探寻三萜化合物关键合成基因：挖掘与生物合成的深度剖析

探寻三萜化合物关键合成基因：挖掘与生物合成的深度剖析一、引言1.1研究背景与意义三萜化合物（Triterpenoids）是一类由30个碳原子构成基本母核的萜类化合物，在自然界中分布广泛，常见于植物、真菌等生物体内，它们以游离形式，或与糖结合成苷或酯的形式存在。三萜化合物的结构类型丰富多样，包括四环三萜和五环三萜等主要类型，每种类型下又有众多的衍生物，如人参皂苷属于四环三萜，具有多种不同的结构变体，其糖基的种类、数量和连接位置的差异，使得人参皂苷的结构和活性呈现出多样性；而齐墩果酸、熊果酸等则属于五环三萜，它们在植物中广泛存在，且结构上的细微差别导致其生物活性有所不同。三萜化合物在医药、食品、化妆品等领域展现出了重要的应用价值。在医药领域，许多三萜化合物具有显著的药理活性。人参皂苷能够促进RNA和蛋白质的生物合成，调节机体代谢，增强免疫功能，在提高人体抵抗力方面具有积极作用，被广泛应用于保健品和药品中；柴胡皂苷具有中枢抑制、抗炎以及降低血浆中胆固醇和甘油三酯的作用，对心血管健康的维护至关重要；七叶皂苷具有抗渗出、抗炎、抗淤血的作用，在治疗跌打损伤、软组织肿胀等方面有良好效果；甘草皂苷具有促进肾上腺皮质激素样作用，对于抗溃疡、防治肝硬化等方面发挥着重要作用。三萜化合物还被发现具有抗肿瘤和降血脂的潜力，通过干扰癌细胞的生长、分化和扩散，能够有效抑制肿瘤的发展，为肿瘤患者带来了新的治疗希望；通过调节胆固醇的代谢，降低血液中不健康的脂质含量，从而降低心血管疾病的风险。在食品领域，三萜类植物提取物具有温和的甜味，可替代糖类或其他添加剂，减少食品中的糖量，改善食品的营养成分；由三萜类萜芦碱制备而成的食用油具有抗氧化活性，对人体健康有保护作用。在化妆品领域，三萜化合物的抗氧化、抗炎等特性，使其能够用于护肤品中，帮助延缓皮肤衰老、改善皮肤炎症等问题，如含有灵芝三萜的护肤品，能够有效清除皮肤细胞中的自由基，减少氧化损伤，使皮肤保持弹性和光泽。然而，目前三萜化合物的生产主要依赖于从天然植物中提取，这面临着诸多挑战。一方面，天然植物中三萜化合物的含量通常较低，提取成本高，且提取过程复杂，需要消耗大量的资源和能源；另一方面，对天然植物的过度采集可能导致生态环境的破坏，影响生物多样性。此外，化学合成三萜化合物的方法虽然在理论上可行，但由于三萜化合物结构复杂，化学合成往往步骤繁琐、产率低，且可能产生大量的副产物，对环境造成污染。因此，挖掘三萜化合物的关键合成基因，利用合成生物学技术实现三萜化合物的高效生产，具有重要的现实意义。通过挖掘关键合成基因，可以深入了解三萜化合物的生物合成途径，揭示其合成机制。这不仅有助于从分子层面解析三萜化合物的形成过程，为进一步优化生物合成途径提供理论基础，还能为利用基因工程手段调控三萜化合物的合成提供可能。利用合成生物学技术，将关键合成基因导入合适的宿主细胞中，构建高效的细胞工厂，能够实现三萜化合物的大规模、可持续生产。这种生产方式不受自然资源的限制，可降低生产成本，减少对环境的影响，为三萜化合物在各个领域的广泛应用提供充足的原料。挖掘关键合成基因还有助于发现新的三萜化合物及其生物活性，拓展三萜化合物的应用范围，为新药研发、功能食品开发等提供新的契机。1.2国内外研究现状在三萜化合物生物合成途径的研究方面，国内外学者已取得了一系列重要进展。研究表明，三萜化合物的生物合成起始于甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径，这两条途径均可生成异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。IPP和DMAPP在异戊烯基转移酶的作用下，逐步缩合形成法尼基焦磷酸（FPP），FPP是三萜化合物生物合成的关键前体。FPP在环氧角鲨烯合酶（SQS）的催化下，生成2,3-环氧角鲨烯，2,3-环氧角鲨烯再在环氧角鲨烯环化酶（OSC）的作用下，发生环化反应，形成多种不同骨架结构的三萜类化合物。如在人参皂苷的生物合成研究中，科研人员通过对人参细胞的代谢分析和基因功能验证，明确了从IPP到人参皂苷元的关键合成步骤，揭示了MVA途径在人参皂苷合成中的重要作用；对甘草中甘草酸生物合成途径的研究发现，甘草酸的合成涉及多个酶的协同作用，包括SQS、OSC以及多种细胞色素P450酶和糖基转移酶等。关于三萜化合物关键合成基因的挖掘，目前也取得了一定的成果。通过基因组学、转录组学和代谢组学等多组学技术的联合应用，许多与三萜化合物生物合成相关的关键基因被成功挖掘和鉴定。在灵芝三萜的研究中，科研人员利用转录组测序技术，分析了灵芝不同生长阶段的基因表达谱，筛选出了多个与灵芝三萜合成相关的差异表达基因，其中包括多个编码OSC、细胞色素P450酶和糖基转移酶的基因，并通过基因克隆和功能验证，确定了这些基因在灵芝三萜生物合成中的关键作用；在黄芪三萜的研究中，研究人员通过对黄芪基因组的深度测序和分析，结合转录组数据，挖掘出了一系列参与黄芪三萜生物合成的基因，包括负责骨架合成的OSC基因以及参与后修饰的氧化酶和糖基转移酶基因。然而，当前的研究仍存在一些不足之处。三萜化合物的生物合成途径较为复杂，涉及众多的酶和代谢步骤，尽管已经明确了一些关键的合成步骤和酶基因，但对于整个生物合成途径的调控机制尚未完全阐明，尤其是在不同环境条件下，三萜化合物生物合成途径的动态变化规律以及基因表达的调控网络仍有待深入研究。不同物种中三萜化合物的生物合成途径存在差异，即使是同一种三萜化合物，在不同植物中的合成途径和关键基因也可能不同。如西番莲中三萜的生物合成途径来自甲戊酸（MVA）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（MEP/DOXP）两个通路，不同于其他果树的三萜生物合成途径。这给关键合成基因的挖掘和通用性研究带来了困难，需要针对不同物种进行深入的研究和分析。目前挖掘出的关键合成基因，在实际应用中仍面临一些挑战，如将这些基因导入异源宿主中进行三萜化合物的生产时，往往存在表达效率低、产物产量不高以及代谢途径不协调等问题，如何优化基因表达和代谢途径，提高三萜化合物的生产效率，仍是亟待解决的问题。对三萜化合物生物合成途径中一些稀有酶和新基因的挖掘还相对较少，限制了对三萜化合物生物合成机制的全面认识和新三萜化合物的发现。1.3研究内容与方法本研究旨在挖掘重要三萜化合物的关键合成基因，并深入分析其生物合成途径及调控机制，主要研究内容与方法如下：1.3.1关键合成基因的挖掘多组学数据整合分析：收集多种富含三萜化合物的植物或微生物样本，如人参、灵芝、甘草等，利用基因组测序技术获取其完整基因组序列，通过转录组测序分析不同生长阶段、不同组织中基因的表达谱，结合代谢组学技术检测三萜化合物及其前体物质的含量变化。运用生物信息学工具，对这些多组学数据进行整合分析，筛选出在三萜化合物合成过程中表达量显著变化，且与三萜生物合成途径相关的候选基因。