南中大中药鉴定学实验指导

中药鉴定学实验指导总

论

实验进行之前，应认真预习，明确实验的要求和内容，思考合理的实验程序，合理安排时间，操作要认真、准确、规范，培养实事求是的作风和严谨的科学态度。实验报告书写要认真，注意实验室的安全和整洁。第一章

中药鉴定的依据《中华人民共和国药典》简称《中国药典》，是国家的药品法典，也是国家对药品质量标准及其检验方法所作的技术规定，全国的药品生产、供应、使用、检验和管理部门共同遵循的法定依据。药材记载格式和规定项目如下：中文名

汉语拼音

拉丁名

科名、植(动)物名、学名、药用部分、采收、产地加工

性状

鉴别：经验鉴别

显微鉴别

理化鉴别：化学试验、荧光现象、升华现象、色谱分析、光谱分析

检查：水分测定，灰分测定，杂质检查，膨胀度测定，吸收度测定，色度比较，pH比较，不挥发物、砷盐、铜盐、镁盐、铁盐、锌盐、重金属等及干燥失重吸水量、体积比等的测定。

浸出物测定：水浸出物、醇浸出物等

含量测定：挥发油、生物碱、苷类等

炮制：加工、切制、炮炙、炮制品

性味与归经

功能与主治

用法与用量

注意：用药注意事项

贮藏此外，尚有《中华人民共和国卫生部药品标准》，简称《部颁标准》和《中华人民共和国进口药材部标准》，是补充在同时期该版药典中尚未收载的品种和内容，如和药典不一致，应以药典为准，它也具有一定的法律性质;对药典收载的药材及成方制剂等，均应按照规定的方法进行检验。

第二章

药材鉴定取样法

药材取样法指选取供鉴定用药材样品的方法。取样的代表性直接影响到鉴定结果的正确性。因此，必须重视取样的各个环节。

一、取样前，应注意品名、产地、规格等级及包件式样是否一致，检查包装的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，详细记录。凡有异常情况的包件，应单独检验。

二、从同批药材包件中抽取检定用样品，原则如下：

药材总包件数在100件以下的，取样5件；100～1000件，按5%取样；超过1000件的，超过部分按1%取样；不足5件的，逐件取样；贵重药材,不论包件多少均逐件取样。

三、对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材，可用采样器(探子)抽取样品，每一包件至少在不同部位抽取2～3份样品，包件少的抽取总量应不少于实验用量的3倍；包件多的，每一包件的取样量一般按下列规定：一般药材100～500g；粉末状药材25g；贵重药材5～10g；个头大的药材，根据实际情况抽取代表性的样品。如药材的个体较大时，可在包件不同部位(包件大的应从10cm以下的深处)分别抽取。

四、将所取样品混和拌匀，即为总样品。对个较小的药材，应摊成正方形；依对角线划"×"字，使分为四等分,取用对角两份；再如上操作，反复数次至最后剩余的量足够完成所有必要的试验以及留样数为止，此为平均样品。个体大的药材，可用其他适当方法取平均样品。平均样品的量一般不得少于实验所需量的3倍数，即1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3则为留样保存，保存期至少1年。

第三章药材来源鉴定法

药材来源鉴定法是应用植物学或动物学或矿物学分类知识，对中药的来源进行鉴定，确定其正确的学名，以保证在应用中品种准确无误。观察原植物标本，应注意根、茎、叶、花、果实、种子等的特征，特别是花、果实、种子、孢子、子实体等繁殖器官，需进行解剖，利用放大镜或解剖镜仔细观察，参阅有关植物分类学专著，必要时可到标本室核对标本或到实地采集标本进行对照鉴别。有些植物的根、茎、叶，会受生长环境或栽培技术的影响,其形态发生较大的改变，如采用扦插法栽培的防风，根粗大、多分枝，形似当归,完全失去了原有的防风形态，进行鉴定时应引起注意。有时待鉴药材还应了解产地、生境、效用等信息资料，综合分析对照，以利于正确判断品种。原动物的鉴定步骤与原植物的鉴定类同。原矿物则运用矿物学的知识进行分类鉴定。

第四章

药材性状鉴定法

药材的性状系指药材的形状、大小、色泽、表面特征、质地、断面(包括折断面或切断面)特征及气味等。不同的药材，都有其特有的性状，利用感观，仔细辨认，能够较快的鉴别药材的真伪，此法简便、易行。

1．形状

指干燥药材的形态。观察时一般不需要预处理，如观察很皱缩的全草、叶或花类，可先浸湿使软化，展平。观察某些果实、种子时，如有必要可浸软后，取下果皮或种皮，以观察内部待征。

2．大小

指药材的长短、粗细(直径)和厚度，测量时多用毫米刻度尺，对细小的种子，可放在有毫米方格线的纸上，每10粒种子为一组，紧密排列成一行，测量后求其平均值。果实和种子类药材其大小相对稳定，目前商品中根和根茎类药材，大小差异很大，很难达到药典规定的数值。

3．色泽

药材的色泽一般应在日光灯下或常光下观察。如用两种色调复合描述色泽时，以后一种色调为主，如黄棕色，以棕色为主。药材的色泽不但帮助鉴别真伪，其色泽的深浅，有时也反映其质量的优劣，如紫草，深紫色者，紫草素含量较高。

4．表面特征

观察时样品不作予处理，直接观察，或借助于放大镜观察。叶、花或草类药材皱缩不易观察者，可水浸舒张开后观察，但应注意不可把表面的附属物处理掉，如毛茸、蜡被等。观察表面特征时，特别是附属物，要注意其颜色、形状、纹理分布等特点。必要时可对光透视。

5．质地

指药材的软硬、坚韧、疏松、致密、粘性或粉性等，样品不作预处理，软硬、坚韧多凭手的感觉而定，疏松、致密、粘性、粉性等全靠眼睛的仔细观察。

6．断面

包括折断时的现象和平整横切面的纹理特征。样品不做预处理。样品是否易折断，折断时有无粉尘，折断面的现象和纹理，如纹理不易观察，可用刀削平整后进行观察，必要时可将样品切面湿润后使一些特征显示的更清楚．再进行观察。如各类贯众叶柄残基分体中柱数和排列情况的观察。

7．气味

是药材所含成分决定的，一般可直接嗅闻或口尝，有些药材气味较弱，常采用折断时或搓揉时进行，也有的需用热水湿润后才能闻到，有些药材的味感需热水泡后尝浸出液才能辨别，有毒药材如需尝味时，应立即嗽口，注意防止中毒。

