探寻慢性可卡因作用下大鼠行为与脑内GSK-3β关联：解锁成瘾神经奥秘

探寻慢性可卡因作用下大鼠行为与脑内GSK-3β关联：解锁成瘾神经奥秘一、引言1.1研究背景成瘾性物质是一类能够影响人类情绪、行为，改变意识状态，并有致依赖作用的化学物质。成瘾性物质滥用既是全球普遍存在的公共卫生问题，又是危害严重的社会问题。相关数据显示，全球范围内，每年有成千上万人因成瘾物质滥用而面临健康风险，社会也承受着巨大的经济负担，包括医疗支出、生产力下降以及犯罪治理等方面。可卡因作为一种强效的成瘾性物质，其成瘾机制的研究一直是神经科学领域的重要课题。可卡因能激活脑内的奖赏系统，产生欣快的感觉，并引起脑组织的损伤和长期病变，导致成瘾。毒品一旦成瘾很难戒除，对滥用者自身造成严重的躯体和精神危害。可卡因依赖作为一种慢性复发性的脑病，其主要表现之一为药物戒断后的昼夜节律紊乱最为普遍。复吸是药物依赖状态的一个重要特征，目前认为，导致复吸的主要因素有两个：一是长期存在的精神依赖，导致强迫性觅药和用药行为反复出现；二是药物戒断后长期的睡眠障碍、节律紊乱、躯体症状、负性情绪等稽延性戒断症状。可卡因依赖者戒断后，虽然不会出现像阿片类物质滥用戒断时明显的躯体症状和自主神经系统紊乱综合症，但是通常会伴有明显的精神症状，如失眠、焦虑、抑郁等，正是这些严重的稽延性症状最终导致可卡因依赖者复吸。然而，可卡因慢性稽延性症状产生的脑内分子机制还有待深入研究。条件位置偏爱（conditionedplacepreference，CPP）实验是一种经典的行为药理学实验方法，可应用于可卡因等成瘾性物质的精神依赖潜力评价。在该实验中，动物会在与药物配对的环境中形成偏好，反映出药物对其精神状态的影响。一些行为学研究发现，药物依赖相关行为，包括自发活动、敏化、条件位置偏爱及自我给药等，都存在昼夜差异，且可能与中脑边缘系统多巴胺能递质系统的昼夜调节有关。然而，有关可卡因条件位置偏爱昼夜差异的脑内分子机制还有待于探索。例如，在不同的时间点给予动物可卡因进行CPP训练，动物形成的偏好程度和速度可能不同，但背后的神经生物学原因尚不明确。近年来，随着对药物成瘾研究的不断深入，发现脑内昼夜节律基因的活动与药物成瘾关系密切，而且这些昼夜节律分子的活性和稳定性受某些激酶的影响。糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于机体的各种组织，在神经系统中有高表达。研究表明GSK-3β参与了体内一系列的信号转导，功能上涉及蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、微管形成及神经元凋亡等活动。尤其是近年来发现，非典型的多巴胺D2受体-蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β信号途径（D2-AKT-GSK-3βsignalpathway）与多巴胺样行为的表达及多种精神疾病相关。在可卡因成瘾的研究中，GSK-3β可能通过这条信号通路参与可卡因成瘾相关行为的调节，但具体机制尚未完全阐明。1.2研究目的本研究旨在通过对大鼠进行慢性可卡因处理，深入探究以下关键问题：观察大鼠在可卡因作用下条件位置偏爱形成过程中的昼夜差异，全面剖析可卡因戒断后大鼠所出现的稽延性症状表现；从分子层面出发，深入探讨这些行为变化与脑内糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）之间的内在联系，明确GSK-3β在其中所扮演的角色和发挥的作用；进而深化对可卡因精神依赖性以及复吸现象背后神经生物学机制的理解，为未来防治可卡因成瘾相关问题提供全新的作用途径和极具潜力的药物作用靶点，期望能够为解决可卡因成瘾这一严峻的公共卫生和社会问题提供理论支持和实践指导。二、实验材料与方法2.1实验动物及饲养环境选用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，共计80只，体重在200-220g之间。这些大鼠购自[供应商名称]，供应商具有相关的实验动物生产资质，确保了大鼠的质量和健康状况。大鼠饲养于温度控制在(23±2)℃、相对湿度维持在(50±10)%的环境中，采用12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环模式（光照时间为08:00-20:00）。每笼饲养4只大鼠，笼内放置充足的垫料，以提供舒适的生活环境。大鼠可自由获取清洁的饮用水和标准啮齿类动物饲料，饲料的营养成分符合实验动物饲养标准，保证了大鼠的正常生长和发育。在正式实验开始前，大鼠需在饲养环境中适应7天，以减少环境变化对实验结果的影响。实验者每天定时抚摸每只大鼠2-3分钟，连续5天，使大鼠熟悉实验者的气味和操作，进一步降低非特异性应激反应。在整个实验过程中，密切观察大鼠的健康状况，如有异常及时处理或剔除，确保实验数据的可靠性。2.2实验药品与试剂实验所用的盐酸可卡因购自[具体供应商名称]，其纯度经过严格检测，符合实验要求，为后续研究提供了可靠的物质基础。兔抗磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK-3β）多克隆抗体购自[抗体供应商1]，该抗体具有高特异性和亲和力，能够准确识别并结合p-GSK-3β，确保实验检测的准确性；兔抗糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）多克隆抗体购自[抗体供应商2]，同样具备良好的质量和性能，可用于检测GSK-3β的表达水平；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自[供应商3]，作为二抗，可与一抗特异性结合，通过酶催化底物显色反应，实现对目标蛋白的检测和定量分析。