例如，通过比较人参不同生长年限根中基因表达谱和人参皂苷含量，找出在人参皂苷含量高的样本中高表达的基因，初步确定为候选基因。基因功能验证：采用基因克隆技术，将筛选出的候选基因克隆到合适的表达载体中，如pET系列载体用于原核表达，pYES2等载体用于真核表达。将重组表达载体导入大肠杆菌、酵母等模式生物中，使其异源表达候选基因。通过检测转化后宿主细胞中三萜化合物或其前体物质的产量变化，以及相关代谢产物的积累情况，验证候选基因在三萜化合物生物合成中的功能。对于在大肠杆菌中表达的基因，可利用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术分析细胞裂解液中三萜类物质的含量；对于在酵母中表达的基因，可通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测发酵液中的三萜化合物。还可采用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对富含三萜化合物的植物或微生物自身的候选基因进行敲除或过表达，观察其对三萜化合物合成的影响，进一步确认基因功能。在灵芝中利用CRISPR/Cas9敲除候选的三萜合成相关基因，检测灵芝三萜产量的变化。1.3.2生物合成途径分析追踪代谢流：利用稳定同位素标记技术，如以^{13}C标记的葡萄糖、乙酸等作为碳源，添加到富含三萜化合物的生物培养体系中。通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等技术，追踪标记原子在三萜化合物生物合成过程中的流向，确定从基础代谢物到三萜化合物的具体合成步骤和中间产物。在研究人参皂苷生物合成时，使用^{13}C-葡萄糖喂养人参细胞，通过NMR分析人参皂苷中^{13}C的分布，明确从葡萄糖到人参皂苷元的代谢路径。解析酶促反应：对参与三萜化合物生物合成的关键酶进行分离、纯化和鉴定，如环氧角鲨烯合酶（SQS）、环氧角鲨烯环化酶（OSC）等。通过酶动力学实验，研究这些酶的催化特性，包括底物特异性、反应速率、最适温度、pH值等；利用X射线晶体学、核磁共振等技术解析酶的三维结构，结合定点突变技术，研究酶活性中心的氨基酸残基对催化活性的影响，深入了解酶促反应的分子机制。对OSC进行晶体结构解析，发现其活性中心的特定氨基酸残基突变会改变催化产物的种类，从而影响三萜化合物的结构。1.3.3调控机制研究转录水平调控：运用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，鉴定与三萜化合物生物合成关键基因启动子区域结合的转录因子，分析转录因子与基因启动子区域的相互作用模式；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、RNA测序（RNA-seq）等技术，研究在不同环境条件下（如温度、光照、营养条件等），转录因子和关键合成基因的表达变化，构建转录调控网络，揭示转录水平对三萜化合物生物合成的调控机制。在研究灵芝三萜合成时，发现温度变化会影响某些转录因子的表达，进而调控灵芝三萜合成关键基因的表达。翻译后修饰调控：利用蛋白质组学技术，如质谱技术，鉴定参与三萜化合物生物合成的关键酶的翻译后修饰类型（如磷酸化、乙酰化、糖基化等）和修饰位点。通过体外酶活性测定和体内功能验证，研究翻译后修饰对关键酶活性和稳定性的影响，以及对三萜化合物生物合成的调控作用。研究发现，OSC的磷酸化修饰会增强其催化活性，从而促进三萜化合物的合成。二、三萜化合物概述2.1结构与分类三萜化合物是一类基本母核由30个碳原子组成的萜类化合物，根据“异戊二烯法则”，其结构被认为是由6个异戊二烯单位缩合而成。三萜类化合物的结构类型丰富多样，目前已发现约有200种不同类型的三萜类化合物骨架，多数为四环三萜和五环三萜，也有少数为链状、单环、双环和三环三萜。近年来，还发现了许多由于三萜类化合物氧化、甲基转位、重排及降解等生成的结构复杂、高度氧化的新骨架类型三萜类化合物。从生源途径来看，三萜化合物的生物合成是由鲨烯（Squalene）、氧化鲨烯（Oxidosqualene）或双氧化鲨烯（Bisoxidosqualene）形成的，而鲨烯是由焦磷酸金合欢酯（Farnesylpyrophosphate，FPP）尾尾缩合生成。在生物体内，三萜化合物以游离态和结合态两种形式广泛分布。游离三萜主要分布于菊科、豆科、大戟科、卫矛科、茜草科、橄榄科、唇形科等植物；三萜苷类则分布于豆科、五加科、葫芦科、毛茛科、石竹科、伞形科、鼠李科、报春花科等植物中。一些常用植物，如人参、黄芪、甘草、三七、桔梗、远志、柴胡、茯苓、甘遂和泽泻等都含有三萜类化合物。根据三萜类化合物碳环的有无和多少进行分类，可分为以下几类：链状三萜：链状三萜较为少见，其碳原子不形成环状结构。角鲨烯（Squalene）是链状三萜的典型代表化合物，广泛分布在人体内膜、皮肤、皮下脂肪、肝脏、指甲、脑等器官内，在人体脂肪细胞中浓度很高。角鲨烯是羊毛甾醇生物合成的前身，而羊毛甾醇又是其它甾体化合物的前身，因此在人体中具有重要的生物功能。在食物中，鱼肝油的角鲨烯含量最高，在橄榄油、菜籽油和米糠油等植物油中含量也较高，它是一种高度不饱和碳氢化合物（C_{30}H_{50}），具有耐缺氧的生理功能，还具有降低血脂和软化血管等作用，被誉为“血管清道夫”。单环三萜：三萜化合物的碳原子排布中含有一个碳环的，称为单环三萜。从蓍属植物中分离得到的蓍醇A（AchilleolA）就是一个具有单环骨架的三萜类化合物。这类植物可入药，具有解毒消肿、止血、止痛的功能，蓍醇A是其重要的有效成分之一。双环三萜：双环三萜指三萜的化学结构中有两个碳原子环。目前已发现的双环三萜类化合物很少，从海洋生物Asteropussp.中分离得到的一类具有双环骨架的三萜半乳糖苷类化合物PouosideA-E，其分子中含有多个乙酰基。Pouoside具有细胞毒性作用，但其医疗保健功能还不清楚。三环三萜：目前发现的三环三萜类化合物也较少，只在新鲜的蕨类植物中发现了两个油状三环三萜类化合物13αH-malabaricatriene和13βH-malabaricatriene。蕨类植物中的伏石蕨具有重要的药用价值，具有清热解毒、清肺止咳、活血散瘀、凉血止血的作用，但Malabaricatriene是否是其有效成分还有待研究。四环三萜：四环三萜大部分具有环戊烷骈多氢菲的基本母核，17位上有由8个碳原子组成的侧链，在母核上一般有5个甲基，即4位有偕二甲基，10位和14位各有一个甲基，另一个甲基常连接在13位或8位上。存在于天然界的四环三萜或其皂苷元主要有以下类型：羊毛脂甾烷型：羊毛脂甾烷（Lanostane）也叫羊毛脂烷，是由环氧鲨烯经椅-船-椅构象式环合而成，其结构特点是A/B、B/C、C/D环均为反式稠合，C-20为R构型，其10、13和14位分别连有β-、β-、α-CH_3，17位侧链为β-构型。