生物制药技术专业试题及答案

生物制药技术专业试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.在CHO细胞中表达单克隆抗体时，最常用的高表达载体启动子是A.CMV即刻早期启动子B.SV40早期启动子C.EF1α启动子D.U6启动子答案：A解析：CMV即刻早期启动子（humancytomegalovirusmajorimmediate-earlypromoter）在哺乳动物细胞中具有极强的转录活性，是目前工业界CHO表达系统首选的强启动子。2.下列哪项不是影响蛋白A亲和层析回收率的主要因素A.洗脱pH过低B.上样流速过快C.柱床高度过高D.树脂配基脱落答案：C解析：柱床高度主要影响柱压与分离度，对蛋白A亲和回收率无显著影响；其余三项均可导致抗体变性或结合效率下降。3.依据ICHQ5E指南，对生物制品变更进行可比性研究时，首要考察的质量属性是A.蛋白质含量B.一级结构C.糖基化谱D.生物活性答案：D解析：生物活性直接关联临床疗效，是可比性研究的核心指标；结构确证与糖型分析为支持性数据。4.在Fed-batch培养中，为降低乳酸积累，最合理的策略是A.将培养温度从37℃降至33℃B.将葡萄糖浓度控制在0.5gL⁻¹以下C.添加丁酸钠增强表达D.提高渗透压至500mOsmkg⁻¹答案：B解析：低葡萄糖浓度可减少糖酵解通量，抑制乳酸脱氢酶途径，是工业界验证有效的乳酸控制手段。5.用于测定单抗电荷异构体的cIEF（毛细管等电聚焦）中，常用的阳极电解质是A.磷酸B.氢氧化钠C.甲酸D.硫酸答案：A解析：cIEF阳极需用酸性电解质，磷酸（pH≈2）最为常用，可提供稳定梯度。6.对E.coli表达包涵体蛋白进行变复性时，最经典的变性剂是A.8molL⁻¹尿素B.6molL⁻¹盐酸胍C.2%SDSD.50mmolL⁻¹DTT答案：B解析：盐酸胍（GuHCl）溶解力强，对蛋白一级结构破坏小，复性后活性回收率高。7.在生物反应器放大中，保持下列哪一参数恒定最能确保混合时间不变A.P/V（单位体积功率）B.叶尖速度C.氧传质系数kLaD.雷诺数Re答案：D解析：雷诺数决定流动状态，Re恒定则湍流程度相似，混合时间可近似不变。8.下列哪种病毒清除验证模型病毒属于非脂包膜病毒A.MuLVB.SV40C.PRVD.X-MuLV答案：B解析：SV40为小DNA病毒，无脂包膜，抗性强，常用于验证“顽固”病毒清除。9.对ADC药物进行DAR（药物抗体比）测定，首选的质谱模式为A.ESI-TOF正离子全扫描B.MALDI-TOF线性正离子C.QTOF源内CIDD.Orbitrap高分辨负离子答案：A解析：ESI-TOF可在天然条件下保持非共价复合物完整，正离子模式对IgG信号响应最佳。10.依据FDA2022年新版“生物类似药可互换性指南”，可互换性临床互换研究周期最短可为A.1次给药周期B.2次给药周期C.3次给药周期D.4次给药周期答案：A解析：对于部分PK高度相似且安全窗口宽的产品，FDA允许采用单周期“交替”设计，显著降低患者负担。二、配伍选择题（每题1.5分，共15分）A.离子交换层析（IEX）B.疏水层析（HIC）C.体积排阻层析（SEC）D.羟基磷灰石层析（CHT）E.亲和层析（AC）11.去除聚集体首选（）12.去除HCP效果最佳（）13.去除蛋白A脱落配基首选（）14.分离电荷异构体首选（）15.分离不同糖型抗体首选（）答案：11-C12-A13-B14-A15-D解析：SEC按分子大小分离，可高效去除聚集体；IEX利用电荷差异，对HCP去除效率高；HIC在高盐条件下结合抗体，蛋白A配基疏水性弱而流穿；CHT对糖基化敏感，可区分糖型。三、判断题（每题1分，共10分，正确打“√”，错误打“×”）16.在DOE设计中，Plackett-Burman设计可用于筛选超过20个因素。（√）17.对于双特异性抗体，仅采用还原CE-SDS即可准确定量纯度。（×）18.连续灌流培养中，细胞截留装置切向流过滤（TFF）比交替切向流（ATF）更易形成凝胶层。（√）19.