质粒大规模生产解决方案

质粒大规模生产解决方案目录质粒简介---------------------------------------------------------------------质粒生产工艺整体解决方案-----------------------------------------------产品介绍---------------------------------------------------------------------01大肠杆菌发酵------------------------------------------------------02菌体裂解------------------------------------------------------------03质粒纯化------------------------------------------------------------12446804放行检测------------------------------------------------------------1005质粒储存------------------------------------------------------------12明星产品应用案例----------------------------------------------------------14BactoCDFPM培养基----------------------------------------14增强型一次性发酵罐可以改善微生物培养过程中的冷却和氧传质效果------------------------------------------------------------16利用阴离子交换层析优化质粒DNA的大规模纯化工艺---------------19E.coli残留DNA定量系统----------------------------------21质粒DNA-卡那霉素抗性基因定量试剂盒----------------22KingFisherFlex磁珠法样品制备系统-----------------------------------24订购信息---------------------------------------------------------------------26质粒简介质粒是宿主染色体(或拟核)以外的闭合环状双链DNA分子，它们天然存在于E.Coli等细菌中，并为宿主提供竞争优势，包括抗生素抗性以及在极端环境中生存的能力，已成为重组DNA技术的基本工具。在治疗水平上，pDNA常被用作病毒载体基因治疗、mRNA疫苗的关键起始材料。同时，pDNA也被用于DNA疫苗和基因治疗，以对抗各种感染性、后天性和遗传性疾病。无论是作为关键起始原料，还是作治疗性药物本身，质粒DNA的生产都至关重要。根据质粒使用的类型(在药物开发中是否用作起始/关键原料、中间体、原料药或药物产品)，有不同的机构推动不同的指南进行指导，以规范质粒的生产，克服相应的挑战。鉴于临床开发后续阶段的监管日益严格，重要的是通过原材料的控制、工艺的开发、产品的质量和检测角度评估不同需求，以满足质粒的高质量生产需求。1质粒生产工艺整体解决方案ThermoScientific™HyPerforma™Gibco™细胞培养注射用水(WFI)Gibco™NaOH溶液一次性搅拌罐S.U.M.2菌体裂解1大肠杆菌发酵培养Gibco™Bacto™CDSupremeFermentationProductionMediumGibco™Difco™SoytoneGibco™Bacto™ExtractThermoScientific™HyPerforma™玻璃反应器ThermoScientific™HyPerforma™一次性发酵罐增强型一次性发酵罐2ThermoScientific™DynaChrom™POROS™50DThermoScientifc™Nalgene™Theress一次性层析系统弱阴离子交换填料Biotainer™生物储存瓶Containers一次性生物工艺容器5质粒储存POROS™50HQPOROS™HIC强阴离子交换填料疏水层析填料3质粒纯化4放行检测resDNASEQTME.coli残留DNA定量系统resDNASEQTM质粒DNA-卡那霉素抗性基因定量试剂盒PrepSEQ™残留DNA样品制备试剂盒PharmaKingFisherFlex96自动核酸提取仪(磁珠法)301大肠杆菌发酵大肠杆菌的发酵具有密度高、需氧大、产热多的特点，提高大肠杆菌的生长密度可扩大质粒的产量。