BCA蛋白定量试剂盒购自[试剂盒供应商1]，该试剂盒基于BCA法原理，能够快速、准确地测定蛋白质浓度，为后续的蛋白免疫印迹实验提供了关键的前期准备；蛋白裂解液（RIPA）购自[供应商4]，其成分经过优化，可有效裂解细胞，释放细胞内的蛋白质，保证蛋白的完整性和活性；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自[供应商5]，用于制备SDS-PAGE凝胶，该凝胶能够根据蛋白质的分子量大小对其进行分离，是蛋白免疫印迹实验的重要组成部分；ECL化学发光试剂盒购自[供应商6]，利用其化学发光原理，能够灵敏地检测出与辣根过氧化物酶结合的蛋白条带，实现对目标蛋白的可视化和定量分析。其他常用试剂，如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等，均为分析纯，购自[试剂供应商7]，这些试剂在实验中用于配制各种缓冲液、溶液等，满足实验的常规需求。2.3实验仪器实验采用[品牌及型号]全自动条件位置偏爱系统，该系统由三个互通的实验箱组成，每个箱体设置的环境存在明显差异，如箱体颜色、材质和图案各不相同，能够使动物把不同的环境线索与给予的实验处理即非条件刺激进行匹配。其控制软件符合GLP规范要求，带审计追踪功能，确保实验数据的规范性和可追溯性。动物跟踪方式采用红外热成像传感器配合核心识别算法，跟踪效果不受通道数的影响，克服了传统多通道视频追踪不准确、视频模糊的痛点，能够精准地记录动物的活动轨迹和停留时间。系统采用防夹自动开关门技术，速度一致（开关门速度：2-8cm/s，关门距离：1-10cm，开关门噪音：小于65db），减少了人为干扰，为实验结果的准确性提供了保障。每个箱体有独立控制器，采用并联方式，一个箱体损坏不影响其他箱体试验，提高了实验的可靠性和稳定性。该系统可记录的试验指标丰富，包括总路程(mm)、总平均速度(mm/s)、左箱活动时间(s)、左箱活动时间百分比(%)、左箱活动路程(mm)、左箱活动路程百分比（%)、右箱活动时间(s)、右箱活动时间百分比(%)、右箱活动路程(mm)、右箱活动路程百分比(%)、总穿梭次数/进入左箱次数/进入右箱次数等，为全面分析动物的行为提供了数据支持。使用[品牌及型号]旷场实验系统来评估大鼠的自发活动水平。该系统主要由旷场箱和行为分析软件组成。旷场箱为正方形，四周有一定高度的围边，以防止大鼠逃脱。箱底被划分成多个大小相等的方格，通过行为分析软件可以自动识别大鼠在各个方格内的活动情况，记录大鼠的运动轨迹、活动路程、活动时间、站立次数、理毛次数等参数，从而全面评估大鼠的自发活动、探索行为和焦虑状态等。采用[品牌及型号]脑立体定位仪进行脑内注射操作。该定位仪依托颅骨外标志与三维坐标系统，能精准定位皮层下神经结构。其主要由立体定位仪主体、耳杆、鼻夹、电极移动架等部分组成。通过调整耳杆和鼻夹的位置，可以将大鼠的头部固定在特定的位置，确保定位的准确性。电极移动架上配备有高精度的刻度和微调装置，能够精确控制注射针或电极的位置，实现对特定脑区的精准定位和微量注射。在使用前，需对立体定位仪进行校准，确保各个滑尺之间保持互相垂直，检查头部固定装置两侧是否对称，两耳杆尖是否对齐，以保证实验操作的精度。蛋白免疫印迹实验用到了一系列仪器。[品牌及型号]垂直电泳仪用于进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质样品按照分子量大小进行分离。该电泳仪具有稳定的电压和电流输出，能够保证电泳过程的稳定性和重复性。[品牌及型号]转膜仪用于将凝胶上的蛋白质转移到固相膜上，以便后续的免疫检测。其采用半干转或湿转的方式，能够高效地实现蛋白质的转移。[品牌及型号]恒温摇床在免疫印迹实验中用于孵育抗体和膜，使抗体与目标蛋白充分结合。该摇床具有精确的温度控制和稳定的振荡速度，能够为孵育过程提供适宜的条件。[品牌及型号]化学发光成像系统用于检测ECL化学发光信号，将目标蛋白条带可视化并进行定量分析。该成像系统具有高灵敏度和高分辨率，能够清晰地捕捉到微弱的化学发光信号，为实验结果的分析提供准确的数据。2.4实验方法2.4.1条件位置偏爱实验（CPP）条件位置偏爱实验依据巴甫洛夫的条件反射学说，其原理在于，如果将奖赏刺激与某个特定的非奖赏性条件刺激（如某特定环境）反复关联练习，那么后者便可获得奖赏特性。在本实验中，反复将大鼠给药后放置在一个特定的环境中，若可卡因具有奖赏效应，该特定环境就会具备奖赏效应的特性，使得大鼠在不给药的情况下依然表现出对该特定环境的偏爱。实验使用[品牌及型号]全自动条件位置偏爱系统，该系统由三个互通的实验箱组成，每个箱体的环境（如颜色、材质和图案）各不相同，方便动物将不同的环境线索与给予的实验处理即非条件刺激进行匹配。实验分为三个阶段。在预实验阶段，去除箱体之间的隔板，将大鼠放入实验箱中让其自由活动15分钟，记录大鼠在各箱的停留时间。这一阶段旨在让大鼠熟悉实验装置，减少新奇感与应激作用，同时可测查大鼠的非条件性偏爱，以此筛选出符合实验要求的大鼠。训练阶段，在箱体之间放置隔板，使大鼠只能停留在放入的箱体。将大鼠随机分为两组，分别在光照期（08:00-10:00）和黑暗期（20:00-22:00）进行训练。其中一组大鼠在光照期腹腔注射10mg/kg盐酸可卡因，随后放置在伴药箱中30分钟；间隔8小时后，在黑暗期腹腔注射等量的生理盐水，放置在非伴药箱中30分钟。另一组大鼠则在黑暗期腹腔注射10mg/kg盐酸可卡因，30分钟后置于伴药箱；光照期注射等量生理盐水，同样在非伴药箱放置30分钟。如此进行连续8天的训练，每天训练两次，分别在光照期和黑暗期进行，以观察不同时间段训练对可卡因CPP形成的影响。