采用Pichiapastoris表达系统时，O-糖基化位点通常低于哺乳动物细胞。（√）20.病毒灭活工艺中，低pH孵育对非脂包膜病毒同样高效。（×）21.在生物反应器放大过程中，保持kLa恒定能确保CO₂去除速率不变。（×）22.对mRNA疫苗进行脂质纳米颗粒（LNP）包封率测定时，可采用RiboGreen荧光法。（√）23.使用CDFortiCHO培养基可完全避免细胞结团现象。（×）24.依据EMA指南，生物类似药外推适应症需提供所有适应症的临床数据。（×）25.对单抗进行强制降解试验时，光照条件常用ICHQ1B选项2即1.2×10⁶lux·h。（√）四、填空题（每空1分，共15分）26.在Fed-batch培养中，谷氨酰胺浓度通常控制在________mmolL⁻¹以下，以抑制________积累。答案：2；氨27.依据Beer-Lambert定律，当单抗摩尔消光系数ε=210000Lmol⁻¹cm⁻¹，路径长1cm，测得A₂₈₀=1.05，则其浓度为________mgmL⁻¹。答案：c28.对E.coliBL21(DE3)进行T7表达时，常用诱导剂IPTG的终浓度为________mmolL⁻¹。答案：0.529.在病毒清除研究中，LRV（LogReductionValue）≥________被视为有效清除步骤。答案：430.采用CE-SDS测定单抗纯度时，非还原条件下重链+轻链总峰面积应≥________%。答案：9531.对ADC药物进行体外释放试验，常用________酶模拟溶酶体环境，其最适pH为________。答案：CathepsinB；5.032.在CHO基因组中，通过CRISPR/Cas9敲除FUT8基因可获得________型糖基化，增强________效应。答案：Afucosylated；ADCC33.对mRNA进行毛细管电泳时，常用________涂层毛细管以抑制RNA吸附。答案：聚乙烯醇（PVA）34.依据Stokes-Einstein方程，颗粒扩散系数D与温度T成________比，与粘度η成________比。答案：正；反35.在生物反应器放大中，若保持P/V不变，则10m³反应器的搅拌功率约为10L反应器的________倍。答案：1000五、简答题（每题8分，共40分）36.简述影响单抗高甘露糖型（Man5）比例的主要细胞培养因素，并给出两项可控策略。答案：（1）培养基甘露糖浓度：高甘露糖底物促进Man5合成；可通过降低甘露糖补料或改用半乳糖替代。（2）培养温度：降温（如33℃）抑制高尔基体α-甘露糖苷酶活性，减少Man5加工；可在指数后期降温至30℃。（3）渗透压：高渗（>400mOsmkg⁻¹）抑制糖基转移酶，增加Man5；可通过降低补料浓度或添加甜菜碱调节。（4）细胞比生长速率μ：高μ导致蛋白转运加快，糖基化不完全；可实施限制性葡萄糖feeding使μ<0.03h⁻¹。综合策略：①采用动态补糖算法，将葡萄糖控制在0.3–0.8gL⁻¹；②在第3天降温至30℃并维持。37.说明如何利用质量源于设计（QbD）理念开发病毒灭活低pH步骤，并列出关键控制策略。答案：步骤1：确定目标质量概况（QTPP）——要求病毒LRV≥5且抗体聚体增加<0.5%。步骤2：风险评估（FMEA）——识别pH、时间、温度、蛋白浓度、缓冲体系为高风险因素。步骤3：实验设计（DoE）——采用Box-Behnken设计，考察pH3.4–3.8、时间30–120min、温度15–25℃。步骤4：建立设计空间——回归模型显示pH≤3.6、时间≥60min、温度≥18℃时LRV≥5且聚体<0.5%。步骤5：制定控制策略——在线pH电极±0.05校准，每批记录实际pH轨迹；时间由自动化阀门联锁；温度通过夹套PID控制；设定蛋白浓度≤5mgmL⁻¹以降低保护效应；采用柠檬酸-磷酸缓冲维持离子强度150mmolL⁻¹。步骤6：持续验证——每10批进行加标病毒验证，LRV≥5；聚体监测采用SEC-MALS，趋势分析纳入CPV（持续工艺验证）计划。38.描述利用CRISPR/Cas9敲除CHO细胞谷氨酰胺合成酶（GS）基因的实验流程，并说明如何筛选高表达克隆。