第二章核酸的化学资料

第二章核酸的化学

In1944,Avery,MacLeod,andMcCartyfoundthatDNApreparedfromavirulentstrainofpneumococcuscouldtransformanonvirulentstrainofthisorganismintoavirulentone.VirulentbacteriaMousediesNonvirulentbacteriaMouselivesAveryOT,MacLeodCM,McCartyM(1944)J.Exp.Med.79:137.

Nonvirulentbacteria

DNAcarriedageneticmessagefromonetypeofcellscouldbeassimilatedandexpressedbyanothertypeofcells.Conclusion:遗传物质包括脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcids，DNA）和核糖核酸（RibonucleicAcids，RNA

），以DNA为主。DNA主要存在于细胞核中，细胞器如线粒体、叶绿体中也存在少量DNA；RNA主要存在于细胞质中，核内较少，主要作用是“转录”遗传信息。二、核酸的组成成分

核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间结构的大分子化合物。核蛋白磷酸核苷

碱基

戊糖蛋白质

核酸→核苷酸（一）核糖和脱氧核糖DNA和RNA只是所含的戊糖不同。RNA含β-D-核糖，DNA含β-D-脱氧核糖，某些RNA中含有少量的D-2-O-甲基核糖。戊糖（pentose）的结构

β-D-核糖β-D-2-脱氧核糖β-D-2-O-甲基核糖（二）嘌呤碱和嘧啶碱DNA和RNA都含有腺嘌呤（adenine,A）和鸟嘌呤（guanine,G）；两者所含的嘧啶有所差异，RNA含胞嘧啶（cytosine,C）和尿嘧啶（uracil,U）；DNA含胞嘧啶和胸腺嘧啶（thymine,T）。嘌呤腺嘌呤A鸟嘌呤G16789嘧啶胞嘧啶C胸腺嘧啶T尿嘧啶U16修饰碱基（modifiedbase）

也称为稀有碱基（minorbase），是4种主要碱基的衍生物。tRNA中修饰碱基较多，有些甚至可达总量的10％。U：尿嘧啶；I：次黄嘌呤；ψ：假尿嘧啶；D：二氢尿嘧啶含氧碱基的异构体含氧碱基有酮式和烯醇式两种类型的，异构体，在生理pH和体内碱基主要以酮式异构体的形式存在。uracil酮式

uracil烯醇式（三）核苷（nucleotide）由核糖或脱氧核糖与嘌呤或嘧啶碱生成的糖苷。糖的第1位C原子（C1’）与嘌呤的第9位N原子和嘧啶的第1位N原子相连。核苷中戊糖与碱基的连接方式

腺嘌呤核苷（adenosine）胞嘧啶脱氧核苷（deoxycytidne）(ψ)OCH2HHOHHOHHHO

(pseudouridine)HNNHOO51'假尿嘧啶核苷核苷

核糖核苷（核苷）：A、G、C、U

脱氧核糖核苷（脱氧核苷）：dA、dG、dC、dT

修饰核苷修饰核苷包括三种情况:（1）由修饰碱基和糖组成的核苷；（2）由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷；（3）由碱基与糖连接方式特殊的核苷。修饰核苷的简写符号

少数修饰核苷用单字符号如D、ψ、I；但大多数修饰核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。

取代基用下列小写英文字母表示甲基m乙酰基ac氨基n甲硫基ms羟基o或h硫基s异戊烯基i羧基c（四）核苷酸核苷酸是核苷的磷酸酯。核苷的2’，3’

，5’都有-OH可以和磷酸形成核苷酸；而脱氧核苷只有3’

和5’-OH可以形成核苷酸。体内游离的核苷酸多为５’-核苷酸。腺苷（一磷）酸AMP、鸟苷酸GMP；脱氧胞苷酸dCMP、脱氧胸腺苷酸dTMP。DNA或RNA被酶水解后，除5’-核苷酸外还有3’-核苷酸。5’-腺苷酸写作：pA；3’-鸟苷酸写作Gp；2’-磷酸酯写作Cp2’。核苷二磷酸：ADP、GDP、CDP、UDP核苷三磷酸：ATP、GTP、CTP、UTPdADP核苷酸的作用ATP：化学能的贮藏和利用（高能磷酸键）UTP：糖的互相转化与合成（UDPG）CTP：磷脂的合成GTP：蛋白质和嘌呤的合成辅酶Ⅰ－NAD＋、辅酶Ⅱ－NADP＋、黄素腺嘌呤二核苷酸－FADATP类的高能磷酸化合物