8．水试

将药材浸泡到一定量的水中，观察其形态变化，沉或浮，水的颜色变化及出现的现象等，有些药材需加热后观察如菟丝子的吐丝现象。9．火试

将药材加热或燃烧，观察产生的现象。如火上燃烧海金砂，有爆鸣声且有闪光，而血竭于滤纸上烘烤，熔融呈血红色。

第五章药材显微鉴定法

药材显微鉴别是指用显微镜(包括生物显微镜、偏光显微镜、扫描电镜等)观察药材的组织切片、粉末、解离组织或表面制片及成方制剂中药材的组织、细胞或内含物等特征的一种方法。鉴别时选择有代表性的样品，根据鉴定目的，制成合适的标本片进行观察，并将观察的特征绘制成图或制作显微摄影图。一、横切片或纵切片观察

制片方法见实验一、二。观察时应自外向内仔细观察各组织分布的位置，细胞特点，细胞内含物的类型及分布状况。总结共同点和不同点，找出鉴别的特征。一般多观察横切片，必要时制作纵切片进行观察确证，如油室和油管的区分，针晶和砂晶的区分，间隙腺毛和薄壁细胞的区分。茜草的薄壁细胞有的含针晶束，其针晶束和根的长轴平行排列，横切片观察，似砂晶，纵切片观察针晶的特征很明显。广藿香间隙腺毛，只有纵切片时，才能清楚的辨别。二、粉末制片观察制片方法见实验一、二。如观察淀粉粒等内含物的特点，应用甘油醋酸或稀甘油封片；如观察细胞的特征，应用水合氯醛试液加热透化细胞壁，并溶去一些细胞内含物如淀粉粒、蛋白质、叶绿体、挥发油等物质。进行粉末制片观察时，应上、下、左、右按顺序仔细观察，辨别鉴别特征。三、表面制片观察制片方法见实验一。较薄者材料可整体封藏，其它材料可撕取或削取表皮制片。撕取叶片时，先辨明上、下表面，干材要温浸处理。四、解离组织片观察制片方法见实验三。将已离散或即将离散的材料置于载玻片上，按部位取材，另置载玻片上加甘油溶液轻压使之散离，后加盖玻片，可观察细胞的完整的形态。有的解离试液，能溶解一部分细胞内含物，如草酸钙结晶体或碳酸钙结晶体等，操作时应引起注意。五、显微化学法观察

细胞壁和细胞内含物的性质不完全一致，可用化学试液进行检定，以利中药的鉴别。

(一)细胞壁性质的检定

1．木栓化或角质化细胞壁

多存于植物体的体表．如木栓层、表皮或表皮内方的数列细胞，加苏丹Ⅲ试液，稍置或微热，显橘红色至红色。

2．木质化细胞壁

多为厚壁组织如石细胞或纤维，木质部的输导组织如导管或管胞，有的射线细胞或输导组织以外的细胞也木化。加间苯三酚试液1～2滴，稍置再滴加盐酸1滴，因木化程度不同，显红色或紫红色。有时需稍加热，颜色才能显现。

3．纤维素细胞壁

为薄壁细胞或韧皮部输导组织的细胞壁。加氯化锌碘试液；或先加碘试液湿润后，稍放置，再加硫酸溶液(33→50)；显蓝色或紫色。

4．粘液化细胞壁

多存于表皮组织内。加钌红试液，显红色。

5．硅质化细胞壁

多存于表皮组织内。加硫酸无变化。

(二)细胞内含物性质的检定

1．淀粉粒

属碳水化台物。加碘试液显蓝色或紫色。如用甘油醋酸试液装片置偏光显微镜下观察，未糊化的淀粉粒显偏光现象，已糊化的淀粉粒无偏光现象。

2．糊粉粒

为贮藏蛋白质。加碘试液，显棕色或黄棕色。加硝酸汞试液，显砖红色。材料中如含有多量脂肪油，宜先用乙醚或石油醚脱脂后进行试验。

3．脂肪油、挥发油或树脂

加苏丹Ⅲ试液显橘红色、红色或紫红色。加90％乙醇，脂肪油不溶解(蓖麻油和巴豆油例外)，挥发油则溶解。

4．菊糖

菊糖多溶于水，观察时宜用70％乙醇或水合氯醛试液冷处理材料后，方可析出菊糖结晶。加10％α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸，显紫红色并很快溶解。

5．粘液

加钌红试液，显红色。

6．草酸钙结晶

加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。加硫酸溶液(1→2)，逐渐溶解，片刻后，析出针状硫酸钙结晶。

7．碳酸钙结晶(钟乳体)

加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。

8．硅质

加硫酸不溶解，加氢氟酸则溶解，使用氢氟酸时，应注意保护物镜。

(三)组织内所含化学成分的检定

可将材料切片或取粉末滴加试剂后置显微镜下观察，也可将提取液滴加试剂后，显微镜下观察。如丁香花萼横切片，滴加3％氢氧化钠的氯化钠饱和溶液1滴，加盖玻片，油室内可见簇状细针形丁香酚钠结晶，黄连粉末于载玻片上，滴加乙醇后即可加新配制的30％硝酸溶液1滴，加盖玻片，放置片刻即可见针形簇状硝酸小檗碱结晶。槟榔的酸性水提取液滴于载玻片上，加碘化铋钾试液1滴，置显微镜下可见到石榴红色的球晶或方晶。

六、由粉末药材制成的成方制剂的鉴别

散剂按粉末制片法制片观察；丸剂、片剂等，可取2～3丸(片)研细后，取少量样品，滴加一定的试液，搅拌均匀，使粘结的细胞、组织散离，再按粉末特征进行鉴别；蜜丸可直接挑取少量样品制片，或酌用热水洗脱蜜后制片观察。

第六章药材理化鉴定法

理化鉴别是指用化学或物理的方法，对药材中所含某些化学成分进行的鉴别实验，以鉴别药材的真伪、纯度和质量的优劣。

一、显色反应

药材中的某些化学成分与一定的试剂产生颜色反应。可以用药材的切片或粉末直接进行，如将番木鳖横剖开，于剖面上滴加1％钒酸铵的硫酸溶液，胚乳部分即显紫色(示番木鳖碱)；也可用提取液进行，如知母乙醇提取液于水浴上蒸干，残渣加浓硫酸2滴，初显黄色，继变红色、紫堇色，最后呈棕色(示甾体化合物)。

二、沉淀反应

药材中的某些成分，特别是含生物碱类的成分，与某些试剂产生不同颜色的沉淀反应，如延胡索稀醋酸提取液，加碘化汞钾试液，产生淡黄色沉淀(示生物碱)；地榆乙醇提取液，用氨试液调pH8～9，即有沉淀产生，将沉淀物溶于水，滴加1％三氯化铁试液，则呈蓝黑色(示鞣质)。

三、荧光法

中药材中的某些化学成分，能在常光或紫外光下产生荧光现象。将药材(包括断面、浸出物等)或经酸、碱处理后，置紫外灯下约10cm处观察所产生的荧光。除另有规定外，紫外光灯的波长为365nm。如黄连饮片在紫外灯下显金黄色荧光，木质部尤为显著，而浙贝母粉末显亮淡绿色荧光，秦皮的水浸液在常光下显淡蓝色荧光。芦荟水溶液需加硼砂共热才有绿色荧光。此外，可利用荧光显微镜鉴别药材，如苍术粉末中少数颗粒显海天蓝色荧光；白术粉末显芒果黄色，少数颗粒呈初熟杏黄色荧光。