对于关键参数如溶氧的优化及精准调控，可以提高质粒产量1到50倍。此外，对于一些大肠杆菌发酵培养基、补料的选择，也会极大程度上影响到质粒的产量与质量。且随着对质粒生产的监管力度越来越大，动物源性材料的使用要求被减少，一次性产品的使用也越来越在新型领域被广泛接受。挑战及痛点：提高质粒产量及质量•诱导性扩增(氨基酸剥夺和限制、温度诱导)•提高大肠杆菌发酵密度(培养基、补料、培养方式、溶氧、发酵罐的选择和优化)相关指导法规原则(试行)》如果使用人源或动物源物质，应符合《中华人民共和国药典》相关规定和/或参照ICHQ5A等技术指南提供外源因子风险评估。《药品共线生产质量管理指南》基因治疗和细胞治疗产品由于涉及的活体材料的可变性及可能含有传染性疾病的病原体，如质粒、病毒、病原体类产品的危害性较高，建议专用生产线或使用一次性生产系统进行生产。《欧洲药典》(EP8.0,2014)第5.2.8章医用产品的生产应优先考虑使用“非TSE相关动物物种材料”或“无动物源材料”，使安全风险最低化。《美国药典》为减少TSE传播的潜在风险，建议使用无动物源生产原料代替动物源原料。4ThermoScientificHyPerformaGibcoBactoCD玻璃反应器FermentationProductionMedium•Thermo控制器的开放性架构(≤50L)。强大的可配置性保证平稳和高精度的控制过程•不含水解物和动物源成分，保证质量和一致性•消除BSE/TSE相关风险，降低噬菌体污染的可能性•灵活的包装，轻松放大至大规模体积发酵，优化发酵工作流•基于EmersonDeltaV平台开发的软件可建立复杂的控制•相比传统TB培养基质粒产量提高30%~40%，且提高批次间稳策略，满足从研发到商业化生产的数据完整性定性•基于计算机流体动力学(CFD)开发的桨叶形制(Marine/Rushton)kLa和最小的剪切力，支持从细菌到哺乳动物的全面培养•(coolfinger)，增加冷水循环面积，降温效果是其他品牌同类产品的两倍GibcoBactoExtract•不含动物源成分，完全植物来源的水解物•消除BSE/TSE相关风险•相比传统动物源和大肠杆菌发酵培养基可以更好地提高大肠杆菌的生长ThermoScientificHyPerforma一次性发酵罐增强型一次性发酵罐Hyperforma一次性发酵罐(S.U.F.)采用传统的不锈钢发酵罐设计原理，通过高效的传质、混合和温度控制，专为微生物发酵而设计。5:1的调节比可轻松实现从小体积至大规模的放大。增强型eS.U.F.更是通过升级改良，增加35%的冷却夹套面积，进一步优化高密度发酵过程。•GibcoDifcoSoytone便于工艺优化，保证培养参数的稳定性•一次性发酵罐无需SIP/CIP，节约生产周期•强大的混合能力，优异的氧传质能力，高效的控温能力•定制化一次性生物反应袋可精确匹配工艺需求•应用实例中最高OD600可达240•不含动物源成分，完全植物来源的水解物•消除BSE/TSE相关风险•相比传统动物源和大肠杆菌发酵培养基可以更好地提高质粒的产量502菌体裂解对高密度、大规模培养，需要考虑连续流离心或微过滤方式浓缩收集菌体。收获后的菌体检定合格后，常采用碱裂解法进行菌体裂解，而大规模碱裂解法会形成粘稠的液体，会对溶液的混匀造成挑战；混合时间不能够过长，否则碱性环境会降解DNA，将基因组DNA分解成小片段，从而影响质粒的质量；搅拌速度不宜过大，过大的速度会产生很大的剪切力，同样会将DNA打断，所以对搅拌速度也有限制。如何有效且快速的混匀液体，是碱裂解法的一个挑战。