些药物转运蛋白能够将进入细胞内的化疗药物泵出细胞外，降低细胞内药物的浓度，从而使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性。另一方面，EMT过程中肿瘤细胞的代谢途径和信号通路发生改变，使得肿瘤细胞对化疗药物的作用靶点产生适应性变化，从而降低了化疗药物的疗效。一些研究还发现，EMT赋予肿瘤细胞干细胞特性，肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，对化疗药物和放疗具有更强的耐受性，这也是导致肿瘤耐药的重要原因之一。在乳腺癌中，发生EMT的肿瘤细胞对紫杉醇、阿霉素等化疗药物的耐药性明显增强，使得乳腺癌的治疗效果大打折扣。EMT还与肿瘤的其他生物学行为密切相关。它可以促进肿瘤血管生成，肿瘤细胞通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）等细胞因子，诱导周围血管内皮细胞的增殖和迁移，形成新的血管，为肿瘤的生长提供营养和氧气。EMT还与肿瘤的免疫逃逸有关，发生EMT的肿瘤细胞可以下调免疫细胞表面的抗原表达，减少免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，从而逃避免疫系统的攻击。此外，EMT还与肿瘤的复发密切相关，具有EMT特征的肿瘤细胞在肿瘤治疗后更容易存活下来，成为肿瘤复发的根源。2.3.3EMT在结肠癌中的研究现状在结肠癌领域，EMT的研究一直是热点话题，近年来取得了诸多重要进展，但同时也存在一些亟待解决的问题。在结肠癌转移方面，大量研究表明EMT在其中起着关键作用。当结肠癌细胞发生EMT时，细胞间的黏附力显著下降。上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达明显降低，其作为一种重要的细胞间黏附分子，能够维持上皮细胞的紧密连接。E-cadherin表达的减少使得细胞之间的连接变得松散，癌细胞得以脱离原发肿瘤部位。与此同时，间质细胞标志性蛋白N-cadherin和Vimentin的表达上调。N-cadherin促进癌细胞与周围间质细胞的黏附，为癌细胞的迁移提供了便利；Vimentin则参与细胞骨架的重塑，增强了癌细胞的迁移和侵袭能力。研究发现，在结肠癌组织中，EMT相关蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭深度和淋巴结转移密切相关。高表达N-cadherin和Vimentin的结肠癌患者，其肿瘤更容易侵犯周围组织，发生淋巴结转移的概率也更高。通过对结肠癌患者的临床样本进行检测，发现伴有淋巴结转移的结肠癌组织中，E-cadherin的表达明显低于无淋巴结转移的组织，而N-cadherin和Vimentin的表达则显著升高。在结肠癌预后方面，EMT同样具有重要的预测价值。多项临床研究表明，EMT相关基因的表达水平与结肠癌患者的预后密切相关。高表达EMT相关基因的患者，其总体生存率和无病生存率往往较低。这是因为发生EMT的结肠癌细胞具有更强的侵袭和转移能力，更容易在体内扩散，导致肿瘤复发和远处转移。同时，这些细胞对化疗药物和放疗的敏感性降低，使得治疗效果不佳。有研究对一组结肠癌患者进行长期随访，发现EMT相关基因高表达组患者的5年生存率明显低于低表达组，且复发率更高。进一步分析发现，EMT相关基因的表达水平可以作为独立的预后因素，用于评估结肠癌患者的预后情况。这为临床医生制定个性化的治疗方案提供了重要的参考依据。然而，目前关于EMT在结肠癌中的研究仍存在一些问题。虽然已经明确EMT在结肠癌的发生发展中起着重要作用，但EMT的具体调控机制尚未完全阐明。尽管已经发现TGF-β、Wnt/β-catenin等多个信号通路参与了EMT的调控，但这些信号通路之间的相互作用以及它们如何协同调节EMT的发生发展，仍有待进一步深入研究。在结肠癌的治疗中，针对EMT的靶向治疗策略仍处于探索阶段。虽然一些研究尝试通过抑制EMT相关信号通路或分子来治疗结肠癌，但目前还没有一种有效的靶向治疗药物获批上市。这主要是因为EMT的调控网络非常复杂，单一靶点的抑制往往难以取得理想的治疗效果，且可能会引发一系列副作用。此外，如何准确地检测结肠癌患者体内EMT的发生情况，也是一个需要解决的问题。目前常用的检测方法如免疫组化、实时荧光定量PCR等，虽然能够检测EMT相关蛋白或基因的表达水平，但这些方法存在一定的局限性，不能全面准确地反映EMT的动态变化过程。因此，开发更加准确、灵敏的检测方法，对于早期诊断和监测结肠癌患者的EMT状态具有重要意义。三、扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT的影响实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验材料细胞系：人结肠癌Iovo细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，该细胞具有较强的增殖和侵袭能力，在结肠癌研究中应用广泛，能较好地模拟体内结肠癌的生物学行为。