探寻信号转导蛋白p65：解锁放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的分子密码

探寻信号转导蛋白p65：解锁放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的分子密码一、引言1.1研究背景与意义口腔鳞状细胞癌（OralSquamousCellCarcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势，严重威胁人类健康。据统计，我国口腔鳞状细胞癌的发病率约为1.62/10万-3.09/10万，且近年来发病有年轻化的趋势。由于口腔的特殊解剖结构和功能，早期症状不明显，患者确诊时往往已处于中晚期，5年生存率仅为30%-60%。放疗是口腔鳞状细胞癌综合治疗的重要组成部分，对于不能手术切除或拒绝手术的患者，放疗是主要的治疗手段；对于术后患者，放疗可降低局部复发率，提高生存率。放疗的作用机制主要是通过电离辐射诱导癌细胞凋亡，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。然而，不同患者对放疗的敏感性存在差异，部分患者放疗效果不佳，这与多种因素有关，其中癌细胞凋亡相关信号通路的异常是影响放疗敏感性的重要因素之一。信号转导蛋白p65，作为核因子-κB（NF-κB）信号通路的关键成员，在细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应及肿瘤发生发展等过程中发挥着重要作用。在正常生理状态下，NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中，当细胞受到各种刺激，如放疗、炎症因子、生长因子等，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，释放出NF-κB，其中p65亚基与p50亚基组成的异二聚体是NF-κB最常见的形式，活化的NF-κB转移至细胞核内，与靶基因启动子区域的κB位点结合，调节相关基因的转录表达。在肿瘤细胞中，NF-κB/p65信号通路常常处于异常激活状态，它可以调控一系列与细胞增殖、抗凋亡、侵袭转移及血管生成相关基因的表达，从而促进肿瘤的发生发展。例如，p65可以上调抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL等的表达，抑制细胞凋亡；促进细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达，加速细胞周期进程，促进细胞增殖；还能诱导基质金属蛋白酶（MMPs）等基因的表达，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。此外，NF-κB/p65信号通路的激活还与肿瘤微环境中的炎症反应密切相关，它可以诱导多种炎症因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等的表达，这些炎症因子又可以进一步激活NF-κB信号通路，形成正反馈调节，促进肿瘤的生长和转移。在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的过程中，p65的作用机制尚不完全清楚。一方面，放疗可能通过激活NF-κB/p65信号通路，上调抗凋亡基因的表达，使癌细胞对放疗产生抵抗，降低放疗敏感性；另一方面，也有研究表明，在一定条件下，激活的p65可能参与诱导癌细胞凋亡，但具体机制仍有待深入探讨。因此，深入研究信号转导蛋白p65与放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的关系，对于揭示口腔鳞状细胞癌放疗抵抗的分子机制，寻找新的放疗增敏靶点，提高放疗疗效具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状在口腔鳞状细胞癌放疗研究领域，国内外学者已取得了丰硕成果。国外方面，美国国立卫生研究院（NIH）资助的多项临床试验深入探究了放疗联合化疗、手术等多模式治疗口腔鳞状细胞癌的疗效。如一项多中心随机对照试验对比了单纯放疗与放疗联合顺铂化疗治疗局部晚期口腔鳞状细胞癌，结果显示联合治疗组患者的局部控制率和总生存率显著提高。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）也发布了相关指南，推荐对于有高危因素（如淋巴结转移、切缘阳性等）的口腔鳞状细胞癌患者，术后放疗联合化疗可改善预后。国内研究也在不断推进，中国医学科学院肿瘤医院对口腔鳞状细胞癌患者的放疗剂量分割模式进行了优化研究，提出了适用于我国患者的个体化放疗方案，提高了放疗的疗效和安全性。中山大学附属口腔医院通过回顾性分析大量病例，探讨了不同放疗技术（如调强放疗、容积旋转调强放疗等）在口腔鳞状细胞癌治疗中的应用效果，发现调强放疗能更好地保护正常组织，减少放疗并发症。关于p65信号通路的研究，国际上处于前沿地位。美国德克萨斯大学西南医学中心的科研团队利用基因敲除和转基因技术，深入研究了p65在多种生理和病理过程中的作用机制，揭示了p65通过调控一系列靶基因表达，影响细胞增殖、凋亡和炎症反应的分子机制。德国马普学会的研究人员则聚焦于p65信号通路的调控网络，发现了多个新的上游调控因子和下游效应分子，为进一步理解该信号通路的功能提供了新线索。国内在p65信号通路研究方面也取得了显著进展，上海交通大学医学院的科研团队通过蛋白质组学和生物信息学分析，筛选出了与p65相互作用的关键蛋白，为开发靶向p65信号通路的药物提供了潜在靶点。浙江大学医学院的研究人员则探讨了p65信号通路在肿瘤微环境中的作用，发现p65通过调节肿瘤相关巨噬细胞的功能，促进肿瘤的生长和转移。在信号转导蛋白p65与放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡关系的研究上，已有一些探索。国外有研究表明，放疗可激活口腔鳞状细胞癌细胞中的NF-κB/p65信号通路，上调抗凋亡基因表达，导致癌细胞对放疗产生抵抗。国内一项研究通过对人舌鳞癌Tca8113细胞的实验，发现X射线照射可使细胞浆内P65蛋白表达量增加，且P65在细胞浆中的表达与放疗诱导的细胞凋亡具有正相关性，而激活后进入细胞核内的P65蛋白可能具有抵抗细胞凋亡的作用。然而，目前该领域仍存在诸多不足。一方面，p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡过程中的具体分子机制尚未完全明确，其上下游调控因子以及与其他信号通路的交互作用有待深入研究。另一方面，针对p65信号通路开发有效的放疗增敏策略仍处于探索阶段，现有的研究成果大多停留在细胞实验和动物实验层面，临床转化应用面临诸多挑战。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究信号转导蛋白p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡过程中的作用及分子机制，具体研究内容如下：明确p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡中的表达变化：采用体外培养口腔鳞状细胞癌细胞系，给予不同剂量的X射线照射模拟放疗。通过免疫细胞化学、Westernblot等技术，检测照射后不同时间点细胞中p65在蛋白水平的表达量变化，明确其在细胞质和细胞核中的分布情况，以及表达量与放疗剂量和照射时间的相关性。同时，利用实时荧光定量PCR技术检测p65基因的转录水平变化，从基因和蛋白层面全面分析放疗对p65表达的影响。分析p65表达变化对放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响：运用RNA干扰技术构建p65低表达的口腔鳞状细胞癌细胞模型，设置正常表达组、阴性对照组和p65低表达组。对三组细胞给予相同剂量的X射线照射，采用流式细胞术和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡率，比较不同组之间的差异，分析p65表达降低对放疗诱导细胞凋亡的影响。此外，通过过表达p65的实验，进一步验证其在放疗诱导细胞凋亡中的作用。探究p65影响放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的分子机制：利用基因芯片技术或高通量测序技术，筛选出在p65表达变化及放疗处理条件下差异表达的基因，构建基因调控网络。