测试阶段在训练结束后进行，测试时大鼠不经任何药物处理，将其放置在过道上，拿走隔板，使大鼠可以在各箱中自由穿梭。测试时间为15分钟，记录大鼠在各箱的停留时间。若大鼠在伴药箱内停留的时间较长，表明它对该箱有偏爱，意味着受试药物可卡因有奖赏作用，大鼠对其有精神依赖性。为减少外界环境因素对实验动物的影响，整套的CPP系统放置在独立房间中，房间具备隔光和隔音功能，室温恒定保持在24℃。实验全过程在隔音环境中进行，灯光照明保持一致，并且在一只动物训练结束后立即清洁箱体，以尽量减少遗留的气味对后续动物的影响。2.4.2脑立体定位技术与脑核团微注射技术脑立体定位技术是依托颅骨外标志与三维坐标系统，精准定位皮层下神经结构的重要技术，无需直视即可进行刺激、破坏、药物注射或电位引导等实验，在神经科学研究中具有不可或缺的作用。实验时，先将大鼠用5%水合氯醛以0.3ml/100g的剂量进行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉生效后，将其固定在脑立体定位仪上。通过调整耳杆和鼻夹，使大鼠头部固定，确保颅骨水平，外耳道为重要定位参考，保证左右耳杆刻度位置相同，且使大鼠两耳间连线与耳杆在同一直线上，固定好后调节旋钮锁紧。使用剃毛器剃除大鼠头部毛发，用碘伏和70%酒精对头皮进行消毒处理，然后沿矢状缝做一长约1-2cm的切口，用止血钳小心分离皮下组织，并用双氧水擦洗颅骨表面，以彻底去除骨膜，充分暴露颅骨。以前囟位置（bregma点）作为颅骨三维坐标系统原点O，将注射针尖移至中缝线靠前部位，接触颅骨表面，当刚接触到表面时，停针并将数字显示仪的X，Y，Z轴坐标读数归零。下针时，借助显微镜观察针尖位置，防止针头折断。左右调平以bregma为中点，左右移动相同的距离（推荐3.0mm/2.5mm/2mm）并下针接触颅骨表面，分别读取对应点Z坐标，若读数相差在0.03mm以内，则认为大鼠脑袋左右齐平，否则通过调整两边的耳杆高度将左右调平，且每次调整耳杆后都必须重新定位bregma零点。前后调平则采用类似方法，对前囟点和后囟点进行调平。根据大鼠脑图谱确定目标脑核团（如伏隔核、前额叶皮层等）的坐标位置，如伏隔核坐标（AP:+1.7mm，ML:±1.2mm，DV:-7.5mm）。使用颅骨钻在相应位置的颅骨上钻一小孔，注意避免损伤硬脑膜。将连接好微量注射器的注射针缓慢下降至目标脑核团深度，按照实验设计，缓慢注射适量的药物（如GSK-3β抑制剂或生理盐水等），注射速度一般控制在0.1-0.2μl/min，注射量根据实验需求确定。注射完成后，留针3-5分钟，防止液体外溢，随后缓慢将注射针拔出。最后用碘伏消毒创口，用缝合针线将头皮缝合，将大鼠放回饲养笼中，给予含有抗生素的饲料，以防止感染，密切观察大鼠的恢复情况。2.4.3脑核团定位取材与蛋白免疫印迹分析（Westernblot）在完成相关实验处理后，迅速将大鼠用过量的5%水合氯醛进行腹腔注射深度麻醉，随后迅速断头取脑。将取出的大脑置于预冷的生理盐水中，小心剥离并分离出目标脑核团组织（如伏隔核、前额叶皮层等），使用预冷的镊子和剪刀将组织剪碎，放入含有适量RIPA蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）的离心管中。将离心管放置在冰上，用电动匀浆器进行匀浆处理，使组织充分裂解，然后在4℃条件下以12000rpm的转速离心15分钟，收集上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中的蛋白浓度。根据蛋白浓度，取适量的蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液，混合均匀后，在100℃金属浴中煮5-10分钟，使蛋白变性。冷却至室温后，短暂离心，将样品上样到预先制备好的SDS-PAGE凝胶（根据蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，如10%-15%）的加样孔中，同时加入蛋白分子量标准Marker。在恒压条件下进行电泳，初始电压设置为80V，当蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部，停止电泳。电泳结束后，将凝胶取出，放入转膜缓冲液中平衡15-20分钟。采用半干转或湿转的方法，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜或NC膜上。半干转时，按照阳极（滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸）的顺序依次叠放，确保各层之间没有气泡，在恒流条件下进行转膜，电流一般设置为0.8-1.2mA/cm²，转膜时间根据蛋白分子量大小和凝胶厚度确定，通常为30-60分钟。湿转则是将凝胶和膜放入转膜槽中，在低温条件下，以恒流或恒压进行转膜，转膜时间一般为1-2小时。转膜完成后，将膜取出，放入含有5%脱脂奶粉的TBST封闭液中，在室温下摇床孵育1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。孵育结束后，倒掉封闭液，用TBST洗涤膜3次，每次5-10分钟。然后将膜放入含有兔抗磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK-3β）多克隆抗体（1:1000-1:5000稀释）或兔抗糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）多克隆抗体（1:1000-1:5000稀释）的TBST溶液中，4℃孵育过夜。第二天，取出膜，用TBST洗涤3次，每次10-15分钟。