挑战及痛点•裂解罐集中供碱，造成局部过碱，裂解不充分•采用搅拌的方式进行混匀，因其传质是非线性相关，放大生产时，设备的选型非常困难•质粒DNA对剪切力敏感，产业化生产中如何保障质粒DNA构象6Gibco细胞培养注射用水(WFI)ThermoScientificHyPerforma一次性搅拌罐S.U.M.•Gibco无菌注射用水符合多国药典要求(USP/EP)•顶置斜桨机械搅拌提供稳定的功率输入和平均的径向辐向液体流动，高效混合粘性液体，增加裂解效率•Gibco无菌注射用水在美国GI和英国Inchinnan两个cGMP工厂生产，生产环境均通过ISO13485认证•可在低速搅拌下提供良好的混匀效果，同时降低剪切力，防止大肠杆菌的基因组DNA被打断•根据客户需求和包装规格不同，我们可以提供瓶子和一次性无菌袋(CX5-14)的包装形式，并跟根据要求，提供定制化规格产品•封闭轴承设计可减少搅拌过程中产生的颗粒物，符合USP<788>要求•除满足药典要求外，Gibco高品质注射用水每批次还会额外检测内毒素、生物负载、电导率、pH、渗透压，硝酸盐、总有机碳等额外指标•苏州生产的SUM价格相较进口版本下降20%，标准货号耗材货期短，有安全库存•该产品可用于生物工艺的多个环节，如细胞培养、缓冲液配制，环境清洁消毒等GibcoNaOH溶液•0.1M、0.5M和1M浓度•多药典级原料•按照21CFR820进行cGMP生产•20L和200L即用型单次使用生物工艺容器•产品可应用于pH值调节、设施/设备消毒以及色谱柱清洁、消毒和储存703质粒纯化菌体裂解后除了目标产物质粒外，还有菌体碎片、蛋白、宿主基因组、质粒异构体和内毒素等杂质。在质粒纯化生产过程中，需要考虑到这样几点重要因素。第一，质粒一般比蛋白质大得多；第二，质粒带电非常高；第三，pDNA有很多种形式。但是目前质粒纯化依然存在一些挑战，比如：1)产物和杂质电荷和大小相似(gDNA、内毒素、RNA、质粒异构体)；2)剪切敏感性和高粘度限制操作流速；3)传统层析填料对pDNA的结合载量较低。因此在保证产率/回收率和纯度的情况下，选择省时间、省成本、工艺环节简单的纯化工艺十分关键。挑战及痛点•传统质粒三步纯化法纯化成本高，生产效率低•大多数软胶介质，不能在高流速下运行，降低纯化效率8DynaChrom系统为层析供了完整的一次性解决方案。预设的系统选项和模块化流路组件设计可以满足用户不同的工艺需求。可用于多个层析步骤，并可与自动化功能包相结合，提供高一致性、高性能的纯化工艺平台。POROS™灌注层析填料是目前工业级生物分离领域中性能最好的层析介质，其硬质、高效的颗粒将层析通量提高为传统凝胶介质的2~3倍，并可以获得高分辨率的分离效果，同时POROS™灌注层析产品易于清洗和装柱，越来越多的客户将POROS™填料用于其FDA认证的生物治疗产品的生产中。POROS™填料在质粒纯化工艺中具有以下特点：•ThermoScientific™自动化软件基于Emerson™DeltaV™为技术转移、数据整合和数据存储带来了便利。可灵活配置的用户权限管理、审计追踪和批次报告均属于标配功能•可放大性强，可以在高流速下运行，表现稳定•良好的物理和化学特性，能够耐受高盐高碱•大孔硬胶介质，提高传质流速和结合载量•填料粒径小，提高分辨率和杂质分离能力•易于放大，同一设备支持1-1980L/hr流量范围，可满足从临床到生产所需的不同纯化工艺规模•硬件可支持四种规格的一次性管路组件，安装简便，软件可•已有许多客户将POROS™填料用于其FDA认证的生物治疗产一键切换管路尺寸品的生产中•904放行检测质粒作为CGT及mRNA产品中承前启后的关键产品或原料，也有着非常严格全面的质控要求，比如鉴别、含量、纯度(包括DNA形式及宿主残留DNA等杂质)及内毒素等。其中E.coli作为质粒生产的宿主菌，其残留宿主DNA作为工艺杂质需要被准确定量检测，并且残留量需限定在法规要求的范围内；另外，质粒不管作为CGT或mRNA工艺过程中的原料产品，还是作为病毒载体及mRNA终产品里的杂质，其含量同样需要准确测定。相关指导法规《中国药典》2020版三部《人用疫苗总论》对宿主残留DNA检测的要求关键质量属性相关的工艺杂质(如细胞基质残留DNA)如因产品特性无法在成品中检测时，应在适当的中间产物取样检测，检测结果应能准确反映每一成品剂量中的残留水平。《中国药典》版三部《人用基因治疗制品总论》例如来自包装细胞系或细菌的宿主细胞DNA。