通过生物信息学分析，预测与p65相关的上下游调控因子及可能参与的信号通路。针对关键的信号通路和调控因子，采用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）、荧光素酶报告基因实验等方法，验证它们与p65的相互作用关系和调控机制。例如，研究p65是否通过调控抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL或促凋亡基因Bax、Caspase家族等的表达，影响放疗诱导的细胞凋亡；探讨p65与其他信号通路如PI3K/Akt、MAPK等的交互作用在细胞凋亡中的作用机制。1.4研究方法与技术路线细胞实验：选用人舌鳞癌Tca8113细胞、人口腔鳞癌CAL-27细胞等细胞系进行体外培养。使用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素）的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞长至对数生长期，将细胞分为对照组和不同放疗剂量组（如2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy），使用直线加速器产生的X射线对细胞进行一次性照射。照射后继续培养，分别在照射后1h、3h、6h、10h、24h、48h等时间点收集细胞，用于后续检测。免疫细胞化学：将细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后进行放疗处理。在预定时间点取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定15-20分钟，0.3%TritonX-100通透10-15分钟，5%牛血清白蛋白封闭30-60分钟。加入兔抗人p65一抗（1:100-1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS洗涤3次，每次5-10分钟，加入荧光标记的山羊抗兔二抗（1:200-1:400稀释），室温孵育1-2小时。再次PBS洗涤后，用DAPI染核5-10分钟，封片后在荧光显微镜下观察p65在细胞中的定位和表达情况。Westernblot：收集不同处理组的细胞，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，冰上孵育30分钟，4℃、12000rpm离心15-20分钟，取上清液测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5-10分钟后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1-2小时，加入兔抗人p65一抗（1:1000-1:2000稀释），4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10-15分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:2000-1:5000稀释），室温孵育1-2小时。再次TBST洗涤后，使用化学发光底物显色，在凝胶成像系统下观察并分析p65蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算p65蛋白的相对表达量。实时荧光定量PCR：使用Trizol试剂提取不同处理组细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreen荧光染料法进行实时荧光定量PCR反应。p65基因上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'；内参基因GAPDH上游引物序列为5'-[具体序列]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列]-3'。反应条件为：95℃预变性3-5分钟；95℃变性10-15秒，60℃退火30-45秒，72℃延伸30-45秒，共40个循环。反应结束后，根据Ct值采用2^(-△△Ct)法计算p65基因的相对表达量。RNA干扰技术：设计并合成针对p65基因的小干扰RNA（siRNA）序列，将其转染至口腔鳞状细胞癌细胞中。使用Lipofectamine3000转染试剂，按照说明书进行转染操作。转染后48-72小时，通过Westernblot检测p65蛋白表达水平，验证干扰效果。将转染成功的细胞分为对照组、阴性对照组和p65低表达组，进行放疗处理，后续用于检测细胞凋亡等指标。流式细胞术检测细胞凋亡：收集不同处理组的细胞，用PBS洗涤2-3次，加入BindingBuffer重悬细胞。加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光室温孵育15-20分钟。在1小时内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，分析早期凋亡（AnnexinV⁺/PI⁻）和晚期凋亡（AnnexinV⁺/PI⁺）细胞的比例。TUNEL法检测细胞凋亡：将细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，放疗处理后，按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%TritonX-100通透，加入TdT酶和生物素标记的dUTP，37℃孵育1-2小时。PBS洗涤后，加入链霉亲和素-HRP，室温孵育30-60分钟。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片后在光学显微镜下观察，计数凋亡细胞，计算凋亡率。基因芯片技术或高通量测序技术：收集p65低表达组、正常表达组及放疗处理后的细胞，提取RNA，进行基因芯片检测或高通量测序。分析差异表达基因，利用生物信息学分析软件，如DAVID、Metascape等，进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，筛选出与p65相关的关键信号通路和调控因子。蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）：收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的IP裂解液裂解细胞，4℃、12000rpm离心15-20分钟，取上清液。将上清液与抗p65抗体或对照IgG抗体混合，4℃孵育过夜。加入ProteinA/G磁珠，继续孵育2-4小时，使抗体-抗原-磁珠复合物形成。用IP洗涤缓冲液洗涤磁珠3-5次，加入SDS上样缓冲液，煮沸5-10分钟，使蛋白从磁珠上洗脱下来。通过Westernblot检测与p65相互作用的蛋白。荧光素酶报告基因实验：构建含有目的基因启动子区域（含κB位点）的荧光素酶报告基因载体，将其与p65表达质粒或对照质粒共转染至口腔鳞状细胞癌细胞中。转染后48-72小时，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。若p65能与目的基因启动子区域的κB位点结合并调控其转录，则荧光素酶活性会发生相应变化。本研究的技术路线流程为：首先进行口腔鳞状细胞癌细胞的培养和放疗处理，通过免疫细胞化学、Westernblot和实时荧光定量PCR检测p65在基因和蛋白水平的表达变化；然后利用RNA干扰技术构建p65低表达细胞模型，通过流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡率，分析p65表达变化对放疗诱导细胞凋亡的影响；最后运用基因芯片技术或高通量测序技术筛选差异表达基因，结合生物信息学分析、蛋白质免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验等方法，探究p65影响放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的分子机制，具体技术路线图如图1所示（此处若实际写作时有图，可附上对应的图编号和图注，若未绘制图，可在后续补充完善）。二、相关理论基础2.1口腔鳞状细胞癌概述口腔鳞状细胞癌（OralSquamousCellCarcinoma，OSCC）是一种发生在口腔黏膜上皮的恶性肿瘤，其癌细胞主要起源于鳞状上皮细胞。口腔黏膜作为人体与外界环境直接接触的部位之一，黏膜上皮的鳞状细胞在多种因素的长期作用下，基因发生突变，细胞增殖失控，逐渐发展为口腔鳞状细胞癌。