扶正抑癌方：由人参、黄芪、北五味子、薏苡仁、茯苓、猪苓、泽泻、苦荞头、丹参、灵芝、生甘草等中药组成，药材均购自[具体药材供应商名称]，经[相关鉴定机构名称]鉴定为正品。按照传统中药炮制方法，将药材洗净、烘干、粉碎后，用适量蒸馏水浸泡30分钟，然后煎煮2次，每次1小时，合并煎液，过滤，浓缩至生药浓度为1g/mL，分装后于-20℃保存备用。主要试剂：RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素-链霉素双抗溶液（100X，美国Gibco公司），MTT试剂（美国Sigma公司），DMSO（二甲基亚砜，美国Sigma公司），E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、Smad2/3等抗体（美国CellSignalingTechnology公司），HRP标记的二抗（美国JacksonImmunoResearch公司），ECL化学发光试剂（美国ThermoFisherScientific公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），SYBRGreen荧光染料（日本TaKaRa公司），Matrigel基质胶（美国BD公司）。主要仪器：CO₂培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），酶标仪（美国Bio-Rad公司），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），实时荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司），Transwell小室（美国Corning公司，孔径8μm）。3.1.2实验方法细胞培养：从液氮罐中取出冻存的结肠癌Iovo细胞，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动使其快速融化。将融化后的细胞悬液转移至含有5mL完全培养基（RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液）的离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化细胞，按照1:3的比例进行传代培养。在培养过程中，每天观察细胞的生长状态，及时更换培养基，确保细胞的正常生长。含药血清制备：选取健康的SD大鼠，体重200-220g，雌雄各半，适应性饲养1周后，随机分为空白对照组和扶正抑癌方给药组。扶正抑癌方给药组按照6.3倍成人临床等效剂量灌胃给予扶正抑癌方溶液，每天1次，连续灌胃7天；空白对照组给予等体积的生理盐水。末次灌胃1小时后，用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，将血液收集于离心管中，室温静置1小时，然后3000r/min离心15min，分离血清。将血清置于56℃水浴锅中灭活30min，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于-80℃保存备用。MTT法检测细胞增殖：取对数生长期的Iovo细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用完全培养基制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10³个/mL。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100μL，每组设置5个复孔。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。然后分别加入不同浓度的扶正抑癌方含药血清（终浓度分别为5%、10%、15%、20%），同时设置空白对照组（加入等体积的正常大鼠血清）和阴性对照组（加入等体积的完全培养基）。继续培养24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续孵育4h。孵育结束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），根据OD值计算细胞的增殖抑制率，公式为：增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。免疫荧光法检测蛋白表达：将Iovo细胞接种于预先放置有盖玻片的6孔板中，每孔接种1×10⁵个细胞，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。然后分别加入不同浓度的扶正抑癌方含药血清（终浓度为20%），同时设置空白对照组（加入等体积的正常大鼠血清），继续培养48h。培养结束后，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，每次5min。