茯苓中的三萜类成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用，茯苓酸（Pachymicacid）和块芩酸（Tumulosicacid）等具有利尿、渗湿、健脾、安神功效。灵芝中的四环三萜化合物属于羊毛脂甾烷高度氧化的衍生物，从中分离出的四环三萜化合物已达100余个，根据这些三萜分子中所含碳原子的数目，可分为C_{30}、C_{27}和C_{24}三种基本骨架，如LucidenicacidA和LucidoneA为灵芝酸（GanodericacidC）的降解产物。达玛烷型：达玛烷型三萜的结构特点是8位和10位有β-构型的角甲基，13位连有β-H，17位的侧链为β-构型，C20构型为R或S。五加科植物人参、三七和西洋参等的根、茎、叶、花、果实中均含有多种人参皂苷，其苷元绝大多数属于达玛烷型四环三萜。人参皂苷影响人体的多种代谢通路，具有增强机体免疫力、缓解疲劳、增强记忆、促进肝细胞修复、增强心脏功能、抗肿瘤及缓解毒素毒性等作用。甘遂烷型（大戟烷型）：甘遂烷型（Tirucallane）又称大戟烷型，大戟醇（Euphol）存在于许多大戟属植物乳液中，在甘遂、狼毒和千金子中均有大量存在。从无患子科植物无患子根中分离得到的SapimukosideA和SapimukosideB为两个新的大戟烷型三萜皂苷，其结构特点是13位为α-CH_3，而14位为β-CH_3。大戟科植物有毒，但少量可入药，如甘遂可治疗水肿、腹水、留饮结胸、癫痫、喘咳、大小便不通等。环阿屯烷型（环菠萝蜜烷型）：环阿屯烷型（Cycloartane）又称环菠萝蜜烷型，中药黄芪含有的环黄芪醇（Cycloastragenol）是环菠萝蜜烷型三萜的代表性化合物，具有增强机体免疫功能、抗衰老、抗应激、降压、保肝、利尿及广泛的抗菌作用。黄芪在中医药中具有补气固表、利水退肿、脱毒生肌等功效。葫芦素烷型：许多来源于葫芦科植物的中药，如甜瓜蒂、丝瓜子、苦瓜、喷瓜等均含有葫芦素烷型三萜成分，总称为葫芦素类（Cucurbitacins）。不成熟的甜瓜的苦味就是这类化合物所致。这类化合物生物活性广泛，除了有抑制肿瘤的作用外，还有抗菌、消炎、催吐、致泻等功能。中药血胆中的有效成分血胆素（Cucurbitacin）也属于这类化合物。苦楝烷型：楝科楝属植物的果实及树皮中含多种苦楝烷型三萜成分，具苦味，总称为楝苦素（Toosendanin），有驱除蛔虫，蛲虫和鞭虫的作用，以对蛔虫的作用最明显。原萜烷型：泽泻的主要有效成分泽泻萜醇A和B（AlisolA，B）属于原萜烷型三萜，具有降低血清总胆固醇的功能，可用于治疗高血脂症。泽泻是多年生水生或沼生草本，全株有毒，地下块茎毒性较大，根茎入药，有利水，渗湿，泄热之功效。五环三萜：五环三萜类化合物在植物界分布广泛，种类繁多，大多具有重要的药用价值。根据其结构主要分为以下四类：齐墩果烷型：齐墩果烷型（Oleanane）又称β-香树脂烷型，其基本碳架是多氢蒎的五环母核，环的稠合方式为A/B、B/C、C/D环均为反式，D/E环为顺式。母核上有8个甲基，其中C-4、C-20位上各有两个甲基，C-10、C-14、C-17位上各有一个甲基。齐墩果酸是齐墩果烷型三萜的代表化合物，广泛存在于植物中，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性，临床用于治疗肝炎。许多常用中药如柴胡、甘草、桔梗等中都含有齐墩果烷型三萜皂苷。乌苏烷型：乌苏烷型（Ursane）又称α-香树脂烷型或熊果烷型，其分子结构与齐墩果烷型相似，区别仅在于E环上两个甲基的位置不同。乌苏烷型的C-19和C-20位各有一个甲基，而齐墩果烷型的C-20位有两个甲基。熊果酸是乌苏烷型三萜的代表化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，在植物中分布广泛，如在山楂、女贞子、车前草等植物中均有存在。羽扇豆烷型：羽扇豆烷型（Lupane）的结构特点是E环为五元碳环，且在E环19位有异丙基以α-构型取代，A/B、B/C、C/D环均为反式，D/E环为顺式。白桦脂醇和白桦脂酸是羽扇豆烷型三萜的代表化合物，白桦脂醇具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等生物活性，白桦脂酸对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒性作用。木栓烷型：木栓烷型（Friedelane）的结构特点是A/B、B/C、C/D环均为反式，D/E环为顺式，C-4、C-10、C-13、C-14、C-17位各有一个甲基，C-20位为叔碳原子。木栓烷型三萜在植物中分布较少，从一些植物中分离得到的木栓烷型三萜具有一定的生物活性，但其研究相对较少。2.2分布与常见化合物列举三萜化合物在自然界中分布极为广泛，涵盖了植物、动物和微生物等多个生物领域，不同来源的三萜化合物不仅结构丰富多样，其生物活性也各有特色，在医药、食品、化妆品等领域展现出巨大的应用潜力。在植物界，三萜化合物分布广泛，几乎存在于所有的植物类群中，尤其是在双子叶植物中分布最多。三萜类化合物在植物中既可以游离态存在，也可以与糖结合形成苷的形式存在。游离三萜主要分布于菊科、豆科、大戟科、卫矛科、茜草科、橄榄科、唇形科等植物；三萜苷类则分布于豆科、五加科、葫芦科、毛茛科、石竹科、伞形科、鼠李科、报春花科等植物中。许多常见的药用植物，如人参、黄芪、甘草、三七、桔梗、远志、柴胡、茯苓、甘遂和泽泻等都富含三萜化合物，这些三萜化合物往往是这些植物发挥药用功效的关键成分。人参中的人参皂苷属于四环三萜中的达玛烷型，是人参发挥多种保健和药用作用的主要活性成分，包括增强机体免疫力、缓解疲劳、增强记忆、促进肝细胞修复、增强心脏功能、抗肿瘤及缓解毒素毒性等作用；柴胡中的柴胡皂苷具有中枢抑制、抗炎以及降低血浆中胆固醇和甘油三酯的作用；甘草中的甘草皂苷具有促进肾上腺皮质激素样作用，对防治肝硬化、抗动脉粥样硬化、抗溃疡等方面发挥着重要作用。在动物领域，三萜化合物的分布相对较少，但也有一些具有重要生物功能的三萜被发现。角鲨烯是一种链状三萜，广泛分布在人体内膜、皮肤、皮下脂肪、肝脏、指甲、脑等器官内，在人体脂肪细胞中浓度很高。角鲨烯是羊毛甾醇生物合成的前身，而羊毛甾醇又是其它甾体化合物的前身，在人体的生命活动中具有重要的生物功能。在食物中，鱼肝油的角鲨烯含量最高，在橄榄油、菜籽油和米糠油等植物油中含量也较高，它具有耐缺氧的生理功能，还能降低血脂和软化血管，被誉为“血管清道夫”。从羊毛脂中可以分离出羊毛脂醇，它属于三萜类化合物，在动物的生理过程中可能发挥着一定的作用。微生物也是三萜化合物的重要来源之一。在真菌中，灵芝和茯苓是富含三萜化合物的典型代表。灵芝中的三萜类化合物称为灵芝三萜，均属于高度氧化的羊毛脂烷型三萜，灵芝酸是其中最重要的有效成分，目前已分离到100多种灵芝酸，如灵芝酸A、B、C、D、E、F、G、I、L等。灵芝酸具有抑制肿瘤细胞生长、降低胆固醇、抗高血压、抗过敏等功效。