（正式版）DB21∕T 2433-2015 《树莓组培育苗技术规程》

树莓组培育苗技术规程Technicalregulationontissueculture2015-03-01发布辽宁省质量技术监督局发布I前言 Ⅲ 12规范性引用文件 1 1 2 2 2 2 25消毒灭菌 2 25.2培养基高压灭菌 25.3接种器具灭菌 26初代培养 36.1培养基配制 36.2培养环境条件 36.3培养方法 37继代培养 37.1培养基配制 37.2培养环境条件 37.3培养方法 3 37.3.1按理论计算 37.3.2实际计算 38生根培养 48.1培养基配制 4 48.3培养方法 4 4 4 4 49.2.1清除培养基 4 49.2.3移栽后的管理 49.2.3.1移植后10d之内 59.2.3.2移栽后10d～19d 59.2.3.3生长20d～30d 510技术档案 5附录A(规范性附录)树莓组培苗木质量分级 6附录B(资料性附录)树莓组培苗移栽病虫害防治药剂用量 7附录C(资料性附录)组培室的构成及基本设备 8本标准依据GB/T1.1-2009的规则起草。本标准的附录A为规范性附录，附录B、C为资料性附录。本标准由辽宁省林业厅提出并归口。本标准主要起草单位：阜新市林业种苗管理站、阜蒙县林业科技示范中心。本标准主要起草人：张秀艳、齐金海、丁立娜、曹颖、武春艳、李钱、于丹、杨树勇、丁瑞军、田明芳、赵方明、张志会、刘金城、宋春颖、付玉、李畅、霍旺、柳士东、王国兴、舒红、胡玉珠、杨志勇、李亚辉、陈宝财、张莹、龙忠勤、姬东、扈延伍、董芷维、齐金艳、李宁、贾斌英、柴旭光、杨爱风。1凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质植物组织培养所利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)组织(如形成层、表2皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，称为外植体。又称诱导芽培养，外植体接种到培养基上以后，一般先放在培养室进行弱光培养，首先要得到无菌的材料，然后逐渐促进材料的分化和生长，这是试管苗的第一代，称初代培养。继代培养Subculture又称分化培养，初代培养以后通过不断调试培养基和转接试管苗，使试管苗数量很快扩大，这种不断转苗增殖的过程称为继代培养。生根培养Rootingculture在培养基上，利用从茎表皮细胞分裂形成突起的根原基，进一步从表皮培养形成根的过程。4材料的选择4.1选择的部位应选择树莓的茎尖、茎段。4.2取材季节的选择在春季芽开始萌发或正萌发生长时取材。4.3器官发育年龄的选择以当年枝的嫩芽、嫩枝段做材料，分生能力强，形态建成快。4.4取材的大小茎尖、茎段长0.5cm~1.0cm,茎段每段留芽1个~2个。5.1外植体消毒灭菌用流水冲洗2h以上，拿到超净工作台上，用75%酒精冲洗30s～40s,无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞处理3min～4min,无菌水冲洗5次。5.2培养基高压灭菌用高压灭菌锅在压力1.1MPa,温度为121℃下，灭菌20min。5.3接种器具灭菌3剪子、镊子、500ml烧杯(处理外植体使用)用牛皮纸包装，做到无漏洞，捆绑好，用高压灭菌锅在压力1.1MPa,温度为121℃下，灭菌20min。6初代培养6.1培养基配制6.2培养环境条件在无菌的环境下，培养室温度23℃~25℃,湿度20%～30%,光照强度22001x～25001x,整齐摆放在培养架(五层，每层间隔45cm,透光)上，培养室技术要求参照附录C。在植物生长季节取树莓茎，将叶片去掉，并将茎剪成0.5cm~1.0cm带芽茎段，休眠芽预先剥除鳞片，采用75%酒精消毒30s～40s,0.1%升汞水溶液消毒处理3min～4min,再用无菌水洗涤5次。然后在超净工作台上接种在初代培养基上。7继代培养7.1培养基配制7.2培养环境条件在无菌的环境下，培养室温度23℃~25℃,湿度20%～30%,光照强度22001x～25001x,整齐摆放在培养架(五层，每层间隔45cm,透光)上，培养室技术要求参照附录C。7.3培养方法外植体长满培养瓶，就需转入到新的增殖培养基中，在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm~1.2cm插入培养瓶内，三段为一簇，每瓶6簇。长满瓶后重复操作，这样一代一代地继续下去，就形成了树莓组织苗的无性繁殖体系。树莓扩繁方法有分株繁殖方式。7.4增殖速率的计算7.4.1按理论计算1年内能繁殖试管苗的数量，可用式(1)计算y=mx”…………………式中：y为年繁殖苗数；x为每个培养周期增殖的倍数；n为全年可增殖的周期次数。7.4.2实际计算4从接种开始，由1个芽经过1年繁殖后，应记录转接次数，统计实际得到的苗数，然后可以计算出实际繁殖周期和每个周期试管苗增殖的倍数。实际繁殖数往往低于理论计算数。8生根培养8.1培养基配制生根培养所用培养基为1/2MS+BA0.3mg/L+IAA0.2mg/L+糖15g/L+琼脂4.8g/L。