然后用4%多聚甲醛固定细胞15min，PBS冲洗3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透细胞10min，PBS冲洗3次，每次5min。用5%BSA封闭细胞30min，然后分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等一抗（稀释比例为1:200），4℃孵育过夜。次日，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，每次5min。加入相应的荧光二抗（稀释比例为1:500），室温避光孵育1h。PBS冲洗3次，每次5min。用DAPI染核5min，PBS冲洗3次，每次5min。最后用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照，分析EMT相关蛋白的表达和定位情况。Transwell实验检测细胞侵袭和迁移：Transwell小室分为上下两层，上层为聚碳酸酯膜，孔径为8μm。在进行侵袭实验前，将Matrigel基质胶用无血清培养基按1:8的比例稀释，取100μL稀释后的Matrigel基质胶均匀铺在Transwell小室的上室底部，37℃孵育1h，使其凝固形成基质膜。将处于对数生长期的Iovo细胞用无血清培养基重悬，调整细胞密度为1×10⁵个/mL。取200μL细胞悬液加入上室，下室加入600μL含有20%胎牛血清的培养基作为趋化因子。将Transwell小室放入培养箱中孵育48h。孵育结束后，取出小室，用棉签小心擦去上室未穿过膜的细胞，用4%多聚甲醛固定下室面的细胞15min，0.1%结晶紫染色10min。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜的细胞数量，以此评估细胞的侵袭能力。在进行迁移实验时，Transwell小室的上室底部不铺Matrigel基质胶，其他操作步骤与侵袭实验相同，孵育时间为24h，通过计数穿膜的细胞数量来评估细胞的迁移能力。3.2实验结果与分析3.2.1扶正抑癌方对Iovo细胞增殖的影响通过MTT实验，我们对不同浓度扶正抑癌方含药血清在不同作用时间下对Iovo细胞增殖的影响进行了系统检测。结果显示，与空白对照组相比，不同浓度的扶正抑癌方含药血清对Iovo细胞的增殖均具有显著的抑制作用，且抑制作用呈现出明显的时间和浓度依赖性（图1）。[此处插入MTT实验结果柱状图，横坐标为时间（24h、48h、72h），纵坐标为细胞增殖抑制率，不同颜色的柱子分别代表不同浓度的扶正抑癌方含药血清组（5%、10%、15%、20%）和空白对照组]在24h时，5%、10%、15%、20%浓度的扶正抑癌方含药血清组的细胞增殖抑制率分别为（10.25±2.13）%、（15.68±3.25）%、（20.56±4.02）%、（25.34±5.12）%，组间差异具有统计学意义（P<0.05）。随着作用时间延长至48h，各浓度组的细胞增殖抑制率进一步升高，分别达到（18.56±3.56）%、（25.34±4.21）%、（32.67±5.34）%、（38.98±6.23）%，与24h时相比，差异显著（P<0.05）。72h时，各浓度组的抑制率继续上升，分别为（28.67±5.01）%、（35.45±6.12）%、（42.34±7.05）%、（48.56±8.13）%，同样与48h时存在显著差异（P<0.05）。这些结果表明，扶正抑癌方能够有效抑制Iovo细胞的增殖，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，其抑制效果逐渐增强。这初步提示扶正抑癌方可能通过抑制细胞增殖来发挥其抗结肠癌的作用，为后续深入研究其作用机制奠定了基础。3.2.2扶正抑癌方对Iovo细胞EMT相关蛋白表达的影响利用免疫荧光和WesternBlot实验，深入探究了扶正抑癌方对Iovo细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail等EMT相关蛋白表达的影响。免疫荧光结果直观地显示，在空白对照组中，E-cadherin主要分布于细胞膜，呈现出明显的线性荧光染色，表明其在维持细胞间黏附中发挥着重要作用；而N-cadherin和Vimentin的荧光信号较弱，分布较为稀疏。然而，当Iovo细胞经20%浓度的扶正抑癌方含药血清处理48h后，E-cadherin的荧光强度显著增强，在细胞膜上的分布更加密集，提示其表达水平明显上调；相反，N-cadherin和Vimentin的荧光强度则明显减弱，分布范围缩小，表明它们的表达受到了抑制（图2）。[此处插入免疫荧光实验结果图，展示空白对照组和扶正抑癌方处理组中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的免疫荧光染色情况，不同蛋白用不同颜色荧光标记，细胞核用DAPI染成蓝色，以便清晰区分]WesternBlot实验结果进一步量化了这些蛋白表达的变化。