药材表面如附有地衣或有某些霉菌和霉菌素时，也会有荧光现象，应注意区别。

四、微量升华法

药材中有些成分，在一定的温度下可以升华凝聚成一定的结晶体。如大黄粉末在酒精灯上加热有升华物产生，低温时呈黄色针状结晶，高温时呈片状和羽状结晶。黄色结晶体遇氢氧化钾试液，溶解呈红色。

五、分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。

一般常用波长为：200～400nm的紫外光区，400～760nm的可见光区，2．5～25μm(或按波数计为4000cm-1～400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的长度(光路长度)成正比，其关系如下式；

A＝log-1T=ECl

式中：A为吸收度；

T为透光率；

E为吸收系数，采用的表示方法是(EMBEDPBrush

)，即吸收度换算成溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm的数值；

C为100ml溶液中所含物质的重量(g，按干燥品或无水物计算)，

l为液层厚度(cm)。

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

(一)紫外分光光度法

1．仪器的校正和检定

由于温度变化对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。常用汞灯中的较强谱线237.83、253.65、275.28、296.73、313.16、334.15、365.02、404.66、435.83、546.07与576.96nm，或用仪器中氘灯的486．02与656.10nm谱线进行校正，钬玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.9、460.0、484.5、536.2与637.5nm波长处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同会有微小的差别，使用时应注意。吸收度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol／L的硫酸溶液溶解并稀释至l000ml，按下表规定的波长处测定并计算其吸收系数。规定的吸收系数如下表，相对偏差可在±1％以内。波长（nm）

235（最小）

257（最大）313（最小）

350（最大）吸收系数EMBEDPBrush

124.5

144.0

48.62

106.6

杂散光的检查可按下表的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在下表规定的波长处测定透光度，应符合表中的规定。

试剂

浓度%（g/ml）

测定波长（nm）

透光率%碘化钠

1.00%

220

＜0.8亚硝酸钠

5.00%

280

＜0.82．对溶剂的要求

测定供试品前应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求；即用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸收度，溶剂和吸收池的吸收度在220～240nm范围内不得超过0.40；在241～250nm范围内不得超过0.20；在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过O.05。

3．测定法

测定时，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，吸收峰波长应在规定的波长±2nm以内，否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准，由于吸收池本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去装有溶剂的吸收池在规定波长测得的吸收度，再计算含量。

紫外分光光度法可用于对药材及其制剂进行定性或定量实验，定性时吸收度读数范围可根据配制供试液的准确度及制剂的实际含量确定。

用于含量测定的方法一般为；

(1)对照品比较法

分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10％，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：

Ci=AiCr/Ar式中：Ci为供试品溶液的浓度；

Ai为供试品溶液的吸收度，

Cr为对照品溶液的浓度；

Ar为对照品溶液的吸收度。

(2)吸收系数法

配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。

(3)计算分光光度法

采用计算分光光度法应慎重。本法有多种，使用时应注意选择，当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，影响精度的因素较多，故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品，则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。

(二)比色法

用比色法测定时，应取对照品同时操作。比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，依次加入相应的同体积的各种试剂，并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸收度后，按紫外分光光度法的对照品比较法计算式计算供试品浓度。

当吸收度和浓度关系不呈线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸收度，然后以吸收度与相应浓度关系绘制标准曲线，再根据供试品的吸收度在标准曲线上求出其含量。

(三)红外分光光度法

1．仪器的校正和检定

绘制聚苯乙烯薄膜(厚度约为0.05mm)的光谱，用2851cm-1、1601cm-1、1028cm-1、907cm-1

处的吸收峰对仪器的波数进行校正，在2000～400cm-1区间允许相差±4cm-1以内，在4000～2000cm-1区间允许相差±8cm-1以内。

上述光谱中，仪器的分辨率要求在3110～2850cm-1范围内应能清晰地分辨出7个峰，2924cm-1与2851cm-1吸收带约分辨深度不小于18％透光率，1601cm-1与1583cm-1吸收带的分辨深度不小于8％透光率。

2．试样的制备方法和测定

按照中华人民共和国卫生部药典委员会编订的《药品红外光谱集》(2000年版)进行。如具有多晶现象的固体药品测定时，由于晶型可能不同，绘制的光谱图可能会发生改变，应再绘制。

由于各种型号的仪器性能不同，试样制备时研磨程度的差异或吸水程度不同等原因，均会影响光谱的形状。因此，进行光谱对比时，应考虑各种因素可能造成的影响。

(四)原子吸收分光光度法

由待测元素灯发出特征的谱线通过供试品蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，吸收遵循一般分光光度法的吸收定律。通过测定辐射光强度减弱的程度可求出供试品中待测元素含量。通常借比较标准品和供试品的吸收度，可求得样品中待测元素的含量。

原子吸收分光光度法所用仪器为原子吸收分光光度计，它由光源、原子化器、单色器和检测器等部件组成。光源通常用待测作为阴极的空心阴极灯，原子化器由雾化器及燃烧灯头组成。燃烧火焰由不同种类的气体混合物产生，常用空气-乙炔火焰。仪器某些工作条件如波长、狭缝、光源灯电流、火焰类型、火焰状态的变化可影响灵敏度、稳定程度和干扰情况。

用原子吸收分光光度计对中药材进行含量测定，有下列二法；

1．标准曲线法

在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的标准溶液至少3份，浓度依次递增，并分别加入供试品溶液配制中的相应试剂。一般均用去离子水制成水溶液。将仪器按规定启动后，先将去离子水喷入火焰，调读数为零，再将最浓的标准溶液喷入火馅，调节仪器至近满标度的读数；然后依次喷入每一标准溶液，读数。每喷完1份溶液后，均用去离子水喷入火焰充分冲洗灯头并调零。取每一浓度3次读数的平均值，与相应浓度作标准曲线。

供试品溶液的制备应使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内，将供试品溶液喷入火焰，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量。2．标准加入法

取同体积供试品溶液4份，分别加至4个同体积的量瓶中，除(1)号量瓶外，其他(2)、(3)、(4)号量瓶分别再准确加入比例量的待测元素标准液，均用去离子水稀释至刻度，形成标准液加入量从零开始递增的一系列溶液。按上述标准曲线法自"将仪器按规定启动后"操作，并依法将溶液喷入火焰，读数；将读数与相应的待测元素加入量作图，延长此直线至与含量轴的延长线相交，此交点与原点间的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的含量(如图6-1)。再据此计算供试品中待测元素的含量。