茯苓中的三萜类成分具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用，茯苓酸和块芩酸等具有利尿、渗湿、健脾、安神功效。一些细菌和放线菌也能够合成三萜化合物，尽管相关研究相对较少，但这些微生物来源的三萜化合物可能具有独特的生物活性和应用价值，值得进一步深入探索。2.3生物活性与应用领域三萜化合物凭借其丰富多样的生物活性，在医药、食品、化妆品等多个领域展现出重要的应用价值，为人类健康和生活品质的提升提供了有力支持。在医药领域，三萜化合物的生物活性尤为突出。许多三萜化合物具有显著的抗炎活性，能够通过抑制炎症介质的释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等，减轻炎症反应。齐墩果酸能够抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞中炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用；熊果酸也被证实可通过调节炎症信号通路，有效缓解炎症症状。三萜化合物还具有抗肿瘤活性，其作用机制多样，包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管生成等。人参皂苷Rh2能够诱导肝癌细胞、肺癌细胞等多种肿瘤细胞凋亡，通过激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞走向死亡；灵芝三萜中的一些成分可抑制肿瘤细胞的增殖，阻断肿瘤细胞的生长周期，从而抑制肿瘤的发展。一些三萜化合物还具有免疫调节活性，能够增强机体的免疫功能，提高机体对病原体的抵抗力。黄芪中的三萜类成分可以增强巨噬细胞的吞噬能力，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，从而调节机体的免疫反应。三萜化合物在心血管疾病防治、降血脂、降血糖等方面也具有一定的作用，为相关疾病的治疗提供了新的思路和药物来源。在食品领域，三萜化合物同样发挥着重要作用。一些三萜类植物提取物具有温和的甜味，可替代糖类或其他添加剂，减少食品中的糖量，改善食品的营养成分。由三萜类萜芦碱制备而成的食用油具有抗氧化活性，能够有效抑制油脂的氧化酸败，延长食品的保质期，同时对人体健康有保护作用。一些富含三萜化合物的植物提取物还被应用于功能性食品的开发，如人参提取物、灵芝提取物等，这些功能性食品具有增强免疫力、缓解疲劳、抗氧化等功效，满足了消费者对健康食品的需求。在化妆品领域，三萜化合物的抗氧化和抗炎特性使其成为护肤品中的重要成分。三萜化合物能够清除皮肤细胞中的自由基，减少氧化损伤，延缓皮肤衰老，使皮肤保持弹性和光泽。含有灵芝三萜的护肤品，能够有效抑制皮肤细胞的氧化应激反应，减少皱纹的产生，改善皮肤的质地；齐墩果酸和熊果酸等三萜化合物具有抗炎作用，可用于治疗皮肤炎症，如痤疮、湿疹等，减轻皮肤红肿、瘙痒等症状。一些三萜化合物还具有美白功效，能够抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的合成，从而达到美白肌肤的效果。三、重要三萜化合物关键合成基因的挖掘3.1挖掘方法与技术手段随着生命科学技术的不断发展，挖掘三萜化合物关键合成基因的方法与技术日益丰富和成熟，这些方法和技术为深入研究三萜化合物的生物合成机制提供了有力的工具。转录组测序技术是挖掘关键合成基因的重要手段之一。通过对富含三萜化合物的植物或微生物在不同生长阶段、不同组织中的转录组进行测序，可以获得大量的基因表达信息。以灵芝为例，科研人员利用转录组测序技术，分析了灵芝在菌丝体、子实体等不同生长阶段的基因表达谱，发现了多个在灵芝三萜合成关键时期高表达的基因。在对人参的研究中，通过转录组测序，筛选出了一系列在人参皂苷合成过程中差异表达的基因，为进一步研究人参皂苷的生物合成机制提供了线索。转录组测序能够全面地反映基因的表达情况，帮助我们快速锁定与三萜化合物合成相关的候选基因，为后续的基因功能验证奠定基础。同源性BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）分析也是常用的基因挖掘技术。该技术基于序列相似性原理，将待研究的基因序列与已知的基因数据库进行比对，从而找出与之具有较高同源性的基因。在西番莲三萜化合物关键合成基因的挖掘中，研究人员利用同源性BLAST，在转录组数据中筛选出一系列可能参与三萜化合物合成途径的候选基因。通过与已知的三萜合成基因进行比对，确定了一些在西番莲中可能具有相似功能的基因。同源性BLAST分析能够借助已有的基因信息，快速识别潜在的三萜合成基因，提高基因挖掘的效率。系统发育分析在关键合成基因的挖掘中也发挥着重要作用。它通过构建基因或物种的进化树，分析基因之间的进化关系，从而推断基因的功能和起源。在黄芪三萜生物合成基因的研究中，科研人员通过系统发育分析，对参与黄芪三萜合成的氧化酶和糖基转移酶基因进行了深入研究。通过比较不同物种中这些基因的进化关系，确定了它们在黄芪三萜生物合成中的关键作用。系统发育分析能够从进化的角度深入理解基因的功能和演化，为挖掘关键合成基因提供了独特的视角。基因芯片技术也是挖掘三萜化合物关键合成基因的有效方法。基因芯片能够同时检测大量基因的表达水平，通过比较不同样本（如富含三萜化合物的样本与对照组）中基因的表达差异，可以筛选出与三萜化合物合成相关的基因。在对甘草三萜合成基因的研究中，利用基因芯片技术，分析了甘草在不同处理条件下基因的表达变化，发现了一些与甘草三萜合成密切相关的基因。基因芯片技术具有高通量、快速的特点，能够在短时间内获取大量基因的表达信息，为关键合成基因的挖掘提供了全面的数据支持。3.2具体案例分析-以黄芪为例3.2.1研究材料与实验设计本研究以蒙古黄芪（Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao）为材料，其干燥根作为中药黄芪应用历史悠久，最早见于《神农本草经》，具有补气升阳、固表止汗等功效，临床用于治疗多种疾病。黄芪作为临床常用大宗药材及药食两用药材，市场需求量大，目前人工种植采收多以两年或三年生为主，故本研究选取两年生和三年生蒙古黄芪作为研究对象。蒙古黄芪样品来源于内蒙古通辽市科尔沁区庆和镇黄芪实验基地（121°60′21′′E，43°35′46′′N；海拔141m）。于2022年5月1日分别采集两年生（A）和三年生（B）蒙古黄芪新鲜植物根各3份（每份6株），并进行分组，两年生的分为A1、A2、A3组，三年生的分为B1、B2、B3组。采集后的样品迅速用液氮速冻，随后每组样品分别用于转录组测序和含量测定。植株由陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为豆科植物蒙古黄芪。