AMPADPATP第二信使（secondmessenger）是一些激素发挥生理作用的媒介物（细胞外信号分子产生的细胞内信号分子），如Ca2+、cAMP（环化腺苷酸）。cGMP是cAMP的拮抗物。寡核苷酸多磷酸对代谢的调节作用。第二信使环化腺苷酸cAMP（五）核苷酸的连接方式DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链。核苷酸的连接方式为3’,5’-磷酸二酯键。磷酸和戊糖交替出现在主链上。DNA和RNA都由于具有磷酸基团而带负电性，在电泳时向正极移动。DNA和RNA都有方向性。DNARNA核酸的一级结构各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺序（序列）称为核酸的一级结构。核酸的多样性：核苷酸的数目、比例和序列的不同构成不同的核酸。一级结构可以用碱基序列来表示。DNA分子中核苷酸的序列测定英国Sanger，1975年加减法，1977年末端终止法美国Maxam和Gilbert，1977年化学断裂法（需要放射性标记）核苷酸的写法pA：磷酸位于5’位；Ap：磷酸位于3’位。表示核酸酶的水解位置和产物时用简写如pApCpGpU、pApCp、GpU。三、DNA的结构（一）DNA的一级结构DNA是由4种dNTP通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成，DNA的一级结构就是指这些脱氧核苷酸在分子中的排列顺序（序列）。（二）DNA的双螺旋二级结构DNA双螺旋结构是由Watson和Crick于1953年提出的。1.双螺旋结构模型的主要依据（1）X射线衍射数据Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相同的X射线衍射图谱，说明DNA可能有共同的分子模型。模型说明DNA具有两条螺旋结构，并且沿长轴有0.34nm和3.4nm两个重要周期性变化。RosalindFranklin’sX-raydiffractionBasedoninformationfromx-raydiffractionpatternofDNA,Dr.Franklindeducedthat

X-raydiagramofDNAshowsthefeaturescharacteristicofhelicalstructures.DNAfibershavetwoperiodicities.Amajoroneof3.4Aasecondaryoneof34A.ThediameterofthesuggestedhelicalstructureofDNAis20A.(A:Angstrom)（2）关于碱基成对的证据Chargaff等应用层析法发现DNA中的A与T的数目相等，G与C的数目相等；后人又发现A与T之间有两个氢键，而G与C之间有三个氢键。ErwinChargaff从不同生物当中测定了DNA的碱基组成DNA中的碱基组成Dr.Chargaffdiscoveredthat（3）电位滴定行为电位滴定法证明：DNA中的磷酸可以滴定；碱基中的可解离基团不能滴定，说明是由氢键连接起来的。2.双螺旋结构模型的要点（1）DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成的。两条链都是右手螺旋，螺旋表面有一条大沟和一条小沟。（2）两条链上的碱基均在主链的内侧，A与T配对，形成两个氢键；G与C配对形成三个氢键，螺旋的直径为2nm。大沟与小沟堆积的碱基对碱基互补碱基之间的配对关系称为碱基互补。根据碱基互补的原则，已知一条链的碱基序列可以推测另一条链的序列。DNA复制即通过碱基配的原则对由亲代DNA合成新的DNA链。DNAreplicationsuggestedbyWatsonandCrickOldNew（3）成对碱基大致处于同一平面，并与螺旋轴垂直，糖平面与螺旋轴平行，磷酸基边在糖环的外侧。相邻碱基间的距离为0.34nm，每周10个碱基，每周高度3.4nm。双链的大小用bp表示，单链用b表示。（4）大多数天然DNA是双链结构（dsDNA），少数为单链分子DNA（ssDNA）。（5）双链DNA分子主链上的化学键受碱基配对等因素影响旋转受到限制，使DNA分子比较刚硬，呈比较伸展的结构。但一些化学键变可在一定范围内旋转，使DNA分子有一定的柔韧性。稳定DNA双螺旋结构的化学键（1）互补碱基对之间的氢键（2）碱基堆积力（base-stackingforces）（3）磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键