图6-1

标准加入法示意图

六、色谱法

色谱法又称层析法。根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。吸附色谱是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱使组分分离，常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数不同，使组分分离，其中一相被涂布或键合在固体载体上称为固定相，另一相为液体或气体，称为流动相，常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同，使组分分离；常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱又称凝胶色谱法，是利用被分离物质分子量大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂作流动相。

色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应，纯度要求较高。分析时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温操作。采用纸色谱、薄层色谱或柱色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分：分离无色物质时，可在短波(254nm)或长波(365nm)紫外灯下检视，其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检视；柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测；柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定。

(一)纸色谱法

纸色谱法，系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置(比移值＝原点中心至斑点中心的距离／原点中心至展开剂前沿的距离)，但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的颜色(或荧光)与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为药品的纯度检查时，可取一定量的供试品，经展开后，按药品的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定。

1．仪器与材料

(1)展开室：通常为圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖，应能密闭。用于下行法时，盖上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展开剂。在近顶端有一用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器，槽内有一玻棒，用以压住色谱滤纸，槽的两侧各支一玻棒，用以支持色谱滤纸使其自然下垂，避免展开剂沿滤纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。用于上行法时，在盖上的孔中加塞，塞中插入玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上；并除去溶剂槽和支架。

(2)点样器：常用具支架的微量注射器或定量毛细管，应能使点样位置正确、集中。

(3)滤纸：质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用，以致影响分离和鉴别效果，必要时可进行处理后再用。用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离(使色谱纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中，并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线，必要时，可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时，色谱滤纸长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱纸卷成筒形；点样基线距底边约2.5cm。

2．操作方法

(1)下行法：将供试品溶解于适当的溶剂中制成一定浓度的溶液。用微量吸管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然干燥、低温烘干或温热气流吹干，样点直径为2～4mm，点间距离约为1.5～2.0cm，样点通常应圆形。

将点样后的色谱滤纸上端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱纸通过槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开室内用适宜的溶剂蒸气使之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开室内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸，标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。

(2)上行法：点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，一般展开至约15cm后，取出晾干，进行检视。

展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可进行双向展开，即先向一个方向展开，取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90o，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开；亦可多次展开、连续展开或径向展开等。

(二)薄层色谱法

薄层色谱法，系将适宜的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料或铝片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图作对比．并可用薄层扫描仪进行扫描，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

1．仪器与材料

(1)玻板：一般多用10cm×10cm，1Ocm×15cm，20cm×10cm或20cm×20cm的规格，要求平滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

(2)吸附剂或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维系F254等。其颗粒大小一般要求直径为l0～40μm。薄层涂布，—般可分为无粘合剂和含粘合剂两种，前者系将吸附剂或载体直接涂布于玻璃板上，后者系在吸附剂或载体中加入一定量的粘合剂，一般常用10％～15％煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.2％～0.5％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃上。也有含一定改性剂如荧光剂或缓冲液等的薄层。

(3)涂布器：应能使吸附剂或载体在玻璃板上手工或自动涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

(4)点样器：一般采用微升毛细管或与之相应的点样器材。

(5)展开室：可用适合薄层板大小的专用玻璃缸，底部平坦或有双槽，盖子须密闭。

2．操作方法

(1)薄层板制备：一般将一份吸附剂和三份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.25～0.5mm)，取涂好薄层的玻板，于室温下，置水平台上晾干，在透射光和反射光下检视，表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，于110℃烘30分钟，冷却后即使用或置干燥箱中备用。也可用商品预制板。

(2)点样：用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样点直径一般不大于3mm，点样距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必需注意勿损伤薄层表面。

(3)展开：将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，切勿将样点浸入展开剂中，密封，待展开至规定距离，一般为8～15cm，取出薄层板，晾干，进行检测。

展开缸如需预先用展开剂预平衡，可在缸中加入适量的展开剂，必要时在壁上贴二条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，盖严，使展开缸平衡。

3．薄层扫描法

指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。

薄层扫描方法可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择反射方式，采用吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。测定方法有内标法及外标法，由于影响薄层扫描结果的因素很多，故薄层扫描定量测定应在保证供试品斑点的量在校正曲线的线性范围内的情况下，与对照品同板点样，展开，扫描，测量和计算。

用外标法测定时，若对照品各数据点在校正曲线上呈一通过原点的直线时，可用一点法校正，如不通过原点，通常宜采用二点法校正，必要时用多点法校正。含量测定时,供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层扳上，供试品点样不得少于4个，对照品每一浓度不得少于2个，薄层扫描定量用的对照品纯度应符合含量测定用对照品的要求。

4．影响薄层色谱分析的因素

薄层色谱法是目前中药鉴别应用最广的一种鉴别方法，但影响薄层色谱法分析效果的因素很多。

(1)样品的预处理及供试液的制备：一般认为薄层色谱所用固定相(薄层板)可即用即弃，不怕供试液中杂质的污染，因而样品无需净化精制，在实践中，由于中药的成分复杂，未知成分多，供试液中溶出的物质较多，其中既有欲测成分也有其他"杂质"，常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认，尤其成方制剂更是如此。为了得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试液得以净化，往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。制备样品供试液所用的溶剂一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太高，沸点适中，而对于中药材又常常希望将成分尽可能多的被提取出来，所以常被选用的是甲醇或乙醇，因此欲测成分和许多其他"杂质"均被提取出来，供试液的净化就显得更为必要。例如一捻金中人参二醇及人参三醇的鉴别，若是用稀酸水解后直接用氯仿萃取，点样层析，色谱因大黄成分的干扰，致使人参二醇及人参三醇的斑点很难辨认，经碱性氧化铝小柱吸附净化后，除去了大部分干扰，结果色谱清晰，人参二醇及人参三醇很容易辨认。

样品供试液净化的方法：①单一溶剂萃取法

如浙贝母、洋金花等含生物碱类成分的中药材可利用在碱性介质下用氯仿或苯将其所含的生物碱有选择地萃取出而舍弃其他成分。使供试液得以净化。②分段萃取法

如龙胆泻肝丸先用正己烷萃取，供鉴别当归用；继用丙酮萃取，供鉴别马兜铃酸(关木通)：最后用甲醇萃取再经氧化铝小柱甲醇洗脱，以鉴别龙胆苦苷，是利用了各自不同的溶解度，用不同极性的溶剂分段萃取，达到样品供试液净化的目的。③液液萃取法