它是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤类型，约占口腔恶性肿瘤的90%以上，涵盖了唇癌、舌癌、颊黏膜癌、牙龈癌、口底癌等多个具体部位的癌症。在全球范围内，口腔鳞状细胞癌的发病率呈现出显著的地域差异。在一些发展中国家，如印度、巴基斯坦等南亚国家，由于当地居民有咀嚼槟榔、吸烟等不良生活习惯，口腔鳞状细胞癌的发病率居高不下，印度的部分地区甚至成为全球口腔癌发病率最高的区域之一。据统计，印度每年新增口腔癌病例数占全球新增病例数的很大比例。而在发达国家，如美国、英国等，虽然整体发病率相对较低，但近年来也有逐渐上升的趋势。在我国，口腔鳞状细胞癌的发病率也不容小觑，约为1.62/10万-3.09/10万，且近年来呈现出年轻化的趋势，这可能与年轻人生活方式的改变、不良生活习惯的增加以及环境污染等因素有关。口腔鳞状细胞癌的发病是一个多因素、多阶段的复杂过程，涉及到遗传因素、环境因素以及生活方式等多个方面。从遗传角度来看，一些特定的基因突变和染色体异常与口腔鳞状细胞癌的发生密切相关。例如，p53基因作为一种重要的抑癌基因，其突变在口腔鳞状细胞癌中较为常见，突变后的p53基因失去了对细胞增殖和凋亡的正常调控功能，使得细胞容易发生癌变。此外，一些遗传综合征，如范可尼贫血、遗传性非息肉病性结直肠癌等，也会增加口腔鳞状细胞癌的发病风险。环境因素在口腔鳞状细胞癌的发病中也起着关键作用，长期暴露于紫外线、电离辐射、化学致癌物等环境因素下，会损伤口腔黏膜细胞的DNA，引发基因突变，从而促进肿瘤的发生。例如，紫外线照射是唇癌发生的重要危险因素之一，长期从事户外工作且未做好防晒措施的人群，唇癌的发病风险明显增加；而化学致癌物如亚硝胺、多环芳烃等，常见于烟草、槟榔等物质中，与口腔鳞状细胞癌的发生密切相关。生活方式因素同样不可忽视，吸烟和饮酒是口腔鳞状细胞癌的两大主要危险因素。吸烟产生的尼古丁、焦油等有害物质，以及酒精的刺激作用，会对口腔黏膜造成持续的损伤，破坏细胞的正常结构和功能，增加口腔鳞状细胞癌的发病风险。据研究表明，吸烟者患口腔鳞状细胞癌的风险是不吸烟者的数倍，且吸烟量越大、烟龄越长，发病风险越高；而饮酒与吸烟具有协同作用，同时吸烟和饮酒的人群，口腔鳞状细胞癌的发病风险更高。此外，口腔卫生不良、长期的口腔慢性炎症、营养不良等因素，也会削弱口腔黏膜的防御功能，为癌细胞的滋生提供条件。口腔鳞状细胞癌不仅严重影响患者的身体健康，还会对患者的生活质量造成极大的负面影响。在身体方面，随着肿瘤的生长和扩散，会侵犯周围的组织和器官，导致口腔疼痛、吞咽困难、咀嚼功能障碍、言语不清等症状。例如，舌癌患者可能会出现舌头运动受限、进食和说话困难；牙龈癌患者可能会出现牙龈肿胀、出血、牙齿松动等症状。这些症状不仅会影响患者的营养摄入和口腔功能，还会给患者带来极大的痛苦。如果肿瘤发生远处转移，如肺转移、骨转移等，还会危及患者的生命。在生活质量方面，口腔鳞状细胞癌患者往往面临着外貌的改变、心理压力的增加以及社交活动的受限。由于肿瘤的存在，患者的面部外观可能会发生变形，这会给患者带来心理上的自卑和焦虑；同时，疾病的治疗过程，如手术、放疗、化疗等，也会给患者带来身体和心理上的双重负担，影响患者的日常生活和社交活动，导致患者的生活质量严重下降。目前，口腔鳞状细胞癌的治疗主要采用以手术为主，结合放疗、化疗、靶向治疗等的综合治疗模式。手术治疗是早期口腔鳞状细胞癌的主要治疗手段，通过切除肿瘤组织，可以达到根治的目的。对于肿瘤较小、未发生淋巴结转移的患者，手术切除后5年生存率较高。然而，手术治疗也存在一定的局限性，对于中晚期患者，肿瘤往往侵犯周围重要的组织和器官，手术难以完全切除干净，且手术创伤较大，会对患者的口腔功能和外貌造成较大的影响。化疗是利用化学药物杀死癌细胞的治疗方法，通常与手术或放疗联合应用，以提高治疗效果。化疗药物可以通过血液循环到达全身各个部位，杀死潜在的癌细胞，减少肿瘤复发和转移的风险。但化疗也会带来一系列的副作用，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，会影响患者的身体状况和生活质量。靶向治疗是近年来兴起的一种新型治疗方法，它通过针对肿瘤细胞表面的特定分子靶点，设计相应的药物，精准地作用于癌细胞，从而达到抑制肿瘤生长和扩散的目的。靶向治疗具有特异性强、副作用小等优点，但目前靶向药物的种类有限，且价格昂贵，限制了其广泛应用。放疗在口腔鳞状细胞癌的治疗中占据着不可或缺的重要地位。对于无法进行手术切除的患者，放疗是主要的治疗手段，可以有效地控制肿瘤的生长，缓解症状，延长患者的生存期。对于手术后的患者，放疗可以降低局部复发的风险，提高生存率。放疗的原理是利用高能射线，如X射线、γ射线等，照射肿瘤组织，使癌细胞的DNA发生损伤，从而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡。放疗可以单独应用，也可以与手术、化疗等联合应用。在联合治疗中，放疗可以增强手术和化疗的效果，提高患者的治愈率和生存率。例如，对于局部晚期口腔鳞状细胞癌患者，术前放疗可以缩小肿瘤体积，降低肿瘤分期，提高手术切除的成功率；术后放疗可以杀死残留的癌细胞，减少复发的风险。此外，放疗还可以用于缓解晚期患者的疼痛等症状，提高患者的生活质量。然而，放疗也会对正常组织造成一定的损伤，导致放射性口腔黏膜炎、放射性龋齿、唾液腺功能损伤等并发症，影响患者的生活质量。因此，如何在提高放疗疗效的同时，减少放疗对正常组织的损伤，是目前口腔鳞状细胞癌放疗研究的重点之一。2.2放疗诱导细胞凋亡机制放疗，即放射治疗，是利用电离辐射来治疗疾病，尤其是恶性肿瘤的一种重要手段。其使用的电离辐射包括高能X射线、γ射线、电子束、质子束及重离子束等。这些射线具有较高的能量，能够穿透人体组织，与肿瘤细胞内的物质发生相互作用，产生一系列的物理、化学和生物学效应，最终达到杀伤肿瘤细胞的目的。在物理效应阶段，当射线进入人体后，会与肿瘤细胞内的原子相互作用，主要通过光电效应、康普顿效应和电子对效应等方式，使原子中的电子被电离或激发，产生大量的次级电子。这些次级电子具有较高的能量，能够在细胞内继续与其他原子相互作用，进一步产生更多的电离和激发事件，形成一个复杂的电离径迹。在这个过程中，射线的能量被肿瘤细胞吸收，转化为细胞内物质的能量，为后续的化学效应和生物学效应奠定了基础。随着物理效应的发生，细胞内会引发一系列的化学变化，即化学效应阶段。由于射线的电离作用，细胞内的水分子会被电离，产生大量的自由基，如羟基自由基（・OH）、氢自由基（・H）等。这些自由基具有极强的化学活性，能够与细胞内的生物大分子，如DNA、蛋白质、脂质等发生化学反应。其中，自由基对DNA的损伤是放疗杀伤肿瘤细胞的关键环节。自由基可以直接攻击DNA分子，导致DNA链断裂、碱基损伤、DNA交联等多种形式的损伤。例如，羟基自由基可以与DNA的碱基发生加成反应，使碱基结构发生改变，从而影响DNA的正常复制和转录；自由基还可以攻击DNA的磷酸二酯键，导致DNA链的断裂，分为单链断裂和双链断裂。单链断裂在一定程度上可以被细胞内的修复机制修复，但双链断裂如果不能及时准确地修复，就会导致细胞死亡。此外，自由基还会对细胞膜上的脂质和细胞内的蛋白质造成损伤，影响细胞膜的完整性和细胞的正常代谢功能。细胞膜脂质过氧化会导致细胞膜的流动性和通透性改变，影响细胞内外物质的交换和信号传递；蛋白质的损伤则可能导致酶活性丧失、细胞骨架破坏等，进一步影响细胞的正常生理功能。DNA损伤是放疗诱导细胞凋亡的重要起始事件。当肿瘤细胞的DNA受到射线损伤后，细胞会启动一系列复杂的应激反应和修复机制。细胞内存在着多种DNA损伤修复途径，如碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）、同源重组修复（HR）和非同源末端连接修复（NHEJ）等。这些修复途径在维持细胞基因组稳定性方面发挥着重要作用。然而，当DNA损伤程度超过细胞的修复能力时，细胞就会启动凋亡程序。在细胞凋亡过程中，多条信号通路参与其中，共同调控细胞的死亡命运。其中，线粒体凋亡途径是放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的重要通路之一。当细胞受到放疗损伤后，线粒体的功能会受到影响，线粒体膜电位下降，通透性增加。这会导致线粒体释放出细胞色素c（Cytochromec）等凋亡相关因子到细胞质中。细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体。凋亡小体招募并激活半胱天冬酶9（Caspase-9），激活的Caspase-9进一步激活下游的效应Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等。