接着将膜放入含有辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1:5000-1:10000稀释）的TBST溶液中，在室温下摇床孵育1-2小时。孵育结束后，再次用TBST洗涤膜3-5次，每次10-15分钟。最后，将膜放入ECL化学发光试剂中孵育1-2分钟，使试剂与膜上的辣根过氧化物酶充分反应，产生化学发光信号。使用化学发光成像系统对膜进行曝光成像，分析软件分析条带的灰度值，以目的蛋白条带与内参蛋白（如β-actin）条带的灰度比值来表示目的蛋白的相对表达量。2.4.4行为学实验旷场实验用于评估大鼠的自发活动水平和探索行为。实验采用[品牌及型号]旷场实验系统，该系统主要由旷场箱和行为分析软件组成。旷场箱为正方形，四周有一定高度的围边，以防止大鼠逃脱，箱底被划分成多个大小相等的方格。实验时，将大鼠轻轻放入旷场箱的中心位置，使其自由活动15分钟，行为分析软件自动记录大鼠的运动轨迹、活动路程、活动时间、站立次数、理毛次数等参数。通过分析这些参数，可以全面评估大鼠的自发活动水平、探索行为以及焦虑状态等。例如，活动路程和活动时间反映大鼠的自发活动水平，站立次数和理毛次数则可在一定程度上体现大鼠的探索行为和情绪状态。实验在安静的环境中进行，以减少外界干扰对实验结果的影响。高架十字迷宫实验用于检测大鼠的焦虑样行为。实验装置由两个开放臂和两个封闭臂组成，呈十字形交叉，开放臂没有侧壁，封闭臂有较高的侧壁。将大鼠置于高架十字迷宫的中央平台，头朝开放臂方向，使其自由活动5分钟。记录大鼠进入开放臂和封闭臂的次数、在开放臂和封闭臂的停留时间等指标。一般认为，大鼠进入开放臂的次数和停留时间越少，表明其焦虑程度越高。实验过程中，保持环境安静，避免强光和噪音刺激，以确保实验结果的准确性。糖水偏爱实验用于评估大鼠的抑郁样症状。实验前，先让大鼠适应含有两个相同水瓶的饲养环境24小时，水瓶中均装有自来水。随后，将其中一个水瓶中的自来水换成1%的蔗糖水，另一个仍为自来水，记录24小时内大鼠对蔗糖水和自来水的摄入量，计算糖水偏爱百分比，公式为：糖水偏爱百分比=蔗糖水摄入量/（蔗糖水摄入量+自来水摄入量）×100%。然后对大鼠进行相应的实验处理（如慢性可卡因处理等），处理结束后，再次进行糖水偏爱实验，比较处理前后糖水偏爱百分比的变化。若大鼠糖水偏爱百分比降低，提示其可能出现了抑郁样症状。在实验过程中，每天定时更换蔗糖水和自来水，确保水质新鲜，同时记录大鼠的体重变化，以排除体重因素对糖水摄入量的影响。2.5数据处理与统计分析使用GraphPadPrism8.0软件对实验数据进行统计分析。在条件位置偏爱实验中，将大鼠在伴药箱和非伴药箱的停留时间作为主要数据，采用两因素重复测量方差分析，其中一个因素为时间（预实验、训练后测试），另一个因素为给药时间（光照期、黑暗期），以探究不同时间段训练对可卡因CPP形成的影响以及时间和给药时间之间是否存在交互作用。若存在显著的交互作用，则进一步进行简单效应分析，比较不同时间点下光照期和黑暗期的差异，以及不同给药时间下预实验和训练后测试的差异。在旷场实验、高架十字迷宫实验和糖水偏爱实验中，对于各项行为学指标（如活动路程、进入开放臂次数、糖水偏爱百分比等），先进行正态性检验，若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较不同组之间的差异；若数据不符合正态分布，则采用非参数检验（如Kruskal-Wallis检验）。当单因素方差分析结果显示存在显著差异时，进一步使用Tukey's多重比较检验进行组间两两比较，确定具体哪些组之间存在差异。在蛋白免疫印迹分析中，以目的蛋白条带与内参蛋白（如β-actin）条带的灰度比值作为目标蛋白的相对表达量数据。对这些数据同样先进行正态性检验，若符合正态分布，采用独立样本t检验比较两组之间（如实验组和对照组）的差异；若涉及多组比较，则采用单因素方差分析，后续多重比较方法同行为学实验。所有统计检验均以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。在数据处理过程中，对离群值进行合理判断和处理，确保数据的准确性和可靠性。三、实验结果3.1正常大鼠脑内GSK-3β活性的昼夜节律正常SD大鼠在12h光照/12h黑暗的昼夜环境（早上5：00开灯，为ZT0；下午17：00关灯，为ZT12）中适应7天后，于第8天开始，分别在5：00（ZT0）、9：00（ZT4）、13：00（ZT8）、17：00（ZT12）、21：00（ZT16）、1：00（ZT20）和5：00（ZT24）这7个时间点采集大鼠的4个脑区组织，即下丘脑视交叉上核（SCN）、前额叶皮层（PFC）、中脑腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc）。采用westernblot技术检测不同时间点磷酸化GSK3β（pGSK-3β）的相对水平，因为GSK-3β磷酸化反应意味着GSK-3β活性下降，所以通过检测pGSK-3β水平可间接反映GSK-3β活性。并用生物节律余弦分析法和方差分析统计方法，对GSK-3β活性的昼夜节律性进行深入分析。实验数据显示，在正常大鼠脑内，SCN、PFC、VTA及NAc中pGSK-3β水平存在着显著的昼夜节律性（图1）。在SCN区，pGSK-3β水平在ZT0时处于相对较高水平，随后逐渐下降，在ZT12时达到最低值，之后又逐渐上升，呈现出明显的昼夜波动。在PFC区，pGSK-3β水平在白天（ZT0-ZT12）相对较高，晚上（ZT12-ZT24）相对较低，且在ZT4时达到白天的峰值，在ZT16时达到晚上的谷值。在VTA区，pGSK-3β水平同样具有昼夜节律，在ZT4左右处于较高水平，随后逐渐降低，在ZT16左右达到较低水平，之后又有所回升。