在实验设计上，对于转录组测序，旨在通过对不同生长年限蒙古黄芪根的转录组分析，挖掘与三萜皂苷合成相关的基因。而含量测定则是依据《中国药典》2020年版项下方法，对蒙古黄芪中6种主要皂苷（黄芪甲苷、黄芪皂苷I、黄芪皂苷II、黄芪皂苷III、异黄芪皂苷I、异黄芪皂苷II）成分的含量进行测定。实验过程中，使用S3000高效液相仪、UM5800plus蒸发光检测器等仪器，以0.3%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，采用梯度洗脱方式进行含量测定，同时设置了相应的柱温、进样体积以及ELSD检测器条件。3.2.2实验过程与数据分析在实验过程中，首先进行RNA提取。对蒙古黄芪各组样品总RNA分别进行提取后，使用Nanodrop检测RNA的纯度、浓度以及核酸吸收峰是否正常，再用Agilent2100检测样品中RNA的完整性。只有检测合格的样品才进入下一步实验。接着进行文库构建。用带Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，加入FragmentationBuffer将mRNA随机打断，以之为模板用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第一条cDNA链，再加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第2条cDNA链。利用AMPureXPbeads纯化cDNA，并进行末端修复、加A尾并连接接头，进行片段大小选择，再经PCR富集后得到cDNA文库。之后，经Qubit2.0进行初步定量，用Agilent2100对文库的insertsize进行检测，最后用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，确保文库有效浓度＞2nmol。库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行蓄集，使用IlluminaHiSeq进行测序。对上机测序得到的原始序列（rawreads）进行过滤，去掉含接头的reads和低质量的reads，得到高质量的序列（cleanreads）。采用Trinity软件对cleanreads进行拼接得到转录本序列，筛选其中必要的非冗余序列（Unigene）用于后续分析。在Unigene功能注释和分类方面，用转录本蛋白编码潜能预测工具（CPC2）查找含编码潜能的Unigene，然后用BLAST软件将发掘可编码的Unigene与非冗余蛋白质序列数据库（Nr）、基因本体论（GO）、同源蛋白质簇数据库（eggNOG/COG）、真核生物蛋白相邻类的聚簇（KOG）、京都基因与基因组百科全书数据库（KEGG）、Swiss-Prot、Pfam等数据库进行序列相似性对比，从而获得基因功能注释信息。在数据分析时，对不同生长年限蒙古黄芪中三萜皂苷的含量数据进行统计分析，通过方差分析等方法，比较两年生和三年生蒙古黄芪中三萜皂苷含量的差异。对于转录组测序得到的数据，利用生物信息学软件对Unigene进行功能富集分析，如GO富集分析和KEGG富集分析，以确定与三萜皂苷合成相关的生物学过程、分子功能以及代谢通路。通过这些分析，筛选出在不同生长年限中差异表达且与三萜皂苷合成相关的基因，为后续关键合成基因的鉴定提供数据支持。3.2.3关键合成基因的鉴定与验证通过对蒙古黄芪转录组数据的深入分析以及与三萜皂苷含量的关联分析，鉴定出了一系列参与黄芪三萜皂苷生物合成的关键基因。其中，环阿屯醇合成酶（AmOSC3）基因在三萜皂苷的骨架合成中发挥着关键作用，它催化2,3-环氧角鲨烯环化形成环阿屯醇，是黄芪三萜皂苷生物合成的重要起始步骤。细胞色素氧化酶（AmCYP88D25）基因则参与了环阿屯醇的修饰过程，负责催化环阿屯醇C-16羟化，为后续的反应提供重要的中间体。尿苷二磷酸糖基转移酶（AmGT11）基因在三萜皂苷的糖基化修饰中起到关键作用，它能够将糖基转移到三萜皂苷的特定位置，影响三萜皂苷的结构和活性。为了验证这些基因的功能，采用了多种实验方法。通过基因克隆技术，将这些关键基因克隆到合适的表达载体中，然后导入大肠杆菌或酵母等模式生物中进行异源表达。在大肠杆菌中表达时，利用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术分析细胞裂解液中三萜类物质或其前体物质的含量变化。结果显示，导入关键基因的大肠杆菌细胞裂解液中，三萜类物质的含量相较于对照组有显著提高，表明这些基因能够促进三萜类物质的合成。在酵母中表达时，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术检测发酵液中的三萜化合物。实验结果表明，表达关键基因的酵母发酵液中出现了新的三萜化合物，且含量随着基因表达量的增加而升高，进一步证实了这些基因在三萜化合物生物合成中的功能。还采用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对蒙古黄芪自身的关键基因进行敲除或过表达。在蒙古黄芪毛状根中，利用CRISPR/Cas9敲除AmOSC3基因后，检测发现黄芪三萜皂苷的含量显著降低，表明该基因对于黄芪三萜皂苷的合成是必不可少的。而过表达AmGT11基因后，黄芪三萜皂苷的糖基化程度增加，活性增强，进一步验证了该基因在糖基化修饰中的关键作用。通过这些实验验证，确定了鉴定出的关键基因在黄芪三萜皂苷生物合成中的重要功能，为深入研究黄芪三萜皂苷的生物合成机制以及利用合成生物学技术生产黄芪三萜皂苷奠定了坚实的基础。四、三萜化合物的生物合成途径4.1经典生物合成途径解析三萜化合物的经典生物合成途径起始于甲戊二羟酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径。MVA途径主要存在于真核生物和古细菌中，而MEP途径则主要存在于原核生物和植物的质体中。这两条途径的最终产物均为异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它们是萜类化合物生物合成的通用前体。在MVA途径中，乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）在硫解酶的催化下，缩合形成乙酰乙酰辅酶A，随后在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）合酶的作用下，与另一分子乙酰辅酶A结合，生成HMG-CoA。HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的催化下，消耗两分子NADPH，还原为甲戊二羟酸（MVA）。MVA在一系列激酶和磷酸酶的作用下，经过磷酸化和脱羧反应，生成IPP。IPP在异构酶的作用下，可逆地转化为DMAPP。