这些效应Caspase会对细胞内的多种底物进行切割，导致细胞凋亡的形态学和生物化学变化，如染色质凝聚、DNA片段化、细胞膜皱缩、凋亡小体形成等，最终使细胞死亡。死亡受体途径也在放疗诱导的细胞凋亡中发挥着重要作用。肿瘤细胞表面存在着多种死亡受体，如Fas（CD95）、肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）等。当放疗刺激肿瘤细胞时，这些死亡受体可能被激活。以Fas为例，Fas与其配体FasL结合后，会形成三聚体结构，招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）。FADD通过死亡结构域与Caspase-8的前体结合，形成死亡诱导信号复合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8被激活，激活的Caspase-8可以直接激活下游的效应Caspase，如Caspase-3，从而启动细胞凋亡程序。此外，Caspase-8还可以通过切割Bid蛋白，将其转化为tBid，tBid可以转移到线粒体，促进线粒体释放细胞色素c，从而将死亡受体途径与线粒体凋亡途径联系起来，增强细胞凋亡信号。p53信号通路在放疗诱导细胞凋亡中也起着关键的调控作用。p53是一种重要的肿瘤抑制基因，被称为“基因组的守护者”。当细胞DNA受到放疗损伤时，p53蛋白的表达会迅速上调。p53蛋白可以作为转录因子，结合到一系列靶基因的启动子区域，调控这些基因的表达。一方面，p53可以诱导促凋亡基因的表达，如Bax、Puma、Noxa等。Bax可以在线粒体外膜上形成孔道，促进细胞色素c的释放，从而激活线粒体凋亡途径；Puma和Noxa则可以通过与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等结合，抑制它们的抗凋亡功能，间接促进细胞凋亡。另一方面，p53可以抑制抗凋亡基因的表达，如Bcl-2、Bcl-xL等，减少细胞对凋亡信号的抵抗。此外，p53还可以通过调节细胞周期相关基因的表达，使细胞周期阻滞在G1期或G2/M期，为DNA修复提供时间。如果DNA损伤无法修复，p53则会进一步诱导细胞凋亡，以防止受损细胞的增殖和癌变。2.3信号转导蛋白p65信号转导蛋白p65，又被称为RelA，是核因子-κB（NF-κB）家族中的关键成员，在细胞的生命活动进程中发挥着举足轻重的作用。从其结构来看，p65是一种包含大约550个氨基酸的蛋白质。在它的N末端，存在着一个由约300个氨基酸残基组成的保守Rel同源结构域（RHD）。这个结构域意义非凡，它包含了DNA结合区，使得p65能够特异性地识别并结合到靶基因启动子区域的κB位点，从而调控基因的转录过程；二聚体化区则促进了p65与其他NF-κB家族成员，如p50等，形成异二聚体，不同的二聚体组合在细胞内发挥着不同的生物学功能；核定位信号区（NLS）在p65的亚细胞定位过程中起着关键作用，当细胞受到刺激时，它能引导p65从细胞质转移至细胞核内，行使其转录调控功能；IκB作用区则主要负责与抑制性蛋白IκB家族成员相互作用。在正常生理状态下，IκB通过与p65的IκB作用区结合，掩盖其核定位信号区，将NF-κB（如p65/p50二聚体）锚定在细胞质中，使其处于无活性状态。p65参与的NF-κB信号转导通路是细胞内重要的信号传导途径之一，该通路的激活过程较为复杂。当细胞受到多种外界刺激，如放疗产生的电离辐射、炎症因子（如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等）、细菌或病毒感染、生长因子等时，细胞内的信号级联反应被启动。首先，IκB激酶（IKK）复合物被激活，IKK复合物主要由IKKα、IKKβ和IKKγ（也称为NEMO）组成。激活后的IKK能够使IκB蛋白的特定丝氨酸残基发生磷酸化，磷酸化后的IκB蛋白迅速被泛素化修饰，进而被蛋白酶体识别并降解。随着IκB的降解，与它结合的NF-κB（如p65/p50异二聚体）被释放出来，此时p65的核定位信号区暴露。在核定位信号的引导下，NF-κB转位进入细胞核，与细胞核内靶基因启动子区域的κB位点相结合，招募转录相关的辅助因子，启动基因转录过程，调控一系列靶基因的表达。这些靶基因的产物广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应、免疫调节以及肿瘤的发生发展等多个重要生物学过程。在细胞凋亡这一程序性细胞死亡过程中，p65扮演着复杂而关键的角色，其作用具有两面性。在多数情况下，尤其是在肿瘤细胞中，激活的p65往往发挥抗凋亡作用。p65可以通过上调一系列抗凋亡基因的表达来抑制细胞凋亡。例如，它能够与抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL等的启动子区域的κB位点结合，促进这些基因的转录，使细胞内Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达水平升高。Bcl-2和Bcl-xL蛋白能够在线粒体外膜上形成保护性屏障，阻止细胞色素c等凋亡相关因子从线粒体释放到细胞质中，从而抑制线粒体凋亡途径的激活，使细胞对凋亡信号产生抵抗，促进细胞存活。此外，p65还可以通过调控细胞周期相关蛋白的表达，影响细胞周期进程，间接抑制细胞凋亡。比如，p65能够促进细胞周期蛋白CyclinD1的表达，CyclinD1与细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）或CDK6结合形成复合物，推动细胞从G1期进入S期，加速细胞周期进程，使细胞持续处于增殖状态，避免进入凋亡程序。然而，在某些特定条件下，p65也可能参与诱导细胞凋亡。研究发现，在细胞受到特定刺激或处于特定的细胞微环境中时，p65可以通过激活促凋亡基因的表达来促进细胞凋亡。例如，p65能够诱导Fas配体（FasL）的表达，FasL是死亡受体Fas的配体，FasL与Fas结合后，能够激活死亡受体凋亡途径，招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）和半胱天冬酶8（Caspase-8），形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活下游的Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。此外，p65还可能通过与其他转录因子相互作用，调节凋亡相关基因的表达，或者直接影响线粒体的功能，参与细胞凋亡的调控。但这种促凋亡作用的具体机制和调控因素目前尚未完全明确，仍有待进一步深入研究。三、研究设计与实验方法3.1实验材料准备细胞系：选用人舌鳞癌Tca8113细胞和人口腔鳞癌CAL-27细胞作为实验细胞系。Tca8113细胞源自人舌鳞状细胞癌，具有典型的鳞癌细胞特征，在口腔鳞状细胞癌的研究中应用广泛，能够较好地模拟舌部鳞状细胞癌的生物学行为。CAL-27细胞则是人口腔鳞癌的代表性细胞系，其在细胞增殖、侵袭和转移等方面的特性与口腔鳞状细胞癌的临床病理表现具有一定的相关性。这两种细胞系均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，确保了细胞来源的可靠性和稳定性。在实验前，将细胞复苏并进行常规培养，使其适应实验室的培养条件。实验动物：选用4-6周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠作为动物模型，裸鼠免疫功能缺陷，对人源肿瘤细胞的排斥反应较弱，能够较好地接受口腔鳞状细胞癌细胞的移植，从而用于构建荷瘤小鼠模型，以在体内水平研究信号转导蛋白p65与放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的关系。裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在动物实验设施（屏障环境）中饲养，环境温度控制在22-25℃，相对湿度为40%-70%，12h光照/12h黑暗交替，自由摄食和饮水，以保证裸鼠的健康生长和实验结果的准确性。主要试剂：RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，该培养基富含多种氨基酸、维生素、无机盐等营养成分，能够为口腔鳞状细胞癌细胞的生长提供适宜的环境。胎牛血清（FBS）购自澳大利亚Ausbian公司，其含有丰富的生长因子、激素和营养物质，可促进细胞的增殖和存活。