8.2培养室环境条件培养室温度18℃~25℃,湿度20%～30%,光照强度22001x～25001x,培养室技术要求参照附录C。8.3培养方法在生根培养基中诱导生根。树莓采用培养基瓶内一步生根法生根。将生长健壮的茎尖接入生根培养基中诱导生。在无菌操净工作台上，用接种剪子和镊子剪段1.0cm~1.2cm插入培养瓶内，每瓶插10株~8.4根的生长根细长，通常有1条～5条根，颜色白色。正在生长的白色根吸收力强，移苗容易成活。9组培苗的移栽9.1移苗的季节组培苗的生长不受季节的影响，如果温室条件很好，夏季能降温，达到四季如春，则移苗也没有季节性。但组培苗移入温室的时候以冬季和早春为最好，经过冬季和早春的移苗和生长，到春暖花开的季节移苗到大田，再经过田间较长时间的生长而成为理想的壮苗。9.2移苗的方法9.2.1清除培养基组培苗从瓶中取出，放在盛有20℃左右的水中，将附着在根上的培养基清洗掉，洗时注意不能伤根，对生根过长的根要适当修剪。再放入另一盆温水中清洗1次，将培养基彻底洗掉，以免残留的培养基引起污染和霉烂。最后蘸1000倍～2000倍海藻素类(促进生根)溶液后移栽。9.2.2苗床准备在温室大棚内准备好移苗床。苗床要铺上装好基质的穴盘。基质要求排水性和透气性良好，同时也要有一定的保水性。采用草炭和沙子混合，按照比例为1:1。对基质进行消毒，用500倍～800倍敌克松溶液喷洒基质。70孔穴盘，每个孔种3棵，均匀分布在穴孔内，先挖一小穴，舒展根系，深度以叶片不接触基质、叶心不能埋入土内为宜，种植后轻轻镇压。种好后用细喷雾器喷水，冲掉叶面上可能沾着的基质，并使基质和根系密切接触。9.2.3移栽后的管理59.2.3.1移栽后10d之内湿度：要保持空气湿度在90%左右，因为刚移栽的试管苗很嫩，叶片水分蒸发量大，而根系吸水功能差。有条件的最好用间歇喷雾，没有间歇喷雾的条件，则用塑料拱棚保湿。温度：移苗期间的温度最好保持在20℃~25℃左右，最低不要低于15℃,最高不要超过28℃。处于一个温度比较低的环境下，根系生长比较快，地上部生理活动比较缓慢，可逐步恢复生机，适应外界环境。光照：光照一般不要过强和过弱，保护地冬季、早春光照一般在100001x左右是合适的。气：每天一早一晚各通风1次，每次通风以湿度降到60%～70%。9.2.3.2移栽后10d～19d根系有一定的吸收功能，叶片也不再是非常幼嫩状态，要逐步降低空气湿度到40%～50%,塑料棚上的薄膜可逐渐打开或全部打开。叶面喷肥，喷施N15-P15-K15复合肥500倍，加速幼苗生长。每1周喷1次杀菌剂，一般可用多抗霉素1000倍和异菌多菌灵1500倍(或恶霉灵1000倍)以防根腐病、灰霉病等发生，详见附录B。9.2.3.3生长20d～30d一般在温室苗床移栽的组培苗，生长20d～30d即转移到营养杯内，在移栽时根系已盘根错节与基质一起形成一团，要求基质不散移入土中，并及时浇水。在营养杯内再长35d～40d,达到I、Ⅱ级，即可10技术档案按GB/T6001要求，建立相应育苗技术管理档案。6附录A(规范性附录)树种名称苗木种类苗龄级苗百适用范围根系苗高根系长度(条)根团(条)根团树莓组培苗50.2~整，无机械损伤，无病虫害，不失水，有旺盛的生命力北至黑龙江、内蒙；南至广份7(资料性附录)防治病害、虫害种类一500~800倍1500倍多抗霉素1500～2000倍99%粉剂1000倍阿维菌素5%乳油1500～2000倍8(资料性附录)组培室的构成及基本设备组培实验室一般应包括更衣室、洗瓶室、配置室、配药室、灭菌室、接种室、培养室、驯化棚室等。结合具体情况，可以合并部分分室。C.1洗瓶室用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗和整理等。要求房间宽敞明亮，方便多人同时工作，有电源、水源，上下水通畅；地面耐湿、防滑、排水良好，便于清洁。设备及用具：工作台、烘箱、晾干架、周转筐、各种规格的毛刷、药品柜等。C.2培养基配置室用于培养基的配置、植物材料的预处理。要求房间宽敞明亮、通风干燥，方便多人同时工作，有电源、水源，上下水通畅。设备及用具：电子分析天平、托盘天平、电子天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴振荡器、微波炉、冰箱、展示柜、移液管、培养瓶、试剂瓶、烧杯、量筒、容量瓶、培养皿、玻璃棒、记号笔、封口膜、瓶盖、周转筐、纱布、小推车等。C.3灭菌室用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。要求安全、通风、明亮；墙面和地面防潮、耐高温。水源、电源加热；上下水通畅；设备及用具：压力灭菌锅、周转筐、换气扇、小推车等。C.4接种室进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，即无菌操作室。要求空间宜小不宜大，密闭、干爽安静、清洁明亮、不易积尘。门窗密闭性好、吊装紫外光灯，保持环境无菌或低密度有菌状态；安置空调机；人流与物流分开。设备及用具：超净工作台、空调机、接种器械灭菌器、紫