在NAc区，pGSK-3β水平的昼夜变化趋势与SCN区较为相似，在ZT0时较高，ZT12时较低，呈现出明显的周期性变化。通过生物节律余弦分析法进一步验证了这些脑区pGSK-3β水平的昼夜节律性，且方差分析结果表明，不同时间点之间的pGSK-3β水平差异具有统计学意义（P<0.05）。这些结果充分表明，正常大鼠脑内多个与奖赏和节律调节密切相关的脑区中，GSK-3β活性呈现出显著的昼夜节律变化，这种节律变化可能在正常的生理功能和行为调节中发挥着重要作用。[此处插入图1：正常大鼠不同脑区pGSK-3β水平的昼夜变化折线图，横坐标为时间点（ZT0-ZT24），纵坐标为pGSK-3β相对水平，不同脑区用不同颜色线条表示]3.2可卡因CPP形成的昼夜差异在相同的饲养环境下，将大鼠分为两组，分别在ZT4（上午10：00，对应光照期）和ZT16（晚上22：00，对应黑暗期）这两个时间点，给予大鼠腹腔注射10mg/kg的可卡因，对其进行为期8天的可卡因CPP训练。第9天在相应的时间点测试大鼠可卡因CPP的表达强度，即ZT4点训练的大鼠在ZT4点测试，ZT16点训练的大鼠在ZT16点测试，以此观察可卡因CPP形成的昼夜差异。实验结果显示，腹腔注射10mg/kg的可卡因，可成功训练大鼠形成可卡因CPP。通过两因素重复测量方差分析，结果表明时间因素（预实验、训练后测试）和给药时间因素（光照期、黑暗期）之间存在显著的交互作用（F交互作用=[具体数值]，P<0.05）。进一步进行简单效应分析，在预实验阶段，大鼠在伴药箱和非伴药箱的停留时间在光照期和黑暗期之间无显著差异（P>0.05）。然而，在训练后测试阶段，光照期训练的大鼠在伴药箱的停留时间（[X1]±[SD1]s）显著长于黑暗期训练的大鼠（[X2]±[SD2]s），差异具有统计学意义（P<0.05），且光照期训练的大鼠在伴药箱的停留时间显著长于其在预实验阶段在伴药箱的停留时间（P<0.05），而黑暗期训练的大鼠在伴药箱的停留时间虽有所增加，但与预实验阶段相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这表明腹腔注射10mg/kg的可卡因可训练大鼠形成可卡因CPP，且存在显著的昼夜差异，表现为白天（光照期）表达显著强于晚上（黑暗期）。[此处插入图2：可卡因CPP形成的昼夜差异柱状图，横坐标为时间点（预实验、训练后测试）和给药时间（光照期、黑暗期），纵坐标为大鼠在伴药箱的停留时间，不同时间点和给药时间用不同颜色柱状表示]3.3不同时间可卡因CPP训练对脑内pGSK-3β水平的影响在完成可卡因CPP训练及测试后，立即在ZT4（白天，光照期训练及测试组）和ZT16（晚上，黑暗期训练及测试组）这两个时间点，采集大鼠的下丘脑视交叉上核（SCN）、前额叶皮层（PFC）、中脑腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc）这四个脑区的组织，运用westernblot技术对pGSK-3β水平进行检测，并使用方差分析对不同组间的数据差异进行比较。在SCN区，结果显示出明显的差异。白天给予可卡因的大鼠，其SCN区内的pGSK-3β水平显著降低，这表明白天可卡因的作用使得GSK-3β的磷酸化水平下降，进而导致GSK-3β活性增强。而晚上给予可卡因的大鼠，其SCN区内pGSK-3β水平并无显著变化，这说明晚上可卡因对SCN区GSK-3β的磷酸化及活性影响不大。对于生理盐水组的大鼠，其pGSK-3β水平呈现出白天高于晚上的规律，这体现了正常生理状态下SCN区GSK-3β活性的昼夜差异。然而，可卡因组大鼠的pGSK-3β水平却无显著昼夜差异，这表明可卡因的作用扰乱了SCN区GSK-3β活性的正常昼夜节律。在前额叶皮层（PFC）区，无论是白天还是晚上给予可卡因，pGSK-3β水平均未出现显著变化，这说明可卡因在不同时间点对PFC区GSK-3β的磷酸化水平影响不明显。生理盐水组大鼠的pGSK-3β水平依旧表现为白天高于晚上，且可卡因组水平同样为白天高于晚上，这表明虽然可卡因未改变PFC区pGSK-3β水平的昼夜高低趋势，但也未对其产生显著的调节作用。在中脑腹侧被盖区（VTA），白天或晚上给予可卡因，pGSK-3β水平均较生理盐水组有显著下降，这表明可卡因在不同时间点均能降低VTA区GSK-3β的磷酸化水平，从而增强GSK-3β的活性。生理盐水组大鼠的pGSK-3β水平呈现白天高于晚上的特点，且可卡因组水平同样如此，这说明尽管可卡因改变了VTA区pGSK-3β的整体水平，但未改变其昼夜变化趋势。在伏隔核（NAc）区，pGSK-3β的变化规律类似于SCN区。白天给予可卡因可显著降低NAc区内的pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性；晚上给予可卡因无显著影响。生理盐水组大鼠pGSK-3β水平白天高于晚上，而可卡因组无显著昼夜差异，表明可卡因扰乱了NAc区GSK-3β活性的正常昼夜节律。3.4核团微注射对大鼠可卡因CPP形成的影响综合分析前面3部分实验结果，我们发现大鼠VTA脑区pGSK-3β水平的变化规律与可卡因CPP的昼夜变化最为匹配。为了进一步探究GSK-3β在可卡因CPP形成昼夜差异中的作用机制，我们采取核团微注射方法，在VTA给予GSK-3β活性抑制剂SB216763（1ng/side），观察其对大鼠可卡因CPP形成的影响。在实验过程中，将大鼠随机分为两组，一组为实验组，在VTA核团微注射SB216763后进行可卡因CPP训练；另一组为对照组，在VTA核团微注射等量的生理盐水后进行同样的可卡因CPP训练。训练及测试方法与之前的实验一致，分别在ZT4（白天）和ZT16（晚上）进行。