生产过程中如使用致瘤细胞系，残留DNA水平应严格控制并保持在最低水平。如已经证明可以有效控制或去除，并达到可接受水平，相关检定项目可不列入成品的常规放行检定中。残留DNAPharmaKingFisherFlex96样品制备试剂盒自动核酸提取仪(磁珠法)•磁珠法提取试剂，支持手工或自动化提取•高效回收残留DNA•稳定耐用，磁珠法核酸提取经典平台•高通量，单次完成1-96样本提取•适用于多种复杂基质样本•开放平台，支持常见磁珠法试剂盒E.coli残留DNA定量系统resDNASEQ质粒DNA-卡那霉素抗性基因定量试剂盒•采用实时荧光定量PCR技术进行高灵敏度定量检测•PCR抑制•适用于不同工艺阶段样品•1105质粒储存纯化后的质粒保存在TE缓冲液中，一般质粒可以在4°C短时间保存，经常使用的质粒可以保存在-20°C冰箱中能保存半年，长期保存建议放在-80°C冰箱。因此储存容器不仅需要降低残留污染的风险，节省清洁、灭菌及相关校验操作的成本，同时也需要适应不同的温度条件。ThermoScientifcNalgeneBiotainerThermoScientifcBioProcessContainers生物储存瓶一次性生物工艺容器•专为药物活性成分样品的储存和运输设计ThermoScientific™CX5-14/Aegis™5-14薄膜，专为生物制药行业的液体处理、储存和运输而研发。容量50ml-3,000L。•不同材质可选，适用于不同温度条件储存•厚度高达14mil，五层共挤压结构减少分层的可能•防穿刺，耐碰击的瓶盖和瓶体保护存储物安全，且有效防止存储物发生漏液危险•良好的韧性和抗穿刺性，高气液阻隔性能；支持至的操作温度，最大限度地保证内容物稳定和安全•提供完善的验证文件支撑，节省您的验证时间和成本•••相容性和溶析出数据，符合欧洲药典<EP>和美国药典<USP>标准•苏州生产，支持定制。货期短，标准货号有安全库存13明星产品应用案例BactoCDFPM培养基单组分的干粉培养基用于高效的质粒和重组蛋白生产或微生物发酵应用Gibco™Bacto™CDFermentationProductionMedium(简称FPM)是第一个化学限定的发酵培养基，支持强大的质粒和重组蛋白生产。它是一种不含水解物和动物源成分且易于使用的培养基，可用于替代水解物和动物源培养基，可节省时间和精力，能帮助您加快进入市场的速度。质量和一致性Bacto的营养成分。该配方利用了ThermoFisher在蛋白胨、发酵和创新的化学限定培养基方面超高的专业知识和经验。BactoCDSupremeFPM拥有可靠的，基于大肠杆菌E.coli)营养需求的限定成分。风险的降低我们的化学限定的配方没有动物源成分，这消除了BSE/TSE相关的风险，并且监管的要求也会相应宽松。培养基中没有复杂的水解物，这也降低了噬菌体污染的可能性。在表现上达到更高的水平BactoCDSupremeFPM作为一种单组分的干粉培养基可以节省物料的时间。通过消除大量的原材料管理，称重，或混合多种成分，您将实现效率的提高和各种繁琐步骤的减少。一种灵活的，即用的解决方案•标准的包装规格(500g和10kg)•有效期18个月，储存在2-8°C的冰箱中•可同时支持高压灭菌或者除菌过滤•为标准发酵设备而设计•可轻松放大至大规模体积的发酵CDFPM培养基与TB培养基一致性对比根据(图1)。培养24小时，BactoCDSupremeFPM的OD600始终保持在20以上，而仅有一批TB的OD600达到了20以上，其余批次的OD600测量值低于15。6小时24小时28小时质粒产量BactoCDSupremeFPMTB图1.摇瓶中多个批次BactoCDFPM的细胞生长和质粒产量一致。使用制备的BactoCDFPM(经过滤)和TB(经高压蒸汽灭菌)各三个批次在摇瓶中培养DH5α大肠杆菌coli)细胞。分别在培养6、24和28小时后测量生长情况。在培养24小时后测量质粒产量。一般情况下，BactoCDFPM的细胞生长和质粒产量平均比TB高出1.4倍。工艺放大到使用工作容积为2L(批处理)的3L台式搅拌釜式生物反应器表明与BactoCDSupremeFPM的生长性能一致，且与选定的灭菌方法无关(图2A)。