答案：（1）sgRNA设计：在GS基因（NM_001257096）外显子2选择5'-GAGTACGCCGCGAGCGTGCA-3'，GC含量60%，脱靶分析全基因组≤1。（2）载体构建：将sgRNA克隆至pX330-Cas9-2A-GFP，测序验证。（3）转染：CHO-K1细胞以2×10⁶cellsmL⁻¹接种，使用Lonza4D-Nucleofector，程序CA-137，质粒用量5μg。（4）单细胞分选：转染24h后，通过FACS将GFP+细胞单克隆至96孔板，每孔1cell。（5）基因型鉴定：培养7天后提取基因组，采用PCR扩增外显子2（引物F:5'-TGGCGACCTGATACCGTTA-3'，R:5'-CGCAGTAGCGGATGTTGA-3'），产物送NGS，计算Indel率；挑选Indel>80%的克隆。（6）功能验证：将克隆接种于无谷氨酰胺CD-CHO培养基，存活者即为GS⁻/⁻；同时采用Westernblot检测GS蛋白缺失。（7）表达载体转染：将携带目标抗体及GSmini-gene的pEE12.4载体电转至GS⁻/⁻宿主，使用MSX（50μmolL⁻¹）加压筛选14天。（8）高表达筛选：通过96深孔板Fed-batch培养，取上清用Octet测定抗体浓度，挑选>3gL⁻¹的克隆；再进行悬浮批培养验证，最终获得单克隆来源细胞库（MCB）。39.解释如何利用氢氘交换质谱（HDX-MS）研究单抗与抗原结合表位，并给出数据解析步骤。答案：（1）样品制备：将单抗与抗原按摩尔比1:1.2混合，25℃孵育30min；同时准备未结合对照。（2）氘标记：将样品分别稀释10倍至D₂O缓冲液（pD7.0），25℃标记10s–4h系列时间点；用淬灭缓冲液（0.1%TFA，0℃）终止。（3）酶解：通过固定化胃蛋白酶柱（2℃，50μLmin⁻¹）在线酶解，产生肽段。（4）LC-MS分析：采用C18捕集柱（1mm×5mm）脱盐，随后进入高分辨OrbitrapFusion，质量分辨率120000，质量精度<2ppm。（5）肽段鉴定：使用ProteomeDiscoverer2.4，设置母离子质量容差5ppm，碎片0.5Da，酶切规则“无酶”，N端允许+0.984Da（氘化）。（6）氘代率计算：D（7）差异映射：将结合组与游离组氘代率差值ΔD>0.5Da且p<0.05的肽段定位至晶体结构（PDBID:6ABC），利用PyMOL插件显示保护区域；保护区域即为潜在表位。（8）验证：对关键肽段进行丙氨酸扫描突变，SPR测定KD变化，确认表位残基。40.某生物制药企业拟将10L中试规模连续灌流工艺放大至500L商业化规模，已知中试使用ATF-4（0.2m²），细胞密度维持80×10⁶cellsmL⁻¹，灌流速1vesselvolumeperday（VVD）。请计算：（1）500L规模所需ATF面积；（2）若改用TFF，所需切向流速率（Lm⁻²h⁻¹，LMH）为多少？（假设细胞比滤速0.2Lm⁻²h⁻¹per10⁶cellsmL⁻¹）答案：（1）面积放大按细胞数量比例：=（2）总细胞数=500L×80×10⁶cellsmL⁻¹=4×10¹³cells所需滤速=4×10¹³×0.2/10⁶=8000Lh⁻¹LMH=8000Lh⁻¹/10m²=800LMH解析：ATF面积与体积成正比即可维持相同滤速；TFF需高LMH，需采用多组0.5m²中空纤维并联，并控制回流压<0.3bar，避免凝胶层。六、综合设计题（共30分）41.某新型双特异性抗体（BsAb）同时靶向CD3与CD19，分子量150kDa，采用CHO表达，初步纯化路线为：ProteinA→低pH病毒灭活→中和→阴离子交换（AEX）→病毒过滤（VF）→超滤浓缩。试回答：（1）ProteinA洗脱后样品pH3.5，聚体由2%升至8%，请设计一种在线稀释-中和策略，使聚体增量<1%，并给出混合模型方程；（10分）（2）AEX步骤需去除HCP、DNA、蛋白A脱落配基，请给出pH-电导设计空间，并说明如何验证；（10分）（3）VF步骤要求病毒LRV≥4，但初始滴度仅10⁶pfumL⁻¹，如