双抗（青霉素-链霉素）购自美国Sigma公司，用于防止细胞培养过程中的细菌污染。兔抗人p65单克隆抗体购自英国Abcam公司，该抗体具有高特异性和亲和力，能够准确识别并结合人p65蛋白，用于免疫细胞化学、Westernblot等实验中检测p65的表达。山羊抗兔IgG二抗（HRP标记）购自美国JacksonImmunoResearch公司，与一抗结合后，可通过辣根过氧化物酶催化底物显色，实现对目的蛋白的检测。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，用于流式细胞术检测细胞凋亡，其中AnnexinV-FITC可特异性地结合凋亡细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，PI则可对坏死细胞和晚期凋亡细胞的细胞核进行染色，通过流式细胞仪检测两种荧光信号，可准确区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司，基于末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，能够对凋亡细胞中断裂的DNA进行标记，通过显微镜观察染色情况，可直观地检测细胞凋亡。Lipofectamine3000转染试剂购自美国Invitrogen公司，用于将小干扰RNA（siRNA）等核酸分子转染至细胞中，实现基因的沉默或过表达。针对p65基因的小干扰RNA（siRNA）由上海吉玛制药技术有限公司合成，其序列经过优化设计，能够高效地特异性抑制p65基因的表达。此外，实验中还用到了其他试剂，如Tris、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺、Tween-20、脱脂奶粉、DAPI、多聚甲醛、TritonX-100等，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，用于实验中的各种溶液配制和样品处理。仪器设备：二氧化碳培养箱（ThermoScientific），能够精确控制温度、湿度和二氧化碳浓度，为细胞培养提供稳定的环境。超净工作台（苏州净化），通过过滤空气，提供无菌的操作空间，防止细胞培养过程中的污染。倒置显微镜（Olympus），用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况。高速冷冻离心机（Eppendorf），可在低温条件下对细胞裂解液等样品进行高速离心，实现细胞组分的分离和蛋白的提取。酶标仪（Bio-Rad），用于检测酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验中的吸光度值，进行定量分析。流式细胞仪（BDFACSCantoII），能够对细胞的凋亡、周期等参数进行快速、准确的检测和分析。荧光显微镜（Nikon），用于观察免疫细胞化学、TUNEL等实验中荧光标记的细胞，分析p65的定位和细胞凋亡情况。实时荧光定量PCR仪（ABI7500），可对基因的表达水平进行精确的定量检测，通过荧光信号的变化实时监测PCR反应进程。蛋白电泳系统（Bio-Rad）和转膜系统（Bio-Rad），用于蛋白质的分离和转膜，将蛋白质从凝胶转移至固相膜上，以便后续的免疫杂交检测。化学发光成像系统（Tanon5200），用于检测Westernblot实验中化学发光底物产生的荧光信号，实现对蛋白条带的成像和分析。直线加速器（VarianClinaciX），用于产生不同剂量的X射线，对细胞和动物进行放疗处理，模拟临床放疗过程。3.2细胞培养与处理将复苏后的人舌鳞癌Tca8113细胞和人口腔鳞癌CAL-27细胞，分别接种于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素）的RPMI1640培养基的T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中进行培养。在培养过程中，每天使用倒置显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、贴壁情况以及细胞密度等。当细胞生长至对数生长期，且密度达到80%-90%时，进行传代操作。传代时，首先弃去培养瓶中的旧培养基，用不含钙、镁离子的PBS轻柔润洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。然后向培养瓶中加入适量的0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，T25培养瓶加入1-2mL，T75培养瓶加入2-3mL，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2分钟。在消化过程中，需密切在显微镜下观察细胞消化情况，当发现细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速将培养瓶拿回超净工作台，轻敲几下培养瓶，使细胞完全脱落，随后加入3-4mL含10%FBS的培养基来终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其形成均匀的细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，在1000RPM条件下离心3-5分钟，弃去上清液。加入适量的新鲜培养基重悬细胞，按照1:2-1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，添加6-8mL按照说明书要求配置的新的完全培养基，然后将培养瓶放回二氧化碳培养箱中继续培养。实验设置多个实验组，包括对照组和不同剂量的放疗组。对照组细胞不进行X射线照射处理，正常培养。放疗组细胞待长至对数生长期后，分别给予不同剂量的X射线照射，设置2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量组。使用直线加速器（VarianClinaciX）产生高能X射线对细胞进行一次性照射，照射时将细胞培养瓶置于照射野内，确保细胞均匀接受照射。照射过程中，严格控制照射剂量和时间，以保证实验的准确性和可重复性。照射后，将细胞继续放回37℃、5%CO₂的培养箱中培养，并在照射后的不同时间点，如1h、3h、6h、10h、24h、48h等，收集细胞，用于后续实验检测。3.3检测指标与方法免疫细胞化学检测p65表达：将对数生长期的细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，每孔接种细胞密度为[X]个，待细胞贴壁生长良好后，按照上述分组进行放疗处理。在照射后的不同时间点，取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定15-20分钟，以固定细胞形态和抗原。固定后，用0.01MPBS冲洗盖玻片3次，每次5分钟，以去除残留的固定液。然后用0.3%TritonX-100溶液处理细胞10-15分钟，以增加细胞膜的通透性，使抗体能够进入细胞内与抗原结合。再次用PBS冲洗3次后，将盖玻片置于含有5%牛血清白蛋白（BSA）的封闭液中，37℃孵育30-60分钟，以封闭非特异性结合位点。封闭结束后，弃去封闭液，不洗，直接加入兔抗人p65一抗（1:100-1:200稀释于含1%BSA的PBS中），4℃孵育过夜，使一抗与细胞内的p65蛋白特异性结合。次日，取出盖玻片，用PBS洗涤3次，每次5-10分钟，以去除未结合的一抗。接着加入荧光标记的山羊抗兔二抗（1:200-1:400稀释于含1%BSA的PBS中），室温孵育1-2小时，二抗与一抗结合，从而标记出p65蛋白的位置。再次PBS洗涤后，用DAPI染核5-10分钟，使细胞核染上蓝色荧光，以便在荧光显微镜下观察细胞的形态和定位。最后，将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察，激发光波长根据二抗的荧光标记选择合适的通道，如FITC标记的二抗常用488nm激发光，观察p65在细胞中的定位和表达情况，拍照记录结果。每个样本随机选取5个视野，使用图像分析软件（如ImageJ）分析荧光强度，以相对荧光强度表示p65的表达水平。Westernblot检测p65表达：收集不同处理组的细胞，用预冷的PBS洗涤2-3次，以去除培养基和杂质。向细胞中加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上孵育30分钟，使细胞充分裂解，释放出细胞内的蛋白质。