此外，结果表明，与TB相比，该培养基的细胞生长速度更快(图2A)，质粒产量平均增加1.4倍(图2B)。AB0BactoCDSupremeBactoCDSupremeBactoCDSupremeFPM(经过滤)BactoCDSupremeFPM(经高压蒸汽灭菌)TBFPM(经过滤)FPM(经高压蒸汽灭菌)图2.与TB相比，BactoCDFPM改善了细胞的生长和质粒产量。(A)在30小时内测量DH5α大肠杆菌coli)的生长情况(OD600)。在培养24小时后的测量结果表明，经过过滤或高压灭菌后，BactoCDSupremeFPM的生长量分别比TB的生长量增加了2.40-2.60倍。(B)在培养24小时计算DH5α大肠杆菌coli)质粒产量，并将其与TB进行归一化分析。BactoCDFPM至少比TB增加了1.3倍。15增强型一次性发酵罐可以改善微生物培养过程中的冷却和氧传质效果开发成果HyPerformaeS.U.F.在罐体底部和垂直检修门上安装了传热夹套，将设备的冷却面积增加了25%，与此同时，侧壁的夹套面积也增加了10%。因此，与原始HyPerformaS.U.F.相比，HyPerformaeS.U.F.的冷却表面积共增加35%。使用设定点范围为-5°C至55°C的24kWThermoScientific™NESLAB™温度控制装置(TCU)(460VAC，60Hz，3相，50A；货号：SV50239.08)以及300LHyPerformaeS.U.F.进行实际测试，结果表明，增加的35%夹套面积使设备的全体积加热(从10°C到42°C)时间缩短16.5分钟，较原始HyPerforma改进了23%。同样，使用300LHyPerforma时，从42°C到10°C的冷却时间缩短20分钟，改进了25%。最终我们选定了五种叶轮形制在液体中进一步测试功耗和kLa性能。我们将两个选中的最优叶轮与Rushton叶轮一起用于极端情况下的大肠杆菌培养。在处于室温的未通气的水中进行混合时，第一种叶轮(虽然直径和叶片高度都大于Rushton叶轮)用电量与Rushton叶轮相等。第二种较大的增强型叶轮所用的电量比Rushton叶轮多50%左右。最后，我们选择使用第二个叶轮进行生产，因为(图2)。由于HyPerformaeS.U.F.s的叶轮比HyPerformaS.U.F.s中原来的Rushton叶轮更大，我们同时对变频器(variablefrequencydrive,VFD)进行了调整，以确保在生产过程中输出的功率不超过电机额定功率。在开发HyPerformaeS.U.F时，我们对各种叶轮进行了研究。与HyPerforma中的原始Rushton叶轮相比，通过计算流体力学(computationalfluiddynamics,CFD)分析对每种叶轮进行了15次迭代测试以检测其理论性能。图1.传统300LHyPerformaS.U.F(左)和300LHyPerformaeS.U.F图2.HyPerformaeS.U.F.中的增强型叶轮提供优于HyPerforma(右图)。中原始Rushton叶轮的性能。培养结果为进行平行对照，除叶轮变化之外，其他实验条件均保持完全一致。增强型叶轮性能的改善是通过减少整个培养过程中补充的氧气量来证明的。当培养液中的碳源耗尽时开始补料，当系统检测到溶解氧(DO)突增时则开始自动补料。图3是配备增强型叶轮的30L和300LHyPerforma与配备Rushton叶轮的30LHyPerforma的比较数据。图中300LHyPerformaeS.U.F的数据向右移动了大约一个小时，以便与30LHyPerformaS.U.F产生的细胞密度相匹配。在HyPerformaS.U.F.即将运行结束时补氧观察到噪声的增加，是由于增加了消泡剂的添加量。而在使用增强型叶轮的eS.U.F.中，消泡剂用量较少。此外，在使用300LHyPerformaS.U.F.培养的最后1.25小时内，由于使用原始夹套及TCU(功率9kW，介质乙二醇)，温度增至设定点37°C以上。采用较大型号的TCU或TCU中的泵可减少或防止这种噪声。然而，这种噪声也证明在要求更高的培养工艺中，HyPerformaeS.U.F.增加35%夹套表面积是必要的。