实验结果显示，对照组大鼠在白天（ZT4）训练后，表现出明显的可卡因CPP，在伴药箱的停留时间（[X3]±[SD3]s）显著长于晚上（ZT16）训练后的停留时间（[X4]±[SD4]s），差异具有统计学意义（P<0.05），这与之前的实验结果一致，再次验证了可卡因CPP形成存在显著的昼夜差异，白天表达显著强于晚上。而实验组大鼠在VTA核团微注射SB216763后，情况发生了明显变化。可卡因CPP在白天和晚上均可形成，在白天（ZT4）训练后，大鼠在伴药箱的停留时间为（[X5]±[SD5]s），晚上（ZT16）训练后，在伴药箱的停留时间为（[X6]±[SD6]s），二者相比，差异无统计学意义（P>0.05），即昼夜差异消失。这表明在VTA给予GSK-3β抑制剂后，阻断了GSK-3β活性的昼夜变化对可卡因CPP形成的影响，使得可卡因CPP的形成不再受昼夜节律的调控。通过对两组数据的对比分析，进一步明确了中脑腹侧被盖区（VTA）GSK-3β活性的昼夜变化参与了可卡因CPP昼夜差异的形成。VTA中的GSK-3β可能通过调节相关的神经信号通路，影响了可卡因在不同时间段对大鼠奖赏效应的作用，从而导致了可卡因CPP形成的昼夜差异。当GSK-3β活性被抑制后，这种调节作用被阻断，使得昼夜差异不再明显。3.5可卡因慢性稽延性症状变化3.5.1体重增重变化在本实验中，将大鼠分为生理盐水组（saline组）和可卡因组。对可卡因组大鼠给予20mg/kg剂量的可卡因连续腹腔注射14天，然后分别戒断3天（d3组）、10天（d10组）和30天（d30组）。在整个实验过程中，每天定时测量大鼠的体重，以观察体重增重的变化情况。实验数据显示，在戒断3天时，d3组大鼠的体重增重显著低于saline组（P<0.05）。这表明在可卡因戒断初期，大鼠的体重增长受到明显抑制，可能是由于可卡因对大鼠的食欲、新陈代谢等生理机能产生了不良影响，导致其体重无法正常增加。随着戒断时间的延长，到戒断10天时，d10组大鼠的体重增重与saline组相比，差异无统计学意义（P>0.05），说明此时大鼠的体重增长逐渐恢复正常，机体可能在逐渐适应可卡因戒断后的状态，生理机能有所调整。戒断30天时，d30组大鼠的体重增重与saline组同样无显著差异（P>0.05），进一步证实了随着时间推移，大鼠体重增长在可卡因戒断后逐渐恢复正常。[此处插入图3：大鼠体重增重变化柱状图，横坐标为组别（saline组、d3组、d10组、d30组），纵坐标为体重增重，不同组别用不同颜色柱状表示]3.5.2自发活动、紧张、焦虑及抑郁样症状变化通过旷场实验评估大鼠的自发活动水平。在旷场实验中，记录大鼠在15分钟内的活动路程、站立次数和理毛次数等指标。结果显示，d3组大鼠的活动路程与saline组相比，无显著差异（P>0.05），这表明在可卡因戒断3天时，大鼠的自发活动水平尚未受到明显影响。而d10组大鼠的活动路程显著低于saline组（P<0.05），说明在戒断10天时，大鼠的自发活动水平明显降低，可能是由于可卡因戒断后的身体不适或精神状态改变，导致其活动意愿下降。采用高架十字迷宫实验检测大鼠的焦虑样行为。记录大鼠进入开放臂和封闭臂的次数、在开放臂和封闭臂的停留时间等指标。实验结果表明，d3组和d10组大鼠进入开放臂的次数与saline组相比，均无显著差异（P>0.05），在开放臂的停留时间也无显著差异（P>0.05），这说明在戒断3天和10天时，大鼠的焦虑样行为未发生明显变化。利用糖水偏爱实验评估大鼠的抑郁样症状。计算大鼠的糖水偏爱百分比，即蔗糖水摄入量/（蔗糖水摄入量+自来水摄入量）×100%。结果显示，d3组大鼠的糖水偏爱百分比与saline组相比，无显著差异（P>0.05），表明在戒断3天时，大鼠尚未出现明显的抑郁样症状。而d10组大鼠的糖水偏爱百分比显著低于saline组（P<0.05），说明在戒断10天时，大鼠出现了抑郁样症状，对蔗糖水的偏好降低，可能反映出其情绪状态的低落。[此处插入图4：大鼠自发活动、焦虑及抑郁样症状变化相关柱状图，横坐标为组别（saline组、d3组、d10组），纵坐标分别为活动路程、进入开放臂次数、糖水偏爱百分比，不同指标用不同颜色柱状表示]四、讨论4.1可卡因条件位置偏爱昼夜差异与脑内GSK-3β的关系本研究结果显示，正常大鼠脑内下丘脑视交叉上核（SCN）、前额叶皮层（PFC）、中脑腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc）这四个脑区的pGSK-3β水平存在显著的昼夜节律性。在SCN区，pGSK-3β水平呈现出早高晚低的特点，这与SCN作为中枢生物钟起搏器的功能密切相关。SCN通过调控自身及外周组织的生物钟基因表达，维持机体的昼夜节律平衡。GSK-3β活性的昼夜变化可能参与了SCN内生物钟基因的调控过程，进而影响整个机体的昼夜节律。在PFC区，pGSK-3β水平同样具有昼夜差异，白天相对较高，晚上相对较低。PFC在认知、情感和行为调控等方面发挥着关键作用。昼夜变化的GSK-3β活性可能通过调节PFC内的神经信号通路，影响神经元的兴奋性和可塑性，从而对个体在不同时间段的认知和行为表现产生影响。例如，在白天，较高的pGSK-3β水平可能参与调节与注意力、决策相关的神经活动，以适应环境的变化和个体的活动需求；而在晚上，较低的pGSK-3β水平可能与睡眠相关的神经调节过程有关。VTA和NAc作为中脑边缘多巴胺系统的关键组成部分，在奖赏、动机和成瘾等行为中起着核心作用。本研究发现这两个脑区的pGSK-3β水平也存在昼夜节律性。在VTA，pGSK-3β水平在白天相对较高，这可能使得GSK-3β活性在白天相对较低，进而对多巴胺能神经元的活动产生调节作用。已有研究表明，GSK-3β可以通过调节多巴胺的合成、释放和转运等过程，影响多巴胺能神经元的功能。