3.DNA双螺旋的构象类型DNA结构有多种类型。相对湿度92％的DNA钠盐得到的是B-DNA，细胞内的DNA与B-DNA非常相似。相对湿度75％的DNA钠盐结构为A-DNA。A-DNA的碱基平面倾斜了20°，A-DNA与RNA以及DNA-RNA杂交分子在溶液中的构象很接近。1979年Rich发现了左手螺旋DNA，主链呈锯齿形左向盘绕，称为Z-DNA。直径1.8nm，螺距4.5nm，螺旋每一转含12个碱基对，分子细长伸展，碱基对偏离中心轴并靠近螺旋外侧，只有小沟没有大沟。当dGC被甲基化时，B-DNA转化为Z-DNA，这可能跟基因的调控有关。表2-2螺旋DNA的类型其他DNA类型C-DNA：在相对湿度44％-46%时的构象，螺距3.09nm，每转9.33个碱基对，倾斜6°，可能是B-DNA向A-DNA转化的中间物。D-DNA：出现在A、T交替区，每个螺旋8个碱基对。螺距2.43nm，倾斜16°。（三）DNA的三级结构DNA双螺旋进一步扭曲即构成三级结构。双链环状DNA（doublestrandedcyclicDNA,dcDNA）:双链环状DNA在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体DNA、细菌质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA等。