MEP途径则以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为起始底物，在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）的催化下，缩合形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）。DXP在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）的作用下，异构化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）。MEP经过一系列酶促反应，依次生成4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇（CDP-ME）、4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸（CDP-MEP）、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸（MECDP）和1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-磷酸（HMBPP）。HMBPP在IspH酶的催化下，生成IPP和DMAPP。IPP和DMAPP在异戊烯基转移酶的作用下，发生逐步缩合反应，首先由DMAPP和IPP在香叶基焦磷酸合酶（GPPsynthase）的催化下，生成香叶基焦磷酸（GPP），GPP是单萜类化合物的前体。GPP再与一分子IPP在法尼基焦磷酸合酶（FPPsynthase）的作用下，生成法尼基焦磷酸（FPP），FPP是倍半萜和三萜类化合物的重要前体。两分子FPP在角鲨烯合酶（Squalenesynthase，SQS）的催化下，发生尾-尾缩合反应，生成角鲨烯（Squalene）。角鲨烯在角鲨烯环氧酶（Squaleneepoxidase，SQE）的催化下，被氧化生成2,3-环氧角鲨烯（2,3-oxidosqualene），2,3-环氧角鲨烯是三萜类化合物生物合成的直接前体。2,3-环氧角鲨烯在环氧角鲨烯环化酶（Oxidosqualenecyclase，OSC）的作用下，发生环化反应，形成多种不同骨架结构的三萜类化合物。OSC是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶，其催化的环化反应具有高度的立体选择性和区域选择性，能够产生多种不同结构的三萜骨架。根据OSC催化产物的不同，可将其分为多种类型，如羊毛甾醇合酶（Lanosterolsynthase，LAS）催化2,3-环氧角鲨烯环化生成羊毛甾醇（Lanosterol），是动物和真菌中甾体化合物生物合成的重要步骤；环阿屯醇合酶（Cycloartenolsynthase，CAS）催化2,3-环氧角鲨烯环化生成环阿屯醇（Cycloartenol），是植物中甾体化合物和三萜类化合物生物合成的关键步骤；α-香树脂醇合酶（α-Amyrinsynthase，α-AS）和β-香树脂醇合酶（β-Amyrinsynthase，β-AS）分别催化2,3-环氧角鲨烯环化生成α-香树脂醇（α-Amyrin）和β-香树脂醇（β-Amyrin），它们是五环三萜类化合物生物合成的重要前体。从环化产物出发，三萜类化合物还会经历一系列的修饰反应，如氧化、还原、甲基化、糖基化等，这些修饰反应进一步增加了三萜类化合物的结构多样性和生物活性。细胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）家族中的许多成员参与了三萜类化合物的氧化修饰反应，能够在三萜骨架上引入羟基、羰基等官能团；糖基转移酶（Glycosyltransferase，GT）则负责将糖基连接到三萜类化合物上，形成三萜皂苷，糖基的种类、数量和连接位置的不同，会显著影响三萜皂苷的物理化学性质和生物活性。4.2新型生物合成途径的发现与研究长期以来，传统理论认为三萜化合物的生物合成起始于角鲨烯合酶催化两分子法尼基焦磷酸形成角鲨烯，角鲨烯进一步氧化生成环氧角鲨烯，而后三萜合酶负责催化角鲨烯或环氧角鲨烯环化形成霍烯或羊毛甾醇等三萜骨架，其庞大的结构多样性则是由众多不同的修饰酶催化而成。然而，随着研究的深入，科研人员发现了不依赖角鲨烯形成三萜类化合物的新型途径，这一发现极大地丰富了三萜化合物生物合成机制的多样性，为三萜化合物的研究和应用开辟了新的方向。武汉大学刘天罡教授团队在利用高效酿酒酵母底盘挖掘萜类天然产物过程中，首次发现丝状真菌来源的I型嵌合萜类合酶TvTS和MpMS具有独特的催化功能。TvTS和MpMS的异戊烯基转移酶结构域能够催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和烯丙基焦磷酸（DMAPP）直接缩合生成六聚异戊烯基焦磷酸（HexPP），随后其萜类合酶结构域催化HexPP环化生成全新三萜骨架。这一发现打破了以往认为三萜化合物只能以角鲨烯为起始单元合成的固有认知，揭示了一种全新的三萜化合物生物合成途径。为了深入了解这一新型途径的酶反应机制，研究人员进行了一系列实验。通过体外同位素喂养实验，解析了上述三萜骨架talaropentaene的绝对构型和环化机理，以及具有最大环系以及新颖环化机理的三萜骨架macrophomene的产物结构和环化机制。利用结构生物学手段，分别解析了TvTS的萜类合酶结构域和MpMS的六聚体结构，并结合关键位点氨基酸的突变，阐明了TvTS和MpMS合成三萜骨架的催化机理。研究发现，TvTS和MpMS的催化过程与传统的三萜合酶催化过程存在显著差异，它们能够在不经过角鲨烯和环氧角鲨烯中间体的情况下，直接从IPP和DMAPP合成三萜化合物，这一过程涉及到独特的底物结合模式和催化活性中心的作用。与经典生物合成途径相比，新型途径具有多个显著差异。在底物利用上，经典途径以角鲨烯或环氧角鲨烯为底物，而新型途径则直接利用IPP和DMAPP这两种更为基础的前体物质，简化了合成步骤。从催化酶的角度来看，经典途径依赖于角鲨烯合酶、角鲨烯环氧酶和传统的三萜合酶等多种酶的协同作用，而新型途径仅由I型嵌合萜类合酶这一种酶即可完成从底物到三萜骨架的合成，大大缩短了反应路径。新型途径能够产生具有独特结构的三萜化合物，这些化合物在结构和生物活性上可能与传统途径产生的三萜化合物存在差异，为发现新的生物活性物质提供了可能。为了验证这种非角鲨烯来源三萜骨架合成方式的普遍性，刘天罡团队通过AlphaFold2进行萜类合酶三维结构的批量预测，并结合预测结构与底物分子的对接，从基因库中高效筛选获得另外两个三萜合酶CgCS和PTTC074。实验证明，它们能够成功合成新三萜骨架colleterpenol，进一步夯实了I型嵌合萜类合酶催化HexPP环化生成三萜骨架的普遍性机理。这一发现表明，新型生物合成途径并非个例，在自然界中可能广泛存在，为深入挖掘新型三萜化合物提供了理论依据和技术手段。