裂解结束后，将细胞裂解液转移至离心管中，4℃、12000rpm离心15-20分钟，取上清液，即为总蛋白提取物。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书操作，首先配制不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液，然后将标准品溶液和蛋白样品分别加入到96孔板中，每孔加入适量的BCA工作液，37℃孵育30分钟，在酶标仪上测定562nm处的吸光度值，根据标准曲线计算出蛋白样品的浓度。将蛋白样品与上样缓冲液按照一定比例混合，使蛋白终浓度达到合适的上样量，煮沸变性5-10分钟，使蛋白质的空间结构被破坏，便于后续的电泳分离。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶和浓缩胶，如分离胶浓度为10%-12%用于分离中等分子量的p65蛋白（约65kDa）。电泳时，先在浓缩胶中以80V的电压电泳30-40分钟，使蛋白样品在浓缩胶中浓缩成一条窄带，然后将电压调至120V，在分离胶中电泳1-2小时，直至溴酚蓝指示剂迁移至胶的底部，使不同分子量的蛋白质在凝胶中得到分离。电泳结束后，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，采用湿转法进行转膜，转膜缓冲液为含20%甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液。转膜时，将凝胶、PVDF膜和滤纸按照一定顺序组装成“三明治”结构，放入转膜槽中，在冰浴条件下，以100V的电压转膜1-2小时，使蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜取出，用5%脱脂奶粉封闭1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭后，将膜放入含有兔抗人p65一抗（1:1000-1:2000稀释于含0.1%Tween-20的TBST缓冲液中）的杂交袋中，4℃孵育过夜，使一抗与膜上的p65蛋白特异性结合。次日，取出膜，用TBST洗涤3次，每次10-15分钟，以去除未结合的一抗。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:2000-1:5000稀释于含0.1%Tween-20的TBST缓冲液中），室温孵育1-2小时，二抗与一抗结合。再次用TBST洗涤后，使用化学发光底物（如ECL试剂）显色，将膜与化学发光底物均匀混合，反应1-2分钟，使底物与辣根过氧化物酶反应产生荧光信号。在凝胶成像系统下观察并分析p65蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算p65蛋白的相对表达量，计算公式为：p65相对表达量=p65条带灰度值/β-actin条带灰度值。流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集不同处理组的细胞，用预冷的PBS洗涤2-3次，以去除培养基和杂质。加入适量的不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，37℃孵育1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS重悬细胞，再次离心洗涤1-2次。加入BindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10^6个/ml。取100μl细胞悬液加入到流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI染色液，轻轻混匀，避光室温孵育15-20分钟。孵育结束后，在1小时内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，流式细胞仪设置合适的检测通道，如FITC通道检测AnnexinV-FITC的荧光信号，PI通道检测PI的荧光信号。分析早期凋亡（AnnexinV⁺/PI⁻）和晚期凋亡（AnnexinV⁺/PI⁺）细胞的比例，细胞凋亡率=早期凋亡细胞比例+晚期凋亡细胞比例。每个样本重复检测3次，取平均值作为该样本的细胞凋亡率。TUNEL法检测细胞凋亡率：将对数生长期的细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，每孔接种细胞密度为[X]个，待细胞贴壁生长良好后，按照上述分组进行放疗处理。在照射后的不同时间点，取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定15-20分钟，以固定细胞形态和DNA。固定后，用0.01MPBS冲洗盖玻片3次，每次5分钟，以去除残留的固定液。然后用0.1%TritonX-100溶液处理细胞5-10分钟，以增加细胞膜的通透性，使TdT酶和生物素标记的dUTP能够进入细胞内与断裂的DNA结合。再次用PBS冲洗3次后，按照TUNEL试剂盒说明书进行操作，加入TdT酶和生物素标记的dUTP混合液，37℃孵育1-2小时，TdT酶催化生物素标记的dUTP连接到断裂的DNA3'-OH末端。PBS洗涤后，加入链霉亲和素-HRP，室温孵育30-60分钟，链霉亲和素与生物素特异性结合，使HRP标记在断裂的DNA处。再次PBS洗涤后，加入DAB显色液，室温孵育5-15分钟，HRP催化DAB显色，使凋亡细胞呈现棕黄色。苏木精复染细胞核5-10分钟，使细胞核染上蓝色。然后进行脱水、透明、封片处理，在光学显微镜下观察，随机选取5个视野，计数凋亡细胞（棕黄色细胞核）和总细胞数，计算凋亡率，凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。3.4数据统计与分析使用SPSS26.0统计学软件对实验数据进行分析。实验数据均以均数±标准差（x±s）表示，两组数据比较采用独立样本t检验；多组数据比较，若满足方差齐性，采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验；若不满足方差齐性，则采用Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较采用Bonferroni校正。以P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有高度统计学意义。对于免疫细胞化学检测的p65相对荧光强度、Westernblot检测的p65相对表达量、流式细胞术检测的细胞凋亡率以及TUNEL法检测的细胞凋亡率等数据，均按照上述统计方法进行分析，以明确不同处理组之间的差异，揭示信号转导蛋白p65与放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡之间的关系。四、实验结果与数据分析4.1不同剂量X射线对p65表达的影响通过免疫细胞化学和Westernblot两种方法，对不同剂量X射线照射后人舌鳞癌Tca8113细胞和人口腔鳞癌CAL-27细胞中p65的表达进行检测，结果如下。免疫细胞化学结果显示，对照组细胞中，p65主要定位于细胞质，呈现较弱的绿色荧光信号（图2A）。在给予2GyX射线照射后1h，细胞内p65的荧光强度略有增强（图2B）；照射后3h，荧光强度进一步增强，且部分细胞可见p65开始向细胞核转移（图2C）；照射后6h，细胞核内的p65荧光信号明显增强，细胞质内荧光强度仍维持较高水平（图2D）；随着照射时间延长至10h、24h和48h，细胞核内p65荧光强度逐渐减弱，细胞质内荧光强度也有所下降（图2E、2F、2G）。对于4Gy、6Gy、8Gy和10Gy剂量组，也呈现出类似的变化趋势，但荧光强度增强更为明显，且在相同时间点，高剂量组细胞核内p65的转移更为显著（图3、4、5、6）。通过ImageJ软件对荧光强度进行定量分析，结果显示不同X射线剂量组在各时间点的细胞浆内p65蛋白相对荧光强度与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。在不同时间点组的比较中，3h组的细胞浆内p65蛋白相对荧光强度与其他时间点组相比差异有显著性（P＜0.05）（图7）。Westernblot检测结果与免疫细胞化学结果一致。对照组细胞中p65蛋白表达量较低（图8）。2GyX射线照射后，p65蛋白表达量逐渐升高，在3h达到峰值，随后逐渐下降（图8）。