DNA双链线状双链环状单链线状：动物病毒MVM单链环状：噬菌体φX174真核细胞染色体DNA噬菌体T2，T5，T7，λ，P22

E-Coli染色体DNA线粒体DNA叶绿体DNA多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA噬菌体λ和φX174的复制型超螺旋（superhelicalstructure）双链DNA进一步扭曲成超螺旋结构。超螺旋结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋和负超螺旋。正超螺旋：左手；负超螺旋：右手；负超螺旋更多核小体模型（nucleosome）R.Kornberg建立了核小体模型。①每个核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1；②由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成核心颗粒；③DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80bp，共1.75圈，约146bp，两端被H1锁合；④相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。核小体模型染色质纤维四、DNA和基因组（一）DNA与基因转录（transcription）：根据碱基配对的方式由DNA合成RNA的过程。RNA的类型：mRNA、tRNA、rRNA。翻译（translation）：由mRNA指导合成蛋白质的过程。中心法则thecentraldogma基因（gene）：遗传学中最小的功能单位称为基因，编码RNA或蛋白质的基因称为结构基因，具有调节功能的称调节基因。基因组（genome）：某种生物所含有的全部基因称为该生物体的基因组。（二）原核生物基组的特点1.除调节序列和信号序列外，DNA大部分是为蛋白质编码的结构基因，且每个基因在DNA分子中只出现一次或几次。2.功能相关的基因常串联在一起，并转录在同一mRNA分子中（操纵子），这种现象在真核生物中很少见。3.有基因重叠现象，例如φX174的E基因全部包括在D基因内，B基因则全部包括在A基因内。这种现象主要存在于病毒分子中，可能是由于DNA分子太小，又要装入相当数量基因的缘故。φX174的基因组（三）真核生物基因组的特点1.有重复序列真核生物DNA分子中有睦序列可重复多次，根据重复次数的多少可分为：（1）单拷贝序列（2）中度重复序列（3）高度重复序列在整个DNA分子中只出现一次或少数几次，主要是编码蛋白质的结构基因。单拷贝序列在人体的细胞中约占DNA总量的一半。在DNA分子中可重复几十次到几千次，rRNA基因、tRNA基因和某些蛋白质基因属中度重复序列。在DNA总量的30%-40%。可重复几百万次，多数为小于10bp的短序列。一般位于异染色质上，多数不编码蛋白质或RNA，可能与染色体结构的形成及基因表达的调控有关。卫星DNA（satelliteDNA）：富含AT或GC的区域。主体DNA卫星DNA2.有断裂基因外显子（exons）和内含子（introns）：编码蛋白质的DNA序列称为外显子，而非编码序列称为内含子。由于内含子的存在使真核生物的基因成为不连续基因或断裂基因（splitgene）。常用分子杂交和电镜技术相结合的手段研究断裂基因的结构。有功能或“成熟”mRNA只能与为之编码的DNA区域形成DNA－RNA杂交分子，不能结合的内含子形成环状结构。鸡卵清蛋白基因的结构五、RNA的结构和功能大多数RNA为单链，许多区域自身发生回折，通过A-U，G-C的方式配对，形成双螺旋（40％-70％）。RNA是一条含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链。典型的RNA结构RNA的类型mRNA、tRNA、rRNAmRNA前体-核内不均一RNA（hnRNA）核内小RNA-snRNA反义RNA-asRNA（一）tRNA占RNA总量的15％左右。主要功能：将氨基酸运输到核糖体-mRNA复合物的相应位置，用于合成蛋白质。一种氨基酸可以有一种以上的tRNA。tRNA的二级结构－三叶草形1965年Holley提出了酵母丙氨酸的三叶草二级结构模型。（1）aa接受臂（aminoacidarm）（2）二氢尿嘧啶环（dihydrouridineloop,DHUloop）（3）反密码环（anticodonloop）（4）额外环（extraloop）（5）TψC环（TψCloop）三叶草结构的主要特征1.分子中由A-U、G-C碱基对构成的双螺旋区称臂，不能配对的部分称环，tRNA一般由四环四臂组成。2.5’端1-7位与近3’端的66-72位形成7bp的反平行双链称氨基酸臂，3’端有共同的-CCA-OH结构，其羟基可与该tRNA所携带的Aa形成共价键。3.第10-25位3-4个bp的臂和8-14个bp的环，由于臂上有二氢尿嘧啶（D），故称为D环，相应的臂称为D臂。4.第27-43位有5bp的反密码子臂和7b的反密码子环，其中34-36位是与mRNA相互作用的反密码子。5.第44-48位为可变环，80％的tRNA由4-5b组成，20％的tRNA由13-21b组成。6.第49-65位为5bp的TψC臂，和7b的TψC环，因环中有TψC序列而得名。7.tRNA分子中有多少不等的修饰碱基，某些位置上的核苷酸在不同的tRNA分子中很少变化，称不变核苷酸。tRNA的三级结构RNA的三级结构呈“倒L形”。倒L形结构与核糖体上的空穴相符，TψC环与5SrRNA相应区段有互补关系。（二）rRNA占细胞RNA总量的80％，40％为蛋白质，60％为rRNA。核糖体可分为大、小两个亚基。原核生物的核糖体为70S，真核生物的核糖体为80S。表2-4核糖体和所含的rRNA（三）mRNA和hnRNAmRNA占细胞总RNA的3%-5%，代谢活跃，寿命较短。原核生物的mRNA：转录与翻译偶联进行。真核生物的mRNA：转录后（hnRNA）mRNA要进行剪切，然后到细胞质内进行翻译。（四）snRNA和asRNAsnRNA存在于细胞核或细胞质内，以RNP的形式存在，在hnRNA加工、细胞分裂和分化、协助细胞质内物质运输过程中有重要作用。asRNA可与mRNA结合抑制翻译过程（iRNA，RNA干涉）。（五）RNA的其他功能1981年Cech发现RNA具有催化功能，并提出核酶（ribozyme）的概念。在RNA成熟及蛋白质合成中有重要作用。拓展了酶的概念。朊病毒－构象遗传。生命起源？？？六、核酸的性质（一）一般理化性质两性电解质，通常表现为酸性。均微溶于水，不溶于有机溶剂，可用乙醇沉淀核酸。可被酸、碱和酶水解。RNA可被稀碱水解。颜色反应可区分DNA和RNA。（二）核酸的紫外吸收性质在260nm有强烈吸收峰。可判断核酸的纯度最大吸收峰在260nm附近首先根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度纯DNA：A260/A280=1.8纯RNA：A260/A280=2.0（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低）纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA或相当于40μg/ml单链DNA或RNA或相当于20μg/ml寡核苷酸。（三）核酸结构的稳定性核酸的结构相当稳定，维持力主要有：1.碱基对间的氢键是一种较弱的作用力，但数量较多，是维持高级结构的重要因素。打开后有恢复原有状态保持分子构象的趋势。2.碱基堆积力碱基平面间的电子去间的相互作用，以及疏水碱间相互作用导致碱基堆积力的形成。是维持DNA二级结构的主要作用力。3.环境中的正离子可以消除磷酸基团间的斥力。RNA中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。

（四）核酸的变性1.变性的概念是双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称为核酸降解。增色效应（hyperchromiceffect）核酸变性后，在260nm的紫外吸收值明显增加，称增色效应。同时浮力密度升高，粘度下降，生物学功能全部或部分丧失。浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡密度梯度离心2.热变性和Tm加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度后，260nm的吸光度骤然增加，表明两链开始分开，当增加约40％以后，趋于平坦。Tm：当紫外吸收增加达到最大增量一半时的温度称为熔解温度（熔点、变性温度、解链温度等）。3.影响Tm的因素（1）G-C含量GC含量越高，Tm越高。（G+C）%=（Tm-69.3）×2.44（2）溶解的离子强度离子强度越低，Tm越低。所以核酸提取时一般用高盐TE缓冲液（1MNaCl）。（3）溶液的pH高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力，pH>11.3时，DNA完全变性。pH<5