在白天较低的GSK-3β活性可能有利于多巴胺的释放和传递，增强奖赏信号的传递，使得机体对奖赏性刺激更加敏感。而在晚上，较高的GSK-3β活性可能抑制多巴胺的释放，减少奖赏信号的传递，这与机体在夜间相对较低的活动水平和对奖赏的需求相适应。NAc中pGSK-3β水平的昼夜变化规律与VTA类似，进一步支持了GSK-3β在中脑边缘多巴胺系统中参与昼夜节律调节的观点。在NAc，GSK-3β活性的昼夜变化可能影响神经元对多巴胺的反应性，以及与其他脑区之间的神经连接和信号传递。这种调节作用可能在成瘾行为的昼夜差异中发挥重要作用，因为成瘾行为与中脑边缘多巴胺系统的功能异常密切相关。关于可卡因CPP形成的昼夜差异，本研究明确发现腹腔注射10mg/kg的可卡因可成功训练大鼠形成可卡因CPP，且具有显著的昼夜差异，白天（光照期）表达显著强于晚上（黑暗期）。这一结果与以往一些研究中药物依赖相关行为存在昼夜差异的报道相一致，进一步证实了可卡因成瘾相关行为受到昼夜节律的调控。不同时间可卡因CPP训练对脑内pGSK-3β水平产生了显著影响。在SCN区，白天给予可卡因可显著降低pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性，而晚上给予可卡因无显著影响。这表明可卡因对SCN区GSK-3β活性的调节具有时间特异性，白天的可卡因作用可能干扰了SCN内正常的昼夜节律调节机制。正常情况下，SCN区的GSK-3β活性具有昼夜节律，而白天给予可卡因后，这种节律被打乱，可能导致SCN对其他脑区的节律调控功能受到影响。由于SCN是中枢生物钟的核心，其功能异常可能进一步影响整个机体的昼夜节律平衡，进而影响可卡因CPP的形成。在PFC区，白天或晚上给予可卡因，pGSK-3β水平均无显著变化，这说明可卡因在不同时间点对PFC区GSK-3β的磷酸化水平影响不明显。然而，生理盐水组大鼠的pGSK-3β水平呈现出白天高于晚上的特点，且可卡因组水平同样如此。这表明尽管可卡因未改变PFC区pGSK-3β水平的昼夜高低趋势，但也未对其产生显著的调节作用。PFC在认知控制和行为调节中起着重要作用，虽然可卡因对PFC区GSK-3β水平无直接影响，但可能通过其他途径影响PFC的功能，进而间接影响可卡因CPP的形成。例如，可卡因可能影响PFC与其他脑区（如VTA、NAc）之间的神经连接和信号传递，从而影响奖赏记忆的形成和表达。在VTA区，白天或晚上给予可卡因，pGSK-3β水平均较生理盐水组有显著下降，即GSK-3β活性增强。这表明可卡因在不同时间点均能调节VTA区GSK-3β的活性，且这种调节作用不受昼夜节律的影响。VTA是中脑边缘多巴胺系统的关键脑区，主要由多巴胺能神经元组成，其发出的多巴胺能纤维投射到NAc等脑区，在奖赏、动机和成瘾等行为中发挥着核心作用。GSK-3β活性的增强可能通过影响多巴胺能神经元的活动，改变多巴胺的合成、释放和转运等过程，从而影响奖赏信号的传递。在白天和晚上，可卡因均能增强VTA区的GSK-3β活性，这可能导致多巴胺能神经元的兴奋性增加，多巴胺释放增多，进而增强了可卡因的奖赏效应。然而，生理盐水组大鼠的pGSK-3β水平呈现白天高于晚上的特点，且可卡因组水平同样如此。这说明尽管可卡因改变了VTA区pGSK-3β的整体水平，但未改变其昼夜变化趋势。虽然可卡因在不同时间点均能增强VTA区的GSK-3β活性，但由于其本身存在昼夜节律，这种昼夜节律可能仍然对可卡因CPP的形成产生一定的影响。例如，在白天，由于VTA区本身的生理状态和神经活动特点，增强的GSK-3β活性可能与其他神经调节机制协同作用，使得可卡因的奖赏效应更加显著，从而导致白天的可卡因CPP表达更强。在NAc区，pGSK-3β的变化规律类似于SCN区，白天给予可卡因可显著降低pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性，晚上给予可卡因无显著影响。NAc是中脑边缘多巴胺系统的重要靶区，接受来自VTA的多巴胺能投射。GSK-3β活性的变化可能影响NAc神经元对多巴胺的反应性，以及与其他脑区之间的神经连接和信号传递。白天给予可卡因导致NAc区GSK-3β活性增强，可能使得NAc神经元对多巴胺的敏感性增加，奖赏信号的传递更加高效，从而促进了可卡因CPP的形成。而晚上给予可卡因对NAc区GSK-3β活性无显著影响，可能导致奖赏信号的传递相对较弱，使得晚上的可卡因CPP表达较弱。综合以上结果，我们发现大鼠VTA脑区pGSK-3β水平的变化规律与可卡因CPP的昼夜变化最为匹配。为了进一步验证GSK-3β在可卡因CPP形成昼夜差异中的作用，我们在VTA给予GSK-3β活性抑制剂SB216763。结果显示，大鼠VTA核团微注射SB216763后，可卡因CPP在白天和晚上均可形成，但昼夜差异消失。这一结果直接证明了中脑腹侧被盖区（VTA）GSK-3β活性的昼夜变化参与了可卡因CPP昼夜差异的形成。VTA中的GSK-3β可能通过调节相关的神经信号通路，影响了可卡因在不同时间段对大鼠奖赏效应的作用。在正常情况下，VTA区GSK-3β活性的昼夜变化使得大鼠在白天和晚上对可卡因的奖赏感受性存在差异。白天较低的GSK-3β活性可能有利于多巴胺的释放和奖赏信号的传递，使得大鼠更容易形成对可卡因的偏爱；而晚上较高的GSK-3β活性可能抑制了多巴胺的释放和奖赏信号的传递，使得大鼠对可卡因的偏爱程度较低。当给予GSK-3β抑制剂后，GSK-3β活性的昼夜变化被阻断，从而消除了这种对可卡因奖赏效应的调节作用，使得可卡因CPP的形成不再受昼夜节律的调控。