4.3不同生物合成途径的比较与分析经典生物合成途径和新型生物合成途径在底物、酶、反应步骤等方面存在明显差异，这些差异导致了它们在三萜化合物合成中发挥着不同的作用，具有各自独特的意义。在底物方面，经典途径起始于甲戊二羟酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径，产生异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），经过一系列反应生成角鲨烯，再氧化为环氧角鲨烯，以环氧角鲨烯为直接前体进行三萜骨架的构建。新型途径则直接利用IPP和DMAPP为底物，丝状真菌来源的I型嵌合萜类合酶TvTS和MpMS的异戊烯基转移酶结构域能够催化IPP和DMAPP缩合生成六聚异戊烯基焦磷酸（HexPP），随后萜类合酶结构域催化HexPP环化生成全新三萜骨架。经典途径的底物经过了多步反应才形成环氧角鲨烯这一关键前体，而新型途径直接利用更为基础的IPP和DMAPP，简化了底物的生成过程。从酶的角度来看，经典途径涉及多种酶的协同作用，包括硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、角鲨烯合酶、角鲨烯环氧酶和环氧角鲨烯环化酶（OSC）等。不同的OSC催化环氧角鲨烯生成不同的三萜骨架，且后续的修饰反应还需要细胞色素P450酶、糖基转移酶等多种酶参与。新型途径则主要依赖于I型嵌合萜类合酶，如TvTS和MpMS，一种酶即可完成从底物到三萜骨架的合成，大大缩短了反应路径。经典途径中酶的种类繁多，分工明确，各酶之间的协同作用保证了复杂的三萜化合物合成过程的顺利进行；而新型途径中I型嵌合萜类合酶的独特结构和功能，使其能够独立完成关键的合成步骤，体现了生物合成途径的多样性。在反应步骤上，经典途径较为复杂，从IPP和DMAPP生成角鲨烯需要经过多步缩合反应，角鲨烯氧化为环氧角鲨烯后，再经过OSC催化的环化反应以及后续的修饰反应，才能生成最终的三萜化合物。新型途径则跳过了角鲨烯和环氧角鲨烯的生成步骤，直接从IPP和DMAPP合成三萜骨架，反应步骤相对简洁。经典途径的复杂性使得三萜化合物的结构多样性得以充分体现，通过不同的酶促反应和修饰步骤，可以产生丰富多样的三萜化合物；而新型途径的简洁性则可能在某些情况下提高三萜化合物的合成效率，为特定三萜化合物的大量生产提供了可能。不同生物合成途径在三萜化合物合成中都具有重要意义。经典途径经过长期的进化和研究，其机制相对清晰，是目前研究三萜化合物生物合成的基础，许多已知的三萜化合物都是通过经典途径合成的，对其深入研究有助于进一步优化三萜化合物的合成，提高产量和质量。新型途径的发现则为三萜化合物的研究和应用开辟了新的方向，它不仅丰富了三萜化合物生物合成机制的多样性，还可能产生具有独特结构和生物活性的三萜化合物，为新药研发、功能食品开发等提供新的契机。新型途径的研究也有助于我们从更广泛的角度理解生物合成的规律，为合成生物学的发展提供新的思路和方法。五、关键合成基因在生物合成中的作用机制5.1关键基因编码的酶及其功能在三萜化合物的生物合成过程中，关键合成基因编码了多种具有重要功能的酶，这些酶协同作用，推动了三萜化合物从基础代谢物逐步合成的复杂过程。鲨烯合酶（Squalenesynthase，SQS）是三萜化合物生物合成途径中的关键酶之一，由相应的关键基因编码。其主要功能是催化两分子法尼基焦磷酸（FPP）发生尾-尾缩合反应，生成角鲨烯（Squalene）。FPP是三萜化合物生物合成的重要前体，而鲨烯合酶的催化作用是三萜化合物合成过程中的关键步骤，为后续三萜骨架的构建提供了重要的底物。在人参皂苷的生物合成中，鲨烯合酶基因的表达水平对人参皂苷的合成有着重要影响，研究发现，上调鲨烯合酶基因的表达，能够增加角鲨烯的产量，进而促进人参皂苷的合成。氧化鲨烯环化酶（Oxidosqualenecyclase，OSC）同样是三萜化合物生物合成的关键酶，它催化2,3-环氧角鲨烯发生环化反应，形成多种不同骨架结构的三萜类化合物。OSC具有高度的立体选择性和区域选择性，不同类型的OSC能够催化生成不同的三萜骨架，如羊毛甾醇合酶（Lanosterolsynthase，LAS）催化生成羊毛甾醇，环阿屯醇合酶（Cycloartenolsynthase，CAS）催化生成环阿屯醇，α-香树脂醇合酶（α-Amyrinsynthase，α-AS）和β-香树脂醇合酶（β-Amyrinsynthase，β-AS）分别催化生成α-香树脂醇和β-香树脂醇等。这些不同的三萜骨架是三萜化合物结构多样性的基础，后续通过一系列的修饰反应，形成了丰富多样的三萜化合物。在灵芝三萜的合成中，不同的OSC基因表达产物决定了灵芝三萜的骨架类型，进而影响其生物活性。糖基转移酶（Glycosyltransferase，GT）在三萜化合物的生物合成中也发挥着重要作用，它负责将糖基连接到三萜类化合物上，形成三萜皂苷。糖基的种类、数量和连接位置的不同，会显著影响三萜皂苷的物理化学性质和生物活性。在人参皂苷的合成中，糖基转移酶基因的表达和活性调控着人参皂苷的糖基化修饰过程，不同的糖基转移酶将不同的糖基连接到人参皂苷元上，形成了具有不同生物活性的人参皂苷。一些糖基转移酶能够将葡萄糖、半乳糖等糖基连接到三萜皂苷元的特定位置，改变其水溶性、稳定性和生物活性，从而使其在医药、食品等领域具有不同的应用价值。5.2基因表达调控对生物合成的影响转录因子在三萜化合物生物合成的基因表达调控中发挥着关键作用。转录因子能够与三萜化合物生物合成关键基因的启动子区域结合，通过促进或抑制基因的转录，从而调控三萜化合物的生物合成。在拟南芥中，研究发现来自两个不同分支的冗余bHLH型转录因子的活性促进了三萜骨架thalianol和marneral生物合成途径基因的表达，并且这一过程由同源域因子共同激活。茉莉酸（JA）处理能够强烈诱导野生型拟南芥根中thalianol和marneral生物合成基因簇（BGC）的基因表达，而在coi1-1突变体中，这种诱导作用被消除或显著降低，说明COI1依赖的JA信号控制根部三萜的生物合成。进一步研究表明，MYC2、MYC3和MYC4等转录因子在三萜生物合成调控中发挥重要作用，染色质免疫沉淀测序显示，thalianol和maralBGC启动子都可以被MYC2和MYC3物理结合，在烟草中进行转录激活分析发现，MYC2可以激活所有启动子至少五倍。表观遗传学修饰也参与了三萜化合物生物合成的调控过程。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学修饰，它可以通过改变DNA的结构，影响转录因子与DNA的结合，进而影响基因的表达。在植物三萜皂苷的生物合成中，DNA甲基化可能对相关基因的表达起到调控作用，通过调节基因的甲基化状态，影响三萜皂苷的合成。组蛋白修饰也是重要的表观遗传学调控方式，如组蛋白的乙酰化、甲基化等修饰可以改变染色质的结构，从而影响转录因子与染色质的结合，调控基因的转录。