血液代用品医学知识培训专家讲座

第六章血液代用具第1页Contents概论1血红蛋白结构和功效2血红蛋白化学修饰4血红蛋白制备工艺53血液代用具类型主要内容CompanyLogo第2页1概论血液功效常规输血忧患血液代用具含有特点CompanyLogo第3页血液功效运输氧气、二氧化碳和营养物质及代谢产物，能够调整组织水分、酸碱度、渗透压和温度，还能够吞噬细菌（白细胞和巨噬细胞），产生抗体（淋巴细胞）等CompanyLogo第4页血液血细胞红细胞白细胞血小板血浆

(细胞间质)水血浆蛋白、糖、维生素、激素、代谢产物及无机盐等CompanyLogo第5页血细胞CompanyLogo第6页常规输血忧患输血时必须血型相配，延误治疗而造成死亡；血液污染严重，威胁输血安全；健康供血人群不足，血液严重短缺；血液保留期短。CompanyLogo第7页血液代用具含有特点无菌、无病毒、无毒性、无热源、对输入体无免疫原性适合各种血型与人血液全部组分含有相容性，在最大程度上代替人血生理功效（具备运输氧、二氧化碳能力，提供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维持胶体渗透压)在血管内有较长保留时间，代谢产物无毒并能经过正常渠道排出储存时间长，而所需条件不高。血液代用具指含有携带氧气和扩容功效溶液。CompanyLogo第8页2血红蛋白结构和功效血红蛋白结构和功效；影响血红蛋白氧亲和力原因。CompanyLogo第9页Hb组成与结构Hb4条珠蛋白链：α141×2；β146×2

（共574个AA）4分子血红素每条多肽链结合一个血红素分子组成一个Hb单位

∴Hb是四聚体，在红细胞中占干重95％Hb组成CompanyLogo第10页血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链围绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白特点：CompanyLogo第11页血红蛋白功效血红蛋白是一个双向呼吸载体，主要负责运输氧和二氧化碳；血红蛋白和氧结合与解离主要取决于氧分压和血液pH。血红蛋白氧饱和分数和氧分压关系呈S形曲线；曲线说明血红蛋白与氧结合随氧分压增高而加紧，释放氧则伴随氧分压降低而加紧。这么血红蛋白可在较窄氧分压范围内完成输氧任务，使机体内氧水平不致有较大起伏。CompanyLogo第12页影响血红蛋白对氧亲和力原因

P50；影响血红蛋白氧亲和力原因包含红细胞内H+、CO2，氧,2,3-DPG以及其它阴离子浓度等；波尔效应；2,3-DPG影响。CompanyLogo第13页3血液代用具类型无载氧功效血管扩容剂（第一代红细胞代用）；全氟碳化合物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白（第二代血红蛋白代用具）；模拟天然红细胞膜和红细胞内生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”。（第三代血液代用具）CompanyLogo第14页全氟碳化合物

全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)国外很早就有些人开始血液代用具研究。1966年，由美国Cincinnati大学Clark首创并做动物试验，发觉小鼠在含有PFC饱和氧中能正常生存。1978年Naito等首次将第一代氟碳化合物（FluosolDA)用于临床试验。PFC优点是能够直接用化学方法合成，价格低廉，而且不受生物起源影响，防止因异体输血而造成交叉感染。

CompanyLogo第15页全氟碳化合物

—定义及性质

PFC是将碳氧化合物中氢原子全部用氟原子取代而产生一类环状或直链状结构有机化合物。PFC随温度改变而可成固、液、气态，常温下PFC为液态，但不溶于水，需要经过乳化变为可溶性乳剂。PFC氧离曲线与氧分压呈直线相关，不受pH值影响，其溶解氧能力约为血液2倍、水20倍

CompanyLogo第16页全氟碳化合物全氟萘烷CompanyLogo第17页全氟碳化合物

优点：生产不依赖于过期人血或者其它生物起源血液，能够大批量生产，而且纯度能够很好控制；对于不愿意接收他人血液或者血液替换品宗教信仰者。可使用这种化学合成物；

缺点：使用时必须呼吸70%-100%氧；有效时间短；存放需要适当温度和条件；流感样症状。CompanyLogo第18页血红蛋白类血液代用具天然血红蛋白；血红蛋白类血液代用具；

1）血红蛋白制备；

2）血红蛋白化学修饰。CompanyLogo第19页天然血红蛋白比全氟碳化合物更符合人体生理需要，起源广泛；20世纪30年代，Amberson将制备血红蛋白输送给动物进行研究，结果表明这种血红蛋白能有效地输送氧气，不过对肾脏毒性大。其原因主要是溶血质中存在少许膜基质及杂蛋白；无基质血红蛋白（stromafreehemoglobin,SFH)。

1）失去DPG变构调解作用（放氧和载氧降低）；

2）易解聚为αβ二聚体，氧传递能力下降，轻易从肾脏滤出，形成血尿，其代谢产物还会在肾脏小管腔内产生毒性效应。

3）在体内保留时间短。CompanyLogo第20页血红蛋白类血液代用具血红蛋白制备CompanyLogo第21页样品处理→粗分离→纯化→纯度判定1.样品处理：蛋白质提取和分离步骤操作过程可选取猪、牛、羊或其它脊椎动物血液来分离血红蛋白(1)红细胞洗涤:①洗涤目标:

去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离效果）3、吸收血浆：上层透明黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积质量分数为0.9％氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。CompanyLogo第22页首次离心后结果CompanyLogo第23页次洗涤后结果CompanyLogo第24页(2)血红蛋白释放：

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积甲苯

，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以r/min速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层红色透明液体。CompanyLogo第25页(4)透析：

①过程：取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml物质量浓度为20mmol/l磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目标：除去样品中分子量较小杂质。原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。CompanyLogo第26页透析过程动画演示CompanyLogo第27页利用透析袋透析CompanyLogo第28页凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。注意事项：底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然难以铺实尼龙网，还会造成液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按对应位置组装成一个整体。⑤安装其它从属结构。CompanyLogo第29页（2）凝胶色谱柱装填①凝胶选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。CompanyLogo第30页装配好凝胶柱CompanyLogo第31页

④洗涤平衡：装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在50cm高操作压下，用300ml20mmol/l磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象。（2）凝胶色谱柱装填50cm高CompanyLogo第32页（3）样品加入与洗脱

①调整缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液迟缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁围绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗透凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗透凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.020mmol/l磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如红色区带均匀一致移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。CompanyLogo第33页（3）样品加入与洗脱注意：正确加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。CompanyLogo第34页搜集得到纯化后蛋白CompanyLogo第35页血红蛋白类血液代用具血红蛋白化学修饰目标：稳定血红蛋白4聚体结构，增加蛋白相对分子量，以到达降低毒性作用。原理：表面有许多可修饰功效基团类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋白、共轭血红蛋白、脂质体包封血红蛋白；基因重组血红蛋白CompanyLogo第36页分子内交联血红蛋白血红蛋白化学修饰血红蛋白肽链间交联，降低氧亲和力。试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心腔位置，如双阿司匹林类化合物（3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛类化合物。产品：美国Baxter企业DCLHb、加拿大Hemosol企业HemolinkCompanyLogo第37页DCLHb血红蛋白化学修饰

diaspirincross-linkedhemoglobin。用3，5-二溴水杨基双延胡索酸酯对脱氧无基质血红蛋白进行分子内修饰生成α链间交联产物。相对分子量65000。。临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗阻发生率显著提升，三期临床死亡率增加，于1999年底止临床试验。CompanyLogo第38页Hemolink血红蛋白化学修饰

O-棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量聚合、非聚合成份组成，含交联Hb大于95%。临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良反应是血压升高，但在48-72小时内恢复对肝肾功能无影响。CompanyLogo第39页多聚血红蛋白血红蛋白化学修饰分子间修饰主要是形成份子聚合物，从而预防血红蛋白四聚体快速解离，延长在血管中停留时间。交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红蛋白反应时无特异结合位点，属于多位点修饰，形成相对分子量不等交联聚合体，从而降低溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随之降低。产品：美国Biopure企业Hemopure和NorthfieldLaboratories企业生产PolyhemeCompanyLogo第40页共轭血红蛋白血红蛋白化学修饰血红蛋白与天然或者合成可溶性高分子反应，形成共轭结合物，能够大大增加Hb稳定性，有效地预防四聚体解离；同时包裹在Hb周围高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性，提升存留时间；而且，分子稳定性好，能在循环中维持较高氧含量，并降低网状内皮系统吞噬，较少可能过敏和免疫反应。可使失血30-50%狗在两周内无死亡现象，体重、食物摄入量均正常，无显著毒性反应，尿液分析和血液动力学指标也无显著改变。CompanyLogo第41页化学修饰存在问题血红蛋白化学修饰产品是非均一性混合物；病原微生物还未处理；大分子聚合体使一些蛋白溶液引发许多病症；终产物不稳定性，造成交联Hb间重新排列；重现率低。CompanyLogo第42页脂质体包封血红蛋白血红蛋白化学修饰模拟天然红细胞膜和红细胞内生理环境，用仿生高分子材料将血红蛋白包裹起来，制备成“人工红细胞”优点：1）血红蛋白不直接暴露于内环境；2）可将红细胞所属各种酶类包含在人工细胞内，防止四聚体解离而产生肾毒性；3）脂质体不与血型抗体反应，延长其循环时间；4）血红蛋白未经过化学修饰，确保其正常生理功效；5）包裹天然红细胞内高铁血红蛋白还原系统；6）包封入DPG，可降低Hb氧结协力，增加传递氧能力。CompanyLogo第43页脂质体包封血红蛋白血红蛋白化学修饰制备两个基本条件：

1）制备过程中确保极易被氧化血红蛋白不被氧化；2）脂质体包封血红蛋白及其辅助成份在制备和保留过程中有足够稳定性，并使脂质体包封血红蛋白循环存留时间延长工艺发展CompanyLogo第44页脂质体包封血红蛋白工艺发展血红蛋白化学修饰第一代