小儿化毒散中牛黄的鉴别，先用稀碱液将胆酸类成分溶出用醋酸乙酯洗涤，再在酸性条件下，用醋酸乙酯萃取，以减少其他成分和杂质的干扰。④固液萃取法

如八珍丸，先用硅藻土研匀，在固态下用溶剂萃取，以去除蜜糖的干扰。或将样品的水提取液(固定相)加入硅藻土小柱中使之成为"固态"，再用适当的溶剂(移动相)通过硅藻土小柱萃取，萃取液再经浓缩等处理后作为供试液。用固液萃取或洗脱的方法制备样品是色谱分析常用的方法，目前常用的还有化学键合相小柱，如硅烷化硅胶小柱(C-8，C-18小柱)、氨基键合相小柱、腈基键合相小柱以及硅胶小柱、氧化铝小柱、聚酰胺小柱及大孔树脂小柱等。此外，益母草是用活性炭和中性氧化铝混合小柱，国公酒(辛弗林)用阳离子交换树脂柱。用氧化铝须注意颗粒不可太粗或太细(一般可用100～120目)，活性能保持在2～3级，用适当的玻璃小柱(如5ml及10ml注射针筒)装填。氧化铝吸附力较强，选用时应有针对性。

(2)薄层色谱的点样技术：点样是薄层色谱分析的第一步，也是非常关键的一步。它既关系到能否得到可以重现的有良好分离度的薄层色谱，也关系到定量测定结果的准确，因为不良的点样是最主要的误差来源。

薄层板的原点位置对样品量的负荷量是极为有限的，如点样量过大将明显降低分离效率。中药供试液中一般被测成分与"杂质"共存，尤其被测成分含量较低而其他干扰物质较为大量时，常常习惯于或不得不加大点样的量，另一方面也是由于对点样量超负荷的严重后果认识不足。预制板硅胶颗粒细(常规预制板11～12μm，高效预制板5～7μm)而均匀，明显提高了分离效率，对点样的要求更高了。如常规预制板展距l00mm，原点直径3mm，展开后如斑点直径扩散到6mm，则斑点容量或分离数SN＝10，而用高效预制板原点直径1mm，展开50mm，斑点直径如扩散为2mm，则SN＝15。但如果点样量不适当地加大，如在高效板上原点直径点成3mm，展开50mm后斑点扩散为4mm，结果SN＝6，即使延长展距至100mm，SN也仅仅达到11，不可能达到15。由此可见即使使用高质量的薄层板，如点样量不适当地加大，分辨率也同样不会得到提高。这就是为什么要求点样原点直径应尽量小于3mm的原因。

溶解样品的溶剂均有不同程度的洗脱力，所以在点样的同时，样品在原点位置就呈环形展开，原点直径的扩散促进了这种展开，即所谓"点样环形色谱效应"，如样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成空心圈，这种效应对随后的线性展开造成很不利的影响。所以原则上应选择对被测成分可以溶解，但溶解度不是很大的溶剂，中药成分复杂，难以兼顾，不可能面面俱到，通常在欲测成分不甚清楚或待测成分覆盖的极性范围很宽的情况下，宁愿选择溶解"范围"较宽的溶剂，如甲醇、乙醇等。有的品种欲测成分明确，如苦参、贝母中的生物碱、白术中的苍术酮等可有针对性地选择溶剂。有的品种选用了乙醚，由于乙醚沸点很低，最终的供试液则需要低温挥去乙醚后，改用其他合适的溶剂制成。

供试液的溶剂在原点的残留，也会改变展开的选择性，特别是供试液的溶剂极性与展开剂的溶剂极性相差较大时更为明显，再者，亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分(特别在高湿度环境)对色谱质量的影响也不可低估。因此点样时同步干燥或点样后继续干燥以除去原点残存的溶剂是需要的。但应尽可能避免高温加热，以免遇热不稳定的成分的破坏或促进硅胶有催化作用的活性表面起固态化学反应，导致样品中某些成分的变性。

点样装置(微量毛细管或色谱注射器)薄层表面的机械损伤对色谱质量尤其对定量分析影响很大。特别是已载有样品的硅胶表面颗粒被划伤或刮除，后果就更严重。一个壁厚0.02mm外径0.3mm的注射针头在薄层表面施加5g的机械力，表面局部承受的压力为30Pa，足以造成硅胶薄层表面的损伤，对板面较软的硅胶G薄层板损伤更严重。对如硅胶G这种软板虽然划伤表面难以避免(所以不太适合定量分析)，但点样时小心操作把损伤降低到最低限度还是可以做到的。近年来，点样器械和点样技术的不断更新和改进已使点样质量得到很大的提高。

提高点样操作水平是获得高质量色谱的关键之一，一个组成简单的样品的鉴别比较容易，一般只要在同一薄层板上供试样品与对照品在相同位置上显相同的斑点就基本上达到目的。但成分复杂的中药材样品的鉴别除检出特定的成分以外，常常需要以整个色谱与对照药材的色谱作比较，甚至要依靠薄层"指纹图谱"才能达到准确鉴别的目的。因此高质量的点样不仅是定量分析的需要、也是定性分析的要求。

(3)吸附剂的活性与相对湿度对薄层色谱的影响：吸附剂的活性是由表面能与表面积决定的。表面能越大，单位重量的表面积(比表面积)越大，吸附力越大，即活性越高，反之，吸附力越小，活性越低。如硅胶之所以有吸附力，是由于其表面含众多的硅醇基，硅醇基的活泼羟基及游离羟基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键。活泼型及游离型的硅醇基数目决定着硅胶的活性。硅醇基是亲水性基团，很容易吸附水而成为水合硅醇基而失去活性。自制的薄层板在105～110℃烘干，就是使水合硅醇基变为游离硅醇基而活化，反之，活化后的硅胶薄层板可以吸附大气中的水蒸气分子降低活性。也就是说硅胶表面吸附水分的作用是可逆的，在不同的相对湿度下，可以达到不同程度的吸附平衡，在相对湿度改变的情况下会重新达到新的吸附平衡，而不论在此以前硅胶板是处于何种相对湿度状态。在日常实践中，当活化后的硅胶(或氧化铝)薄层板从干燥器中取出，从准备点样到展开前，薄层板是暴露在实验室的大气中，薄层板的活性就取决于实验环境的相对湿度。其他条件相同的情况下，相对湿度对色谱质量的影响是很明显的。通常认为薄层色谱的重现性差，薄层板处在不同相对湿度下操作是主要的原因之一。如厚朴的薄层鉴别厚朴酚需在相对湿度85％以上展开，整个色谱的分离度才有明显改善。赤芍与白芍在低湿度＜30％下展开，二者不易区分；在高湿度(80％)下展开，色谱的分离度提高，从而显示出两者的差异部分。相反，万应锭中熊胆的鉴别，必须在低湿度下展开，方可达到较为满意的结果，在32％相对湿度下展开，熊胆中的各游离胆酸(包括处方中的牛胆汁和人工牛黄的游离胆酸)，如胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸，可以清楚地加以辨认，而在70％相对湿度下展开，色谱质量明显降低，难以辨别。如相对湿度在80％以上展开，则色谱面目全非。苍术正己烷提取物的薄层鉴别，相对湿度对分辨率影响也是很明显的。