研究发现，组蛋白修饰酶的活性变化会影响三萜化合物生物合成关键基因的表达，进而影响三萜化合物的合成。非编码RNA在三萜化合物生物合成的基因表达调控中也具有潜在的作用。非编码RNA可以通过与转录因子的结合位点相互作用，影响转录因子的结合和转录活性；也可以通过与转录因子的共激活因子或共抑制因子相互作用，影响转录因子的活性，从而调节基因的转录。虽然目前关于非编码RNA在三萜化合物生物合成调控中的研究相对较少，但随着研究的深入，其在三萜化合物生物合成中的调控机制将逐渐被揭示。5.3案例分析-以西番莲为例5.3.1西番莲三萜生物合成途径特点西番莲，亦称百香果，是西番莲科西番莲属藤本植物，其叶片等组织提取物富含多种黄酮类和萜类化合物，对人体有良好的抗焦虑和消炎作用。中国热科院海口站西番莲育种团队对西番莲中三萜类的生物合成途径进行了解析，发现西番莲中三萜的生物合成途径较为独特，来自甲戊酸（MVA）和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（MEP/DOXP）两个通路，这不同于其他果树的三萜生物合成途径。在MVA途径中，起始于乙酰辅酶A，经过一系列酶促反应，生成甲戊二羟酸，再经过磷酸化和脱羧反应，最终生成异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在西番莲中，MVA途径为三萜生物合成提供了重要的前体物质。研究发现，西番莲中参与MVA途径的关键酶基因，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoAreductase）基因，在三萜合成过程中表达量较高，表明MVA途径在西番莲三萜生物合成中具有重要作用。MEP/DOXP途径则以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸为起始底物，经过多步酶促反应，也生成IPP和DMAPP。西番莲中MEP/DOXP途径的存在，进一步丰富了其IPP和DMAPP的来源，为三萜生物合成提供了更多的底物选择。该途径中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因在西番莲叶片和花中高度表达，暗示着MEP/DOXP途径在西番莲三萜合成中也发挥着不可或缺的作用。西番莲三萜生物合成途径中这两个通路的协同作用，使得西番莲能够合成丰富多样的三萜化合物。这种独特的生物合成途径，可能与西番莲的生长环境、进化历程以及其自身的生理功能密切相关。不同通路来源的IPP和DMAPP在后续的缩合、环化等反应中，可能会产生不同的中间产物和最终的三萜化合物，从而导致西番莲三萜化合物的结构和生物活性具有独特性。5.3.2关键基因在其生物合成中的作用机制研究中国热科院海口站西番莲育种团队利用同源性BLAST和系统发育分析，在转录组数据中筛选出一系列可能参与西番莲三萜化合物合成途径的候选基因。研究表明，这些候选基因在西番莲三萜生物合成中发挥着重要作用，其作用机制涉及基因表达模式和酶的催化作用等多个方面。从基因表达模式来看，大部分候选基因在叶片和/或花中高度表达。在西番莲叶片中，编码氧化鲨烯环化酶（OSC）的基因表达量较高，而OSC是三萜生物合成途径中的关键酶，它催化2,3-环氧角鲨烯发生环化反应，形成多种不同骨架结构的三萜类化合物。这表明在叶片中，三萜生物合成途径较为活跃，可能与叶片在植物的生长、防御等过程中需要合成大量具有生物活性的三萜化合物有关。花中一些参与三萜生物合成后期修饰过程的基因，如编码糖基转移酶（GT）的基因表达量较高。糖基转移酶负责将糖基连接到三萜类化合物上，形成三萜皂苷，花中高表达的糖基转移酶基因可能参与了三萜皂苷的合成，这对于花的发育、繁殖以及吸引传粉者等方面可能具有重要意义。在酶的催化作用方面，筛选出的关键基因编码的酶在西番莲三萜生物合成中具有特定的催化功能。西番莲中筛选出的角鲨烯合酶（SQS）基因，其编码的角鲨烯合酶能够催化两分子法尼基焦磷酸（FPP）发生尾-尾缩合反应，生成角鲨烯。角鲨烯是三萜生物合成的重要前体，SQS的催化作用是三萜生物合成的关键步骤之一。实验表明，在体外表达西番莲SQS基因，并将其编码的酶与FPP底物混合，能够检测到角鲨烯的生成，证实了该基因编码的酶在角鲨烯合成中的催化功能。氧化鲨烯环化酶（OSC）基因在西番莲三萜生物合成中也具有关键作用。不同的OSC基因编码的酶具有不同的催化特异性，能够催化2,3-环氧角鲨烯生成不同的三萜骨架。西番莲中可能存在多种OSC基因，其中一种OSC基因编码的酶能够催化2,3-环氧角鲨烯生成β-香树脂醇，β-香树脂醇是五环三萜类化合物的重要前体。通过基因克隆和体外酶活性测定实验，验证了该OSC基因编码的酶对β-香树脂醇合成的催化作用。这些关键基因及其编码的酶的协同作用，共同推动了西番莲三萜化合物的生物合成，使其能够合成具有独特结构和生物活性的三萜化合物。六、研究成果与展望6.1研究成果总结本研究通过多组学数据整合分析、基因克隆与功能验证等方法，成功挖掘出了多种重要三萜化合物的关键合成基因。在黄芪三萜皂苷的研究中，鉴定出了环阿屯醇合成酶（AmOSC3）、细胞色素氧化酶（AmCYP88D25）、尿苷二磷酸糖基转移酶（AmGT11）等关键基因，这些基因在黄芪三萜皂苷的骨架合成、修饰以及糖基化等过程中发挥着关键作用。在西番莲三萜化合物的研究中，利用同源性BLAST和系统发育分析，筛选出一系列可能参与三萜化合物合成途径的候选基因，其中角鲨烯合酶（SQS）基因、氧化鲨烯环化酶（OSC）基因等在西番莲三萜生物合成中具有重要的催化功能。对三萜化合物的生物合成途径进行了深入解析。不仅详细阐述了经典生物合成途径中从甲戊二羟酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径生成异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），再经过一系列反应生成三萜化合物的过程，还发现了新型生物合成途径。武汉大学刘天罡教授团队发现的丝状真菌来源的I型嵌合萜类合酶TvTS和MpMS，能够直接利用IPP和DMAPP合成全新三萜骨架，打破了传统认知，丰富了三萜化合物生物合成机制的多样性。通过比较经典途径和新型途径在底物、酶、反应步骤等方面的差异，明确了不同生物合成途径在三萜化合物合成中的重要意义。深入研究了关键合成基因在生物合成中的作用机制。关键基因编码的酶，如鲨烯合酶（SQS）、氧化鲨烯环化酶（OSC）、糖基转移酶（GT）等，在三萜化合物生物合成的不同阶段发挥着重要功能。基因表达调控对三萜化合物生物合成也有着重要影响，转录因子、表观遗传学修饰以及非编码RNA等都参与了基因表达的调控过程。在拟南芥中，bHLH型转录因子和茉莉酸（JA）信号共同调控三萜生物合成基因的表达；在植物三萜皂苷的生物合成中，DNA甲基化和组蛋白修饰等表观