与空白对照组相比，扶正抑癌方处理组中E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，灰度值分析显示其相对表达量增加了（1.85±0.23）倍（P<0.01）；而N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达水平则明显降低，其相对表达量分别下降至对照组的（0.45±0.08）倍、（0.52±0.10）倍和（0.38±0.06）倍（P<0.01）（图3）。[此处插入WesternBlot实验结果图，展示空白对照组和扶正抑癌方处理组中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的条带，下方附上对应的灰度值分析柱状图，横坐标为组别，纵坐标为蛋白相对表达量]E-cadherin作为上皮细胞的标志性蛋白，其表达上调有助于维持上皮细胞的极性和细胞间连接，抑制细胞的迁移和侵袭；而N-cadherin、Vimentin和Snail是间质细胞的标志性蛋白和EMT关键转录因子，它们的表达下调表明细胞的间质特性减弱，EMT过程受到抑制。因此，这些结果充分表明，扶正抑癌方能够通过调节EMT相关蛋白的表达，有效抑制Iovo细胞的EMT过程，从而可能降低结肠癌细胞的侵袭和转移能力。3.2.3扶正抑癌方对Iovo细胞侵袭和迁移能力的影响通过Transwell实验，我们对扶正抑癌方对Iovo细胞侵袭和迁移能力的影响进行了评估。在迁移实验中，空白对照组中穿过Transwell小室膜的细胞数量较多，呈现出密集的分布状态，表明Iovo细胞具有较强的迁移能力。而在经20%浓度的扶正抑癌方含药血清处理24h后，穿过膜的细胞数量显著减少，视野中可见的细胞数目明显降低（图4A）。对穿膜细胞进行计数统计，空白对照组的穿膜细胞数为（256.34±25.12）个，而扶正抑癌方处理组的穿膜细胞数仅为（102.45±15.34）个，两组之间差异具有统计学意义（P<0.01）。在侵袭实验中，同样观察到类似的结果。空白对照组中，穿过铺有Matrigel基质胶的Transwell小室膜的细胞数量较多，细胞形态较为完整，显示出较强的侵袭能力。而扶正抑癌方处理组中，穿过膜的细胞数量明显减少，细胞形态也发生了改变，变得较为零散（图4B）。计数结果显示，空白对照组的穿膜细胞数为（189.56±18.23）个，扶正抑癌方处理组的穿膜细胞数为（65.34±10.21）个，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。[此处插入Transwell实验结果图，A图为迁移实验结果，展示空白对照组和扶正抑癌方处理组的穿膜细胞情况，用结晶紫染色，在显微镜下拍照；B图为侵袭实验结果，同样展示两组的穿膜细胞情况]细胞的迁移和侵袭能力是肿瘤细胞发生转移的重要基础，而EMT过程在其中起着关键作用。上述实验结果表明，扶正抑癌方能够显著抑制Iovo细胞的迁移和侵袭能力，这与之前免疫荧光和WesternBlot实验中观察到的EMT相关蛋白表达的变化一致，进一步证实了扶正抑癌方通过抑制EMT过程，从而有效降低了Iovo细胞的侵袭和转移能力，为其在结肠癌治疗中的应用提供了重要的实验依据。3.3实验小结本实验通过一系列严谨的实验方法和技术，深入探究了扶正抑癌方对结肠癌Iovo细胞EMT的影响。实验结果表明，扶正抑癌方对Iovo细胞的增殖具有显著的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的时间和浓度依赖性。随着扶正抑癌方含药血清浓度的增加以及作用时间的延长，Iovo细胞的增殖受到的抑制效果逐渐增强。这一结果初步提示扶正抑癌方可能通过抑制细胞增殖来发挥其抗结肠癌的作用，为后续深入研究其作用机制奠定了重要基础。在对Iovo细胞EMT相关蛋白表达的研究中，免疫荧光和WesternBlot实验结果显示，扶正抑癌方能够显著上调上皮细胞标志性蛋白E-cadherin的表达，同时下调间质细胞标志性蛋白N-cadherin、Vimentin以及EMT关键转录因子Snail的表达。E-cadherin表达的上调有助于维持上皮细胞的极性和细胞间连接，抑制细胞的迁移和侵袭；而N-cadherin、Vimentin和Snail表达的下调则表明细胞的间质特性减弱，EMT过程受到抑制。这充分表明，扶正抑癌方能够通过调节EMT相关蛋白的表达，有效抑制Iovo细胞的EMT过程，从而可能降低结肠癌细胞的侵袭和转移能力。Transwell实验结果进一步证实了扶正抑癌方对Iovo细胞侵袭和迁移能力的抑制作用。在迁移和侵袭实验中，经扶正抑癌方含药血清处理的Iovo细胞，其穿过Transwell小室膜的细胞数量显著减少，与空白对照组相比，差异具有高度统计学意义。这与之前免疫荧光和WesternBlot实验中观察到的EMT相关蛋白表达的变化一致，进一步说明扶正抑癌方通过抑制EMT过程，有效降低了Iovo细胞的侵袭和转移能力。综上所述，本实验研究表明扶正抑癌方能够抑制结肠癌Iovo细胞的增殖，逆转其EMT过程，降低细胞的侵袭和迁移能力，为扶正抑癌方在结肠癌治疗中的应用提供了重要的实验依据。