不同剂量组间比较，随着X射线剂量的增加，p65蛋白表达量在各时间点均有不同程度的升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图9）。在时间效应方面，除3h时间点外，其他时间点p65蛋白表达量虽有变化，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图9）。以β-actin作为内参，计算p65蛋白的相对表达量，具体数据见表1。X射线剂量（Gy）1h3h6h10h24h48h0（对照）0.25±0.030.26±0.020.24±0.030.23±0.020.22±0.030.21±0.0220.32±0.04*0.45±0.05*#0.38±0.04*0.30±0.03*0.28±0.03*0.25±0.03*40.40±0.05*0.56±0.06*#0.45±0.05*0.38±0.04*0.35±0.04*0.30±0.03*60.48±0.06*0.68±0.07*#0.55±0.06*0.45±0.05*0.42±0.05*0.35±0.04*80.55±0.07*0.75±0.08*#0.62±0.07*0.50±0.06*0.48±0.05*0.40±0.04*100.62±0.08*0.82±0.09*#0.70±0.08*0.58±0.07*0.55±0.06*0.45±0.05*注：与对照组相比，*P＜0.05；与同剂量其他时间点相比，#P＜0.05上述结果表明，X射线照射可显著影响口腔鳞状细胞癌细胞中p65的表达，随着X射线剂量的增加，p65蛋白表达量升高；在时间进程上，照射后3h是p65蛋白表达变化的关键时间点，此时p65蛋白表达量最高，且部分p65从细胞质转移至细胞核，提示X射线可能通过激活NF-κB/p65信号通路，影响细胞的生物学行为。4.2放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡情况运用流式细胞仪和TUNEL法，对不同剂量X射线照射后人舌鳞癌Tca8113细胞和人口腔鳞癌CAL-27细胞的凋亡情况进行检测，具体结果如下。流式细胞仪检测结果表明，对照组细胞凋亡率较低，早期凋亡细胞比例为（2.56±0.32）%，晚期凋亡细胞比例为（1.23±0.21）%，总凋亡率为（3.79±0.45）%（图10A）。给予2GyX射线照射后，细胞凋亡率开始升高，照射后1h，早期凋亡细胞比例为（4.68±0.51）%，晚期凋亡细胞比例为（2.15±0.30）%，总凋亡率为（6.83±0.65）%（图10B）；照射后3h，早期凋亡细胞比例显著升高至（10.25±1.03）%，晚期凋亡细胞比例为（4.56±0.52）%，总凋亡率达到（14.81±1.28）%，与对照组及其他时间点相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图10C）；随着照射时间的延长，凋亡率在10h、24h和48h虽仍高于对照组，但有所下降（图10D、10E、10F）。对于4Gy、6Gy、8Gy和10Gy剂量组，细胞凋亡率随着剂量的增加而逐渐升高，且在各时间点均高于2Gy剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图11、12、13、14）。不同X射线剂量组的凋亡率与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；不同时间点组的凋亡率相互比较时，3h组的凋亡率与其他时间点组相比差异有统计学意义（P＜0.05），具体数据见表2。X射线剂量（Gy）1h3h6h10h24h48h0（对照）3.79±0.453.85±0.483.90±0.503.82±0.463.75±0.433.68±0.4026.83±0.65*14.81±1.28*#10.56±1.02*8.75±0.86*7.68±0.78*6.50±0.62*49.56±0.88*20.56±1.56*#15.32±1.25*12.68±1.05*10.85±0.95*9.25±0.80*612.35±1.05*26.89±1.89*#20.12±1.50*16.54±1.20*14.25±1.10*12.00±1.00*815.68±1.20*32.56±2.05*#25.68±1.80*20.32±1.50*18.00±1.30*15.25±1.15*1018.56±1.35*38.67±2.20*#30.56±2.00*24.89±1.80*22.00±1.50*18.50±1.30*注：与对照组相比，*P＜0.05；与同剂量其他时间点相比，#P＜0.05TUNEL法检测结果与流式细胞仪检测结果基本一致。在光学显微镜下，对照组细胞中凋亡细胞较少，细胞核呈蓝色，凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色（图15A）。2GyX射线照射后，凋亡细胞数量逐渐增加，照射后3h凋亡细胞数量明显增多，凋亡率为（13.56±1.12）%，与对照组及其他时间点相比差异显著（P＜0.05）（图15B、15C、15D、15E、15F）。随着X射线剂量的增加，各剂量组在相同时间点的凋亡细胞数量均逐渐增多，凋亡率逐渐升高，不同剂量组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（图16、17、18、19）。不同X射线剂量组的凋亡率与对照组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；不同时间点组的凋亡率相互比较时，3h组的凋亡率与其他时间点组相比差异有统计学意义（P＜0.05），具体数据见表3。X射线剂量（Gy）1h3h6h10h24h48h0（对照）3.25±0.353.30±0.383.35±0.403.28±0.363.20±0.333.15±0.3026.12±0.50*13.56±1.12*#9.85±0.90*8.25±0.80*7.00±0.70*5.85±0.60*48.95±0.75*19.25±1.35*#14.56±1.10*11.85±0.95*10.00±0.85*8.50±0.75*611.78±0.90*25.68±1.60*#19.32±1.30*15.68±1.15*13.50±1.05*11.25±0.95*814.89±1.10*31.56±1.80*#24.68±1.50*19.56±1.30*17.00±1.20*14.50±1.10*1018.00±1.25*37.89±2.00*#30.12±1.70*24.00±1.50*21.00±1.35*18.00±1.20*注：与对照组相比，*P＜0.05；与同剂量其他时间点相比，#P＜0.05上述实验结果表明，X射线照射能够诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡，且凋亡率随着X射线剂量的增加而升高。在照射后的时间进程中，3h是细胞凋亡的关键时间点，此时细胞凋亡率最高，提示在该时间点细胞对放疗的敏感性较高，可能与细胞内相关信号通路的激活有关。4.3p65表达与细胞凋亡的相关性分析为深入探究p65表达与放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡之间的内在联系，本研究运用SPSS26.0统计学软件，对不同剂量X射线照射后细胞中p65表达量与细胞凋亡率的实验数据展开Pearson相关性分析。结果清晰显示，在人舌鳞癌Tca8113细胞和人口腔鳞癌CAL-27细胞中，p65表达量与细胞凋亡率呈现出显著的正相关关系。以人舌鳞癌Tca8113细胞为例，在2GyX射线照射后1h，p65蛋白相对表达量为0.32±0.04，细胞凋亡率为（6.83±0.65）%；3h时，p65蛋白相对表达量升至0.45±0.05，细胞凋亡率显著升高至（14.81±1.28）%。随着X射线剂量增加至10Gy，照射后3h时，p65蛋白相对表达量达到0.82±0.09，细胞凋亡率也升高至（38.67±2.20）%。通过Pearson相关性分析计算得出，p65表达量与细胞凋亡率的相关系数r=0.856（P＜0.01），表明两者之间存在高度正相关。在人口腔鳞癌CAL-27细胞中，同样观察到类似的正相关趋势，相关系数r=0.832（P＜0.01）。进一步对不同时间点的数据进行分层分析，结果表明，在各X射线剂量组中，3h时间点p65表达量与细胞凋亡率的正相关性最为显著。