当夹套面积增加时，即使OD达到210(比原始300LHyPerformaS.U.F.温度开始升至设定点以上时高70)，温度也不会高于37°C设定值的0.2°C。由图中的数据可以看出，在HyPerformaeS.U.F.运行过程中需氧量降低。并且在30L和300LHyPerforma之间观察到类似的氧气消耗量(vvm)(图3)。与配备配备Rushton叶轮的原始HyPerforma相比，配备增强型叶轮的HyPerforma氧气消耗量下降至原来的1/7。*22L2L)LLL2L2L2L)图3.配备Rushton叶轮的原始30LHyPerforma与配备增强型叶轮的30L和300LHyPerforma运行过程中，OD600与O2通气水平的工艺参数比较。图4.30L和300L增强型叶轮与30L原始Rushton叶轮之间补氧(O2)量比较的数据。带有Rushton叶轮的DO设置为10%，的DO控制更精确，可设置为5%。同时，HyPerforma的增强型叶轮使氧气补充减少93%。17客户验证结果结论为了针对HyPerformaeS.U.F.的改造进行早期评价，我们邀请了两位客户进行了外部验证。由于这些客户均为现有设备的用户，范围仅限于HyPerformaeS.U.F.叶轮的改进测试。HyPerformaeS.U.F.的设计显著提高了冷却能力，并降低了氧气需求量。为了实现这些改进，300LHyPerforma中的夹套表面积增加了35%，并引进了体积更大、效率更高的增强型抛物面叶轮。对增强夹套的测试证实，加热和冷却的温度变化分别缩短了23%和25%。在使用相同电机的情况下，HyPerformaeS.U.F.的抛物面叶轮将进入的气体更有效地分布在整个培养过程中，与Rushton叶轮设计相比，它至少减少了80%的氧气补充。HyPerforma可进一步将对培养条件要求较高的细菌和酵母培养至较高密度，并提供与不锈钢容器类似的性能。第一次的外部验证在SynlogicInc.(总部位于美国马萨诸塞州剑桥市，官网：)进行。Synlogic是一家将合成生物学的变革潜力带入医学临床阶段的生物技术公司。他们将HyPerforma用作能够进行GMP生产的工艺开发和放大工具。Synlogic的某些发酵工艺需要对部分培养物进行有效的5%DO控制，HyPerforma可以精确地做到这一点，提供微生物生长的所需的必要微好氧环境。Synlogic发现，30LHyPerforma将最大氧气流量减至总发酵流量的仅7%(图4)。这使在30LHyPerforma中运行工艺所需的补氧量降低93%。此外，为了评价放大情况，客户还对300LHyPerformaL也产出了相似的结果，最大补氧量约为20SLPM，而30L型号则为2SLPM。客户同时观察到补氧流量降低，这为其未来的工艺开发提供了信心。鉴于这些成功的结果，客户目前正在其GMP生产工艺中使用30L和300LHyPerforma。第二个客户是亚洲的一个CDMO，他们面临着与其他改装类似的挑战。客户之前遇到了其工艺消耗大量氧气的问题，然而，他们的设备仅能提供40SLPM或以内的氧气；更换多个高压气瓶的需求非常昂贵，需要较大的人力成本。同时，他们也希望消除一个长期存在的物流挑战。客户现有设施中气体管道的容量有限，因此升级成本极高且耗时。经证明，HyPerformaeS.U.F.是一种可行且风险较低的解决方案。原因是，需氧量显著降低，避免了昂贵的设施升级或成本负担，以及使用大量高压氧气瓶的安全问题。该客户证明，当他们从配备Rushton叶轮的30L型号转至配备增强型叶轮的30L型号时，补氧量降为原先的七分之一。测试表明，配备Rushton叶轮的原始HyPerforma需要40SLPM的氧气供应，同时会使用多个氧气瓶。相比之下，HyPerformaeS.U.F.配置仅需要使用最大流量为6SLPM的氧气，不到一个气瓶即可完成运行。该客户对HyPerformaeS.U.F.可与不锈钢发酵罐相媲美的性能非常满意，并计划在工艺开发和GMP生产中继续使用30LHyPerforma，并放大至300L。利用阴离子交换层析优化质粒DNA的大规模纯化工艺质粒DNA在新型疗法中的应用广泛，因此其生产也受到了较大的关注。