有些样品的成分和所选用的展开剂对相对湿度有较宽的适应能力，即对相对湿度的要求不甚严格，大致在相对湿度30％～70％下得到相当稳定的色谱。有的样品在环境条件(温度和相对湿度)恰好适合的情况下，似乎不必控制条件也能把试验做好，但为了不同实验室之间及不同季节均可重现试验结果，应尽可能在相对湿度可控的条件下展开为宜。至少必须记录试验时实际的相对湿度。

相对湿度的控制方法，可在双槽展开箱的一侧槽中加入适当浓度的硫酸，将点样后的薄层板放入另一侧槽中，密闭放置15～30分钟，再加展开剂展开；另一种方法是在预先准备好的条件控制箱(状如平卧式展开箱，内盛适当浓度的硫酸，或用大小适宜的干燥器)内进行。控制相对湿度用的硫酸溶液如下表。相对湿度

所需硫酸浓度（V/V）

硫酸（ml）

+

水（ml）

32%42%58%65%72%88%68

10057

10039.5

10034

10027.5

10010.8

100

硫酸：D＝1.86(96%～97%)

(4)溶剂蒸气在薄层色谱中的作用：薄层色谱与柱色谱的区别之一就是溶剂的蒸气相在展开箱中也参与色谱展开而形成三维的层析过程，展开箱的气体空间在层析过程中起着重要的作用。

通常所谓的"展开箱饱和"应该严格区分以下几种情况；

展开箱饱和：是指展开前及展开中溶剂系统中所有组分在展开箱的整个气体空间达到平衡，即达到饱和状态；但在日常的实践中，需要在"饱和"状态下展开的较少，而只需用展开剂(或规定的溶剂)的蒸气在展开箱中预平衡一定时间，即所称的"预平衡"。

预吸附：通常是指薄层板的干燥板面(即未被溶剂湿润的部分)对展开箱空间气体分子的任何程度的吸附，即所谓的"预饱和"。

吸附饱和：是指薄层板的未被溶剂湿润的部分与展开箱的饱和气体空间达到平衡状态，即"完全饱和"，这是预吸附的极限状态。

毛细管饱和：是指薄层板所有的自由空隙借毛细管的作用被溶剂充满的过程，即相当于展开完成后的状态。

饱和的情况与展开箱的类型有关，常用的平底展开箱在展开前较难达到展开箱饱和，所以通常的做法是在内壁加贴与之等宽等高的用溶剂湿润的滤纸，有助于达到饱和。用双槽展开箱在其一侧槽中加溶剂可以较容易达到吸附饱和及展开箱饱和。如用夹心式展开箱，由于箱内空间很小，展开前因为空间没有溶剂分子，而且很难有空间扩散，所以实际上是非饱和的。在这种非饱和的夹心式展开箱中薄层板不产生预吸附现象。通常误认为夹心式展开箱空间小很容易饱和，其实只有在展开完成后才达到饱和，但这时对层析过程已不起作用。

在常规薄层色谱分析中，预吸附和吸附饱和对层析过程有很大的影响。吸附剂表面的空间是很有限的，当用多组分溶剂展开时，不同溶剂分子在吸附区相互竞争，发生"取代效应"，尤其在薄层板的下部，一个组分的等温吸附线会受到另外组分的性质和相对饱和程度的影响。如硅胶是亲水性吸附剂，它首先对溶剂组分中的极性分子有更大的亲合力，所以在吸附平衡的过程中，被吸附的各组分的浓度比与气体空间的很不相同，与溶剂的液相组成差别更大。可以想象在不加控制的情况下是很复杂的。简言之，薄层板在没有预吸附时，混合溶剂系统中的一部分溶剂分子有选择地被吸附在薄层板面上而形成固定相，同时在板上形成溶剂梯度从而直接影响层析过程，溶剂的蒸气相、液相和固定相一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。

(5)关于薄层色谱的优化及溶剂系统(展开剂)的选择：依靠色谱分离混合物质需要解决的主要问题有两个：①相邻物质对的分离。②在一个宽极性范围内的多混合物的分离。就薄层色谱而言，解决这两类不同的问题，所需要的优化技术是不同的。解决相邻物质对的分离，主要就两个相邻物质的理化性质，考虑选用正相薄层板还是反相薄层板，再考虑选用单一组成的展开剂还是混合溶剂作展开剂以及极性大小或酸碱性等，甚至考虑选用什么展开技术，如低Rf值的物质对可考虑用U-型展开箱，作径向展开等。对复杂混合物的分离，问题要复杂得多，一般即使采用了梯度展开技术，也不大可能将在一个相当宽的极性范围内的多组分既解决它们的最大限度分离问题，又解决各个组分最佳分离度的问题。就药典收载的品种，所采用的展开技术还是局限在常规的薄层展开技术，在其他条件没有太多的选择的前提下，溶剂系统，即展开剂的优选就成了主要需要解决的问题。

展开剂的选择和优化，主要考虑两个方面：溶剂的极性和溶剂的选择性。前者要求使欲分离的主要物质能在Rf值0.3～0.7的范围内，后者要求达到最佳的分离度。关于溶剂系统的优化，前人已做了大量的工作，有不少文献专著作了介绍，较为常用的如单纯型优选法、溶剂强度法、三角形法、均匀设计法及PRISM优选法等。由于中药成分很复杂，加上在常规展开箱中展开时，溶剂蒸气、相对湿度等因素的影响，各种优选方法似乎还难以将这些复杂的因素考虑在内，所以，展开剂在选择性的优选方面，几乎还是依靠实验经验，中药分析更是如此。当然在实践中参考文献介绍的展开溶剂的选择方法，以减少盲目性还是很必要的；可以期待更加科学更为实用的展开剂优选方法将被开发和研究。

在比较和选用展开剂时，应该多作比较，不同的展开剂，分离效果有时相差很悬殊，这方面的例子很多。同时在判断试验条件时，还不要忘记影响色谱质量的其他因素。

(6)温度对薄层色谱的影响：在相对温度恒定的条件下，一般在较高温度展开时，Rf值高；反之，Rf值降低。不过，展开温度如相差±5℃时，Rf值变动一般不会超过±0.02，所以对层析行为影响不大。但是展开时温度相差较大时，将不同程度地影响色谱的质量。如人参用氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的下层溶液，在较高室温(26℃)展开，得到的色谱与在较低室温(10℃)展开得到的色谱相比，分离效果和图谱面貌有很大差别。温度的影响首先在于展开剂中各有机溶剂因沸点、蒸气压、蒸发数量、相对密度等不同而蒸发程度各异，因而在展开箱的空间分布的展开剂组成中各有机溶剂的蒸气比例也发生变化，必然直接影响到欲分离物质的层析行为。其次，由于温度的变化，含水的两相展开剂在放置分层过程或展开时有机相中水的比例也不同，从而不同程度地改变了展开剂的极性，结果影响到色谱的分离度。三七总皂苷的薄层鉴别，当用氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的下层溶液作展开剂，在硅胶高效预制板(MERCK)上，于常温展开时，三七皂苷R1与人参皂苷Re不能分开，只有在低于10℃下展开，才能将二者分离。