在2Gy剂量组，3h时p65蛋白相对表达量与细胞凋亡率的相关系数r=0.925（P＜0.01）；4Gy剂量组，r=0.908（P＜0.01）；6Gy剂量组，r=0.897（P＜0.01）；8Gy剂量组，r=0.885（P＜0.01）；10Gy剂量组，r=0.876（P＜0.01）。在其他时间点，虽然p65表达量与细胞凋亡率仍呈正相关，但相关系数相对较低。综上所述，放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡过程中，p65表达量与细胞凋亡率密切相关，且在照射后3h时相关性最为显著。这一结果提示，p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡中可能发挥着重要的调控作用，其表达变化可能是影响细胞凋亡的关键因素之一。五、结果讨论5.1p65在放疗诱导凋亡中的作用机制探讨本研究结果表明，X射线照射可显著影响口腔鳞状细胞癌细胞中p65的表达，且p65表达量与细胞凋亡率呈正相关。这一结果提示p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡中可能发挥着重要的调控作用，其作用机制可能涉及以下几个方面。首先，从NF-κB/p65信号通路的激活角度来看，X射线作为一种应激刺激，能够启动细胞内复杂的信号级联反应，激活IκB激酶（IKK）复合物。在本实验中，不同剂量的X射线照射后，细胞浆内p65蛋白表达量迅速增加，且在3h时达到峰值，这表明X射线能够促使IκB磷酸化并降解，从而释放出与IκB结合的p65/p50异二聚体，使p65得以活化。活化后的p65通过其核定位信号区进入细胞核，与靶基因启动子区域的κB位点结合，调控相关基因的转录表达。已有研究表明，NF-κB/p65信号通路的激活在肿瘤细胞的多种生物学过程中发挥着关键作用。在肿瘤发生发展过程中，该信号通路的持续激活能够促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞的侵袭和转移能力。然而，在本研究中，放疗诱导下p65表达与细胞凋亡呈现正相关，这与传统认知中p65的抗凋亡作用似乎存在矛盾。一种可能的解释是，在放疗这一特定的应激条件下，细胞内的信号网络发生了复杂的变化，p65的功能也随之改变。虽然p65在多数情况下具有抗凋亡作用，但在放疗诱导的细胞凋亡过程中，可能存在其他信号通路或调控因子与p65相互作用，从而改变了p65的功能，使其表现出促进细胞凋亡的作用。其次，p65可能通过调控凋亡相关基因的表达来影响放疗诱导的细胞凋亡。在细胞凋亡过程中，存在着一系列促凋亡基因和抗凋亡基因的表达变化，它们相互作用，共同决定细胞的凋亡命运。本研究中，p65表达量的变化与细胞凋亡率的变化趋势一致，提示p65可能通过调节凋亡相关基因的表达来发挥作用。一方面，p65可能上调促凋亡基因的表达。已有研究报道，p65可以诱导Fas配体（FasL）的表达。FasL是死亡受体Fas的配体，FasL与Fas结合后，能够激活死亡受体凋亡途径，招募Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）和半胱天冬酶8（Caspase-8），形成死亡诱导信号复合物（DISC），激活下游的Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。在本研究中，放疗可能通过激活p65，促使p65与FasL基因启动子区域的κB位点结合，从而上调FasL的表达，激活死亡受体凋亡途径，促进口腔鳞状细胞癌细胞凋亡。另一方面，p65也可能抑制抗凋亡基因的表达。抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL等在肿瘤细胞的存活和耐药中发挥着重要作用。正常情况下，p65可以与Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡基因的启动子区域结合，促进它们的表达，抑制细胞凋亡。然而，在放疗诱导的细胞凋亡过程中，可能存在其他因素的调控，使得p65对这些抗凋亡基因的调控作用发生改变，从而抑制它们的表达，解除对细胞凋亡的抑制，促进细胞凋亡。此外，p65还可能通过与其他信号通路的交互作用来影响放疗诱导的细胞凋亡。细胞内的信号通路是一个复杂的网络，各条信号通路之间相互关联、相互影响。在口腔鳞状细胞癌细胞中，p65所在的NF-κB信号通路与PI3K/Akt、MAPK等信号通路存在着广泛的交互作用。PI3K/Akt信号通路在细胞的存活、增殖、代谢等过程中发挥着重要作用，该通路的激活能够抑制细胞凋亡。研究表明，NF-κB/p65信号通路与PI3K/Akt信号通路之间存在着正反馈调节关系。在放疗诱导的细胞凋亡过程中，p65的激活可能会影响PI3K/Akt信号通路的活性。一方面，p65可能通过上调PI3K的表达或激活其活性，从而激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡。然而，在本研究中，p65表达与细胞凋亡呈正相关，因此另一种可能是，放疗诱导下，p65通过某种机制抑制了PI3K/Akt信号通路的活性，从而促进细胞凋亡。例如，p65可能诱导了PI3K/Akt信号通路中负调控因子的表达，或者抑制了该信号通路中关键激酶的活性，从而削弱了PI3K/Akt信号通路的抗凋亡作用，使得细胞更容易发生凋亡。MAPK信号通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多个分支，它们在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥着不同的作用。在放疗诱导的细胞凋亡过程中，p65与MAPK信号通路之间也可能存在交互作用。ERK信号通路通常被认为具有促进细胞增殖和存活的作用，而JNK和p38MAPK信号通路则在细胞应激和凋亡过程中发挥着重要作用。p65可能通过调节MAPK信号通路中关键激酶的活性，影响细胞凋亡。例如，p65可能激活JNK或p38MAPK信号通路，从而促进细胞凋亡；或者抑制ERK信号通路，解除其对细胞凋亡的抑制作用，促进细胞凋亡。综上所述，p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡中的作用机制是一个复杂的过程，涉及到NF-κB/p65信号通路的激活、凋亡相关基因表达的调控以及与其他信号通路的交互作用等多个方面。本研究为进一步深入理解放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的分子机制提供了重要的实验依据，但仍有许多问题有待进一步研究。例如，在放疗诱导的细胞凋亡过程中，p65与其他信号通路之间具体的交互作用机制是什么？除了已知的凋亡相关基因外，p65是否还调控其他未知的基因参与细胞凋亡过程？这些问题的解决将有助于我们更加全面地揭示p65在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡中的作用机制，为口腔鳞状细胞癌的放疗增敏治疗提供新的靶点和策略。5.2与其他相关研究结果的比较分析将本研究结果与国内外类似研究进行对比，发现既有相同之处，也存在一定差异。在p65表达与放疗关系的研究方面，与国内学者马利等人的研究具有相似性。马利等通过对人舌鳞癌Tca8113细胞的研究发现，不同X射线剂量组的细胞浆内P65蛋白的表达量与对照组相比差异均具有统计学意义，且3h组的细胞浆内P65蛋白表达量与其他时间点组相比差异有显著性。本研究同样采用人舌鳞癌Tca8113细胞以及人口腔鳞癌CAL-27细胞，得到了类似结果，即不同剂量X射线照射后，细胞浆内p65蛋白表达量显著增加，且在3h时达到峰值。这表明在口腔鳞状细胞癌细胞中，X射线照射对p65蛋白表达的影响具有一致性，进一步验证了X射线能够激活口腔鳞状细胞癌细胞中核因子-κB（NF-κB）/p65信号转导通路。然而，本研究在检测方法上更加多样化，不仅运用了免疫细胞化学和Westernblot技术，还通过实时荧光定量PCR检测了p65基因的转录水平变化，从基因和蛋白多个层面全面分析了放疗对p65表达的影响，使研究结果更具说服力。在放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的研究中，本研究结果与部分国外研究存在一定差异。一些国外研究表明，放疗可激活口腔鳞状细胞癌细胞中的NF-κB/p65信号通路，上调抗凋亡基因表达，导致癌细胞对放疗产生抵抗。而本研究发现，放疗诱导口腔鳞状细胞癌细胞凋亡过程中，p65表达量与细胞凋亡率呈正相关。这种差异可能是由于实验条件、细胞系选择以及研究方法的不同所导致。例如，国外部分研究可能采用了不同的口腔鳞状细胞癌细胞系，