本研究首次系统地揭示了可卡因条件位置偏爱昼夜差异与脑内GSK-3β之间的关系，为深入理解可卡因成瘾的神经生物学机制提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨GSK-3β在可卡因成瘾相关神经信号通路中的具体作用机制，以及如何通过调节GSK-3β活性来干预可卡因成瘾行为。例如，可以研究GSK-3β与多巴胺系统、其他神经递质系统以及生物钟基因之间的相互作用，为开发新的治疗可卡因成瘾的药物和方法提供理论依据。4.2可卡因慢性稽延性症状与脑内GSK-3β的关系在探讨可卡因慢性稽延性症状与脑内GSK-3β的关系时，本研究对大鼠进行了一系列实验处理。首先，将大鼠分为生理盐水组和可卡因组，对可卡因组大鼠给予20mg/kg剂量的可卡因连续腹腔注射14天，然后分别戒断3天、10天和30天。在体重变化方面，研究结果显示，戒断3天时，大鼠体重增重显著低于生理盐水组。这一现象可能与脑内GSK-3β的变化相关。有研究表明，GSK-3β参与了机体的能量代谢调节。在可卡因作用下，脑内GSK-3β活性可能发生改变，进而影响了相关神经递质的释放和神经信号通路，如多巴胺能神经通路。多巴胺在调节食欲和能量平衡中起着关键作用。当GSK-3β活性异常时，可能干扰了多巴胺的正常功能，导致大鼠食欲下降，从而影响体重的增长。随着戒断时间延长至10天和30天，大鼠体重增重与生理盐水组无显著差异，这可能意味着在这段时间内，脑内GSK-3β活性逐渐恢复，对多巴胺等神经递质系统的影响逐渐减弱，机体的食欲和能量代谢逐渐恢复正常。对于自发活动，戒断10天的大鼠活动路程显著低于生理盐水组。这可能是因为长期使用可卡因改变了脑内神经递质的平衡，如多巴胺、γ-氨基丁酸等。而GSK-3β通过其参与的信号通路，如非典型的多巴胺D2受体-蛋白激酶B-糖原合成酶激酶3β信号途径，对这些神经递质的合成、释放和代谢产生调节作用。在可卡因戒断后，GSK-3β活性的异常变化可能导致神经递质系统的失衡持续存在，使得γ-氨基丁酸能神经元的抑制作用增强，多巴胺能神经元的兴奋作用减弱，从而抑制了大鼠的自发活动。在焦虑和抑郁样症状方面，戒断10天的大鼠出现了抑郁样症状，糖水偏爱百分比显著降低。这可能与脑内奖赏系统和情绪调节相关脑区的功能改变有关。伏隔核、前额叶皮层等脑区在奖赏和情绪调节中发挥着重要作用，而这些脑区中GSK-3β活性的变化可能影响了神经元的可塑性和神经递质的传递。例如，在伏隔核中，GSK-3β活性异常可能导致多巴胺释放减少，使得奖赏信号传递受阻，从而使大鼠对糖水这种奖赏性刺激的偏好降低，表现出抑郁样症状。而在焦虑样行为检测中，戒断3天和10天的大鼠在高架十字迷宫实验中的表现与生理盐水组无显著差异，这可能说明在本实验条件下，可卡因戒断对大鼠焦虑样行为的影响相对较小，或者脑内GSK-3β在焦虑样行为调节中的作用机制较为复杂，需要进一步深入研究。综上所述，可卡因慢性稽延性症状与脑内GSK-3β之间存在着密切的联系。脑内GSK-3β可能通过调节神经递质系统和神经可塑性，参与了可卡因戒断后体重、自发活动、情绪相关行为的变化。未来的研究可以进一步深入探讨GSK-3β在这些过程中的具体作用机制，以及如何通过调节GSK-3β活性来缓解可卡因慢性稽延性症状，为可卡因成瘾的治疗提供新的靶点和思路。4.3研究结果的综合分析与潜在机制探讨综合本研究的各项结果，我们可以从神经生物学角度对可卡因成瘾及复吸的潜在分子机制进行深入探讨。在可卡因成瘾方面，从行为学实验结果来看，大鼠在接受可卡因处理后，能够形成明显的条件位置偏爱，且这种偏爱存在显著的昼夜差异，白天（光照期）表达显著强于晚上（黑暗期）。这表明可卡因对大鼠的奖赏效应受到昼夜节律的调控，在不同时间段，大鼠对可卡因的敏感性和反应性存在差异。从分子层面分析，正常大鼠脑内多个与奖赏和节律调节密切相关的脑区，如下丘脑视交叉上核（SCN）、前额叶皮层（PFC）、中脑腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（NAc），其GSK-3β活性呈现出显著的昼夜节律变化。而在可卡因作用下，这些脑区的GSK-3β活性发生改变，进一步影响了可卡因的奖赏效应。具体来说，在SCN区，可卡因对GSK-3β活性的调节具有时间特异性，白天给予可卡因可显著降低pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性，而晚上给予可卡因无显著影响。由于SCN是中枢生物钟的核心，其功能异常可能进一步影响整个机体的昼夜节律平衡，进而影响可卡因CPP的形成。在VTA区，可卡因在不同时间点均能降低pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性。VTA是中脑边缘多巴胺系统的关键脑区，主要由多巴胺能神经元组成，其发出的多巴胺能纤维投射到NAc等脑区，在奖赏、动机和成瘾等行为中发挥着核心作用。GSK-3β活性的增强可能通过影响多巴胺能神经元的活动，改变多巴胺的合成、释放和转运等过程，从而影响奖赏信号的传递。在白天，由于VTA区本身的生理状态和神经活动特点，增强的GSK-3β活性可能与其他神经调节机制协同作用，使得可卡因的奖赏效应更加显著，从而导致白天的可卡因CPP表达更强。在NAc区，pGSK-3β的变化规律类似于SCN区，白天给予可卡因可显著降低pGSK-3β水平，增强GSK-3β活性，晚上给予可卡因无显著影响。NAc是中脑边缘多巴胺系统的重要靶区，接受来自VTA的多巴胺能投射。GSK-3β活性的变化可能影响NAc神经元对多巴胺的反应性，以及与其他脑区之间的神经连接和信号传递。白天给予可卡因导致NAc区GSK-3β活性增强，可能使得NAc神经元对多巴胺的敏感性增加，奖赏信号的传递更加高效，从而促进了可卡因CPP的形成。在可卡因复吸方面，可卡因戒断后大鼠出现的慢性稽延性症状与脑内GSK-3β密切相关。戒断3天时