(7)影响薄层色谱的其他因素：除上述主要影响因素外，操作技巧和熟练程度以及所用的器材溶剂试剂等的质量也是不可忽视的影响薄层色谱质量的因素。如选用了不合规格的预制板，所得的图谱是扭曲变形的色谱。同样，手铺的自制板如板面不均匀，也不可能得到质量好的色谱，譬如用不合格的手铺自制板所得到的人参皂苷的薄层色谱是一个难以辨认的图谱。

展开剂所用的溶剂质量不好，也直接影响薄层色谱的分离能力，如大黄的薄层色谱分析用的展开剂中的甲酸乙酯，遇水容易引起水解，如用多次开瓶的残存溶剂，因逐渐吸收大气中的水分而不同程度地分解，所得的色谱与用新鲜的溶剂所得的色谱有明显的差别，即用了陈旧的甲酸乙酯作展开剂组分，色谱中的原来可明显分离的五个蒽醌苷元分离降低，芦荟大黄素与大黄酸已不能分开。所以，在遇到意想不到的结果时，应多方面的检查原因。

(三)高效液相色谱法

高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

1．对仪器的一般要求

所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分依供试品的性质而定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。当用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法对溶剂的要求。如依照药典对药材及其制剂进行鉴别时，其固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，而如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。

2．色谱条件与系统运用性试验

对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。

(1)色谱柱的理论板数(n)：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh／2)，按n＝5.54(tRWh／2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件(如柱长，载体性能，色谱柱充填料的优劣等)，使理论板数达到要求。

(2)分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度，如图6-2分离度(R)的计算公式为：

R=2（tR2－tR1）/W1＋W2

式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；

tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；

W1及W2为相邻两峰的峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。

图6-2计算分离度示意图

(3)拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子(T)是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：

T＝W0．05h/2d1式中：W0．05h为0．05峰高处的峰宽；

d1为峰极大至峰前沿之间的距离。

除另有规定外，T应在0.95～1.05间。也可按各种校正因子测定项下，配制相当于80％、100％、120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，分别注样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0％。

3．测定法

定量测定时，可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测定杂质总量时，须采用峰面积法。

(1)面积归一化法：测定供试品(或经衍生化处理的供试品)中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定，除另有规定外，可为该品种主成分保留时间的倍数。

(2)主成分自身对照法：当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，采用主成分自身对照法。在测定前，先按各品种规定的杂质限度，将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液，进样，记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质限度。

(3)内标法测定供试品中杂质的总量限度：采用不加校正因子的峰面积法。取供试品，按各品种的性质选定合适的方法配制不含内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图Ⅰ；再配制含有内标物质的供试品溶液，在同样的条件下注样，记录色谱图Ⅱ。记录的时间应为该品种的内标峰保留时间的倍数，色谱图中内标峰高应为记录仪满标度的30％以上，否则应调整注样量或检测器灵敏度。

如果色谱图Ⅰ中没有与色谱图Ⅱ中内标峰保留时间相同的杂质蜂，则色谱图Ⅰ中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积(溶剂峰不计在内)。如果色谱图Ⅰ中有与色谱图Ⅱ中内标物质峰保留时间相同的杂质峰，应将色谱图Ⅱ上的内标物质峰面积减去色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为内标物质峰的校正面积；色谱图Ⅱ中各杂质峰总面积加色谱图Ⅰ中此杂质峰面积，即为各杂质峰的校正总面积，各杂质峰的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。

(4)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：校正因子(f)＝As/ms

Ar/mt

式中：As为内标物质的峰面积或峰高；

Ar为对照品的峰面积或峰高；

ms为加入内标物质的量；

mt为加入对照品的量。

再取各品种含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品(或其杂质)峰和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

Ax

含量（mx）＝f×

As/ms

式中：Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高；

mx为供试品(或其杂质)的量；

f、As和ms的意义同上。

当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。

(5)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量：按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量：

含量（mx）＝mr

×Ax/Ar式中各符号意义同上。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。(四)柱色谱法

1．吸附柱色谱

色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07～0.15mm的颗粒。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，应按各品种进行选择。

(1)吸附剂的填装：①干法

将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱管下端出口处联接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。②湿法

将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后加入洗脱剂将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。

俟填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即加供试品溶液。

(2)供试品的加入：除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿色谱管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发除尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶，可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

(3)洗脱：除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

2．分配柱色谱

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱管中并用带有平面的玻棒压紧；供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上端。

洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。

(五)气相色谱法

气相色谱法的流动相为气体，称为载气；色谱柱为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。注入进样口的供试品被加热气化，并被载气带入色谱柱，在柱内各成分被分离后，先后进入检测器，色谱信号用记录仪或数据处理器记录。

1．对仪器的一般要求

所用的仪器为气相色谱仪。除另有规定外，载气为氮气；色谱柱为填充柱或毛细管柱，填充柱的材质为不锈钢或玻璃，载体用直径为0.25～0.18mm、0.18～0.15mm或0.15～0.125mm经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球；常用玻璃或弹性石英毛细管柱的内径为0.20或0.32mm。进样口温度应高于柱温30～50℃，进样量一般不超过数微升；柱径越细进样量应越少。检测器为氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，并不得低于l00℃，以免水气凝结，通常为250～350℃。各品种规定的条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。

2．色谱条件与系统适用性试验

用高效液相色谱法项下规定。

3．测定法

同高效液相色谱法项下规定。气相色谱法手工进样量不易精确控制，特别应注意留针时间和室温的影响。

七、膨胀度测定法

膨胀度是药品膨胀性质的指标，系指按干燥品计算，每1g药品在水或其他规定的溶剂中，在一定的时间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。主要用于含粘液质、胶质和半纤维素类的天然药品。

测定法

根据供试品的特性或按药典规定的量取样，必要时按规定粉碎。准确称定(准确至0.01g)，置膨胀度测定管中(全长160mm，内径16mm，刻度部分长125mm，分度0.2ml)在20～50℃条件下，加水或规定的溶剂25ml，密塞，振摇，静置。除另有规定外，开始1小时内每10分钟振摇一次，然后静置4小时，读取药物膨胀后的体积毫升数，再静置1小时，如上读数，至连续两次读数的差异不超过0.1ml为止。每一样品同时测定3份，各取最后一次读取的数值按下式计算，求其平均数，即得供试品的膨胀度(准确至0.1)。

S=V/W

式中：S为膨胀度

V为药物膨胀后的体积毫升数

W为样品按干燥品计算的克数八、旋光度测定法

许多药材含有具光学活性的成分，如薄荷的挥发油，当直线偏振光通过含有某些光学活性的化合物液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转。此种旋转在一定的条件下，有一定的度数，称为旋光度。偏振光透过长1dm并每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。测定比旋度(或旋光度)可以区别或检查某些药品的纯杂程度，亦可用以测定含量。