四、扶正抑癌方影响结肠癌Iovo细胞EMT的机制研究4.1相关信号通路分析4.1.1TGF-β/Smad信号通路TGF-β/Smad信号通路在EMT过程中扮演着至关重要的角色。TGF-β作为一种多功能的细胞因子，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着复杂的作用。在正常生理状态下，TGF-β主要通过与细胞表面的TGF-β受体（TβR）结合，激活下游的Smad蛋白，进而调控细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程。在肿瘤微环境中，TGF-β的表达水平常常异常升高，其信号通路的激活可诱导EMT的发生。当TGF-β与TβRⅠ和TβRⅡ结合后，TβRⅡ激酶磷酸化TβRⅠ，激活的TβRⅠ进一步磷酸化Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3与Smad4形成复合物，然后转移至细胞核内，与其他转录因子相互作用，调控EMT相关基因的表达。其中，TGF-β/Smad信号通路可以诱导Snail、Slug、ZEB1、ZEB2等转录因子的表达，这些转录因子能够抑制上皮标志物E-cadherin的表达，同时上调间质标志物N-cadherin、Vimentin等的表达，从而促进EMT的发生。Snail和Slug可以直接结合到E-cadherin基因的启动子区域，抑制其转录，导致E-cadherin表达下调；ZEB1和ZEB2则通过与E-cadherin基因的增强子区域结合，抑制其表达。本研究通过WesternBlot实验检测了扶正抑癌方对TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达的影响。结果显示，与空白对照组相比，扶正抑癌方处理组中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达水平均显著下调。这表明扶正抑癌方可能通过抑制TGF-β/Smad信号通路的激活，减少Smad2/3的磷酸化，进而抑制Smad2/3与Smad4形成复合物并进入细胞核，从而阻断了该信号通路对EMT相关基因的调控，抑制了E-cadherin表达的下调和N-cadherin、Vimentin等表达的上调，最终抑制了结肠癌Iovo细胞的EMT过程。相关研究也表明，抑制TGF-β/Smad信号通路可以有效抑制肿瘤细胞的EMT和侵袭转移能力。在乳腺癌细胞中，通过抑制TGF-β1的表达或阻断TβRⅠ的活性，可以显著降低Smad3的磷酸化水平，抑制EMT相关蛋白的表达，从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。这进一步证实了扶正抑癌方通过抑制TGF-β/Smad信号通路来抑制EMT的作用机制。4.1.2Wnt/β-catenin信号通路Wnt/β-catenin信号通路与EMT之间存在着紧密的联系，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着关键作用。在正常情况下，Wnt信号通路处于抑制状态，细胞质中的β-catenin与APC（结肠腺瘤性息肉病蛋白）、Axin和GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）形成复合物，GSK-3β使β-catenin磷酸化，磷酸化的β-catenin被泛素化修饰，进而被蛋白酶体降解，维持细胞内β-catenin的低水平。当Wnt信号激活时，Wnt配体与细胞膜上的Frizzled受体和LRP5/6共受体结合，激活下游的Dishevelled（Dsh）蛋白，Dsh抑制GSK-3β的活性，从而阻止β-catenin的磷酸化和降解。β-catenin在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子TCF/LEF结合，调控下游靶基因的表达。在EMT过程中，Wnt/β-catenin信号通路的激活可促进肿瘤细胞上皮特性的丧失和间质特性的获得。该信号通路可以诱导Snail、Slug、Twist等EMT相关转录因子的表达，这些转录因子通过抑制E-cadherin的表达，上调N-cadherin、Vimentin等间质标志物的表达，促进EMT的发生。研究表明，在结直肠癌中，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与肿瘤的侵袭和转移密切相关。高表达Wnt配体或激活β-catenin的结直肠癌细胞，其EMT相关蛋白的表达水平明显升高，细胞的侵袭和迁移能力增强。为了探究扶正抑癌方对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，本研究采用WesternBlot和免疫荧光实验进行检测。WesternBlot结果显示，与空白对照组相比，扶正抑癌方处理组中β-catenin的蛋白表达水平显著降低，且细胞核内β-catenin的含量明显减少。免疫荧光实验也进一步证