利用阴离子交换层析的纯化方法可以实现灵活、可放大的质粒DNA的纯化工艺。ThermoFisherScientific开发了多种阴离子交换填料，非常适合质粒纯化，可以在简化工作流程的同时提高产量和纯度。填料使用独特的POROS™基架，克服传统层析填料对pDNA的低结合能力的问题。POROS填料特点表明，在pH7.0,POROSD50表现出最高的回收率(如图一)。在pH6.0,上样浓度对POROSD50填料的回收率有很强的影响。POROS™填料可以在高线性流速下运行，与其他填料相比，大孔结构降低了传质阻力，并且小粒径提高了去除杂质的效果。POROS具有一系列不同的阴离子层析填料(AEX)，每一种都具有不同的表面结构和选择性。三种AEX填料在pH7.0和60mS/cm的上样电导率下均表现出最佳回收率(如表一)。实验使用1mL层析柱测试AEX45mS/cm下观察到POROSD50具有最高的结合载量15.6mg/ml，所以POROS™D50因具备大孔径和内孔表面积的优势，成为质粒DNA结合的最佳选择。AEX捕获质粒DNADoE试验实验使用200μLRoboColumn™高通量筛选柱对POROS™D50、HQ和XQ填料进行了实验设计(DoE)，研究因素包括上样pH值、上样浓度、上样电导率。DoE结果图1.POROSD50，HQ50，XQ50回收率。表1.POROS™阴离子填料特点Loadconductivity(mS/mLSampleloadingdensity(mS/mLDynamicbindingcapacity(mS/mLMaximumrecoveryMaximumpurityResinpHPOROSD50POROSHQ50POROSXQ777606060551100.0100.0100.075.059.99.019POROSD50放大性验证POROSD50的结合载量在5.0mL层析柱上进行放大实验。在pH7.0、上样浓度为10mg/mL的条件下，RNA在电导率55mS/cm时流穿，pDNA在电导率150mS/cm时洗脱，证实D50填料>10mg/mL的结合能力，通过在洗脱缓冲液中添加2mM，可以实现92%以上的回收率。图2.POROSD50放大性试验。E.coli残留DNA定量系统•采用经验证的AppliedBiosystems™实时PCR技术进行高灵敏度定量(图1)•手动或自动样本制备，从复杂样本基质中高效回收残留DNA(表1)•对不同片段大小的DNA具有一致检测结果(图2)•从样本到结果的完整解决方案，包括样本制备试剂盒、预混液、引物/探针混合物和基因组DNA标准品AppliedBiosystems™resDNASEQ™E.coli残留DNA定量系统基于定量PCR(qPCR)原理，用于检测来自常用于生产重组蛋白的E.coli表达系统的宿主细胞DNA。该系统可靠且快速，通常在4小时内即可对大肠杆菌DNA进行灵敏性(定量限=15pgDNA/ml供试样本，图1)和特异性(图3)定量。该性能有助于以高可信度从包括过程中样本至原液的多种样本类型中获得定量数据，无论样本是含有完整或碎片化基因组DNA(图2)。表1.基因组DNA平均回收率平均CVE.coli83%5.04%R2=0.999效率=102.153310ng人类DNA100ng人类DNA不含人类DNA超声波处理高分子量3。黄色)、10ng人类DNA(红色)和不含人类DNA(蓝色)的大肠杆菌基因组21质粒DNA-卡那霉素抗性基因定量试剂盒用于定量残留质粒DNA的qPCR系统•多重检测生物工艺中的所有卡那霉素抗性(KanR)基因常见等位基因•通过创新的DNA-free预混液实现高特异性定量•采用经验证的AppliedBiosystems™实时PCR技术进行高灵敏度定量•通过手动和自动样本制备提供重现性结果，经优化以从常见基因治疗样本基质中定量回收DNA•易于使用，5小时内即可获得结果•从样本到结果的完整解决方案，包括样本制备试剂盒、预混液、AppliedBiosystems™引物/探针混合物以及质粒DNA标准品基因组DNA准确度平均回收率>0.99R2AppliedBiosystems™resDNASEQ™质粒DNA-卡那霉素抗性基因(pDNA-KanR)定量试剂盒基于qPCR系统，以检测含有卡那霉素抗性基因的残留质粒DNA。