中国药典系用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，除另有规定外，测定管长度为2dm(如使用其他管长，应进行换算)，温度为20℃。

测定旋光度时，用读数至0.01并经过检定的旋光计。将测定管用供试液体或溶液(取固体供试品，按各药品的要求方法制成)冲洗数次，缓缓注入供试液体或溶液适量(注意勿使发生气泡)，置于旋光仪内检测读数，即得供试液的旋光度。使偏振光向右旋转者(顺时针方向)为右旋，以"＋"符号表示；使偏振光向左旋转者(反时针方向)为左旋，以"－"符号表示。用同法读取旋光度3次，取3次的平均数，照下列公式计算，即得供试品的比旋度。

对液体样品

[α]Dt＝α/ld

对固体样品

[α]Dt＝100α/lc

式中：[α]为比旋度；

D为钠光谱的D线；

t为测定时的温度；l为测定管长度(dm)α为测定的旋光度；

d为液体的相对密度；

c为每100ml溶液中含有被测物质的重量g，(按干燥品或无水物计算)

旋光计的检定可用标准石英旋光管进行，读数误差应符合规定。测定时应注意：

1．每次测定前应以溶剂作空白校正，测定后，再校正1次，以确定在测定时零点有无变动；如第二次校正时发现零点有变动，则应重新测定旋光度。

2．配制溶液及测定时，均应调节温度至20±0.5℃(或各药品规定的温度)。

3．供试的液体或固体物质的溶液应不显浑浊或含有混悬的小粒。如有上述情形时，应预先滤过，并弃去初滤液。九、折光率测定法

光线自一种透明介质进入另一透明介质的时候，由于两种介质的密度不同，光的进行速度发生变化，即发生折射现象。一般折光率系指光线在空气中进行的速度与供试品中进行速度的比值。根据折射定律，折光率是光线入射角的正弦与折射角的正弦的比值，即

n=sini/sinr式中：n为折光率

sini为光线的入射角的正弦；

sinr为折射角的正弦。

物质的折光率因温度或光线波长的不同而改变，透光物质的温度升高，折光率变小，光线的波长越短，折光率就越大。折光率以nDt表示，D为钠光谱的D线，t为测定时的温度。

中国药典系用纳光谱的D线(589.3nm)测定供试品相对于空气的折光率(如用阿培氏折光计，可用白光光源)，除另有规定外，供试品温度为20℃。测定折光率可以区别不同的油类或检查某些药品的纯杂程度。

测定用的折光计需能读数至0.0001,测量范围1.3～1.7，如用阿培氏折光计或与其相当的仪器，测定时应调节温度至20±0.5℃(或各药品规定的温度)，测量后再重复读数两次，3次读数的平均值即为供试品的折光率。

测定前，折光计读数应用校正用棱镜或水进行校正，20℃时水的折光率为1.3330，25℃时为1.3325，40℃时为1.3305。十、pH测定法

许多药材含有多量的有机酸成分，如木瓜，药典则规定其pH应为3～4，除另有规定外，多测其水溶液，水溶液的pH应以玻璃电极为指示电极，用酸度计进行测定。酸度计应定期检定，使精密度和准确度符合要求。

(一)仪器校准(定位)

用的标准缓冲液，应使用标准缓冲物质配制，配制方法如下。

1．草酸三氢钾标准缓冲液：精密称取在54±3℃干燥4～5小时的草酸三氢钾[KH3(Cr2O4)·2H20]12.61g，加水使溶解并稀释至1000ml。

2．邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液：精密称取在115±5℃干燥2～3小时的邻苯二甲酸氢钾(KHC8H404)l0.12g，加水使溶解并稀释至1000ml。

3．磷酸盐标准缓冲液(pH6.8)：精密称取在115±5℃干燥2～3小时的无水磷酸氢二钠3.533g与磷酸二氢钾3.387g，加水使溶解并稀释至1000ml。4．磷酸盐标准缓冲液(pH7．4):精密称取在115±5℃干燥2～3小时的无水磷酸氢二钠4.303g与磷酸二氢钾1.179g，加水使溶解并稀释至1000ml。

5．硼砂标准缓冲液:精密称取硼砂(Na2B4O7·l0H2O)3.80g(注意:避免风化)，加水使溶解并稀释至1000ml，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免与空气中二氧化碳接触。标准缓冲液的pH如下表。温度℃草酸三氢钾标准缓冲液邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液磷酸盐标准缓冲液pH6.8磷酸盐标准缓冲液pH7.4硼砂标准缓冲液051015202530354045501.671.671.671.67??ㄍ????ㄍ????ㄍ???????????????????????日??????????????代????????????????????????????????????????????????????????金?????????????????日???二)注意事项1．测定前校准仪器时，应选择与供试液pH接近的标准缓冲液。2．在测定时用标准缓冲液校正仪器后，应再用另一种pH相差约3的标准缓冲液核对一次，误差不应超过±0.1。3．每次更换标准缓冲液或供试液前，应用水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试液洗涤。4．在测定高pH的供试品时，应注意碱误差的问题，必要时选用适用的玻璃电极测定。

5．对弱缓冲液(如水)的pH测定，先用邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液校正仪器后测定供试液，并重取供试液再测，直至pH的读数在l分钟内改变不超过±0.05为止；然后再用硼砂标准缓冲液校正仪器，再如上法测定；二次pH的读数相差应不超过0.1，取二次读数的平均值为其pH。

6．配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过的冷蒸馏水，其pH应为5.5～7.0。

7.标准缓冲液一般可保存2～3个月，但发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时，不能继续使用。

十一、酸值和皂化值的测定法

树脂类中药大部分为进口药材，其形态、色泽、变异较大，为控制其纯度，药典常规定其酸值或皂化值，如苏合香其酸值应为52～76，皂化值应为160～190。

(一)酸值的测定

酸值系指中和脂肪、脂肪油或其他类似物质1g中含有的游离脂肪酸所需氢氧化钾的重量(mg)，但在测定时可采用氢氧化钠液(0.1mol/L)进行滴定。

除另有规定外，按表中规定的重量，精密称取供试品，置250ml锥形瓶中，加乙醇-乙醚(1:1)混合液[临用前加酚酞指示液1.0ml，用氢氧化钠液(0.1mol/L)调至微红色]50ml，振摇使完全溶解(如不易溶解，可缓慢加热回流使溶解)，用氢氧化钠液(0.1mol/L)滴定，至粉红色持续30秒钟不褪。以消耗氢氧化钠液(0.1mol/L)的容积(ml)为A,供试品的重量(g)为G，照下式计算酸值:

供试品的酸值=A×5.61/G

滴定酸值在10以下的油脂时，可用10ml的半微量滴定管。参见下表。酸

值称

重(g)0.5110