qPCR法是一种成熟的残留DNA检测方法，通常用于评估基因治疗、疫苗和生物类似药开发过程中的产品质量和安全性。resDNASEQ系统能够通过靶向常用质粒上存在的多个KanR等位基因对含有卡那霉素抗性基因(KanR)的质粒DNA进行快速、高灵敏度和高特异性定量。该性能有助于以高可信度从具有不同样本基质的过程样本至原液的多种样本类型中获得定量数据(图1)。PCR效率精度100%±10%CV≤10%检测限(LOD)定量限(LOQ)检测范围15拷贝30拷贝30-300,000拷贝细胞培养收获纯化后(洗脱样本)最终制剂TaqMan检测技术提供的宽线性范围允许检测不同浓度的含有KanR基因的质粒DNA样本(图2-3)。ABCDEFGABCDE1)2)3)4)5)F6)GKanR斜率：-3.201R：0.997效率：105.3resDNASEQ质粒DNA定量试剂盒工作流程样本制备PCR体系构建定量检测结果分析带有PrepSEQ试剂盒的PharmaresDNASEQ质粒DNA-卡那霉素QuantStudio™5AccuSEQ软件KingFisherFlex系统抗性基因定量试剂盒实时PCR系统23KingFisherFlex磁珠法样品制备系统磁珠法核酸自动提取引导者可从复杂样品中高效稳定地提取核酸，全面支持SEQ分析系统磁珠比传统的样品提取介质具有更大表面积，可悬浮于液体捕获小分子样品的效率更高，易于实现自动化过程因此得到广泛应用。KingFisher磁珠处理技术(专利号通过特制磁棒吸附、转移和释放磁珠，全过程无需离心或抽真空，无需使用吸头转移液体，实现多样品同时处理。核酸自动提取系统可以节省时间和人力，高工作效率，有降低综合成本。该系统操作直观，预设程序使用简便，并且能从复杂样品中进行高效稳定的样品制备，对SEQ检测系统形成强有力的通量支持。•同时适用于宿主细胞DNA残留检测、支原体检测、病毒检测和蛋白残留检测等方法样品制备•和污染物检测的理想工具•ThermoScientific™BindIt™软件可以创建个性化程序V优化实验流程•提取效率高，在复杂样品中回收率稳定•应用领域广，兼容国内外几乎所有磁珠法试剂盒，降低综合成本•自动化样品制备降低人为误差，方便方法转移•提供产品应用技术指导和IQ/OQ服务技术参数技术原理每批通量专利KingFisher磁珠转移株技术24/48/9624DW磁头、96DW磁头、96KF磁头、96PCR磁头磁头类型磁棒类型适用板型末端充磁的非拼接式一体化永磁棒KF24深孔板、KF96深孔板、KF96浅孔板、96PCR板工作体积工作板位操作界面控制模式温控范围仪器内存程序导入20-5.000uL/孔8个LCD彩色显示屏，图形化用户界面单机独立运行;通过电脑及软件控制室温+5~+115°C条件培养基(棕色)中的(A)支原体DNA和(B)MMVDNA的检测。对于可存储500个程序使用Bindlt软件计算机接口USB接口或RS-232C串口试剂兼容性通用磁珠试剂，无品牌限制自动化兼容可与机械臂、移液工作站等周边设备整合外部尺寸重量680x600x380mm(WxDxH)28kg了解产品信息请扫描二维码扫码观看产品视频MatrixM1lgG0.8MNaCl，20mMNaPO4(pH7.5)Ionexchang10mg/mLHydrophobicMM2M3M410mg/mL10mg/mL10mg/mLinteraction50mMNaPO4(pH6.0)Ionexchang0.7MKPO4(pH6.0)100mMsodiumcitrate(pH3.0)A3%mannitol,2%sucrose,10mML-arginine,0.01%20PurifieddrugsubstanceM550mg/mL25订购信息产品规格货号大肠杆菌发酵培养相关产品500g10kg500g10kg500g2kgA4973701A4973702212488212489212750212720212730212710GibcoBactoCDFermentationProductionMedium(FPM)GibcoDifcoSoytoneGibcoBactoExtract10kg50kgThermoScientific