肿瘤放射生物学基础

肿瘤放射生物学基础

Theeffectsofradiationontumors.Thebiologicalbasesofradiotherapy第一节

实验肿瘤模型及其分析方法

CancerModelSystemsInVitro肿瘤模型的建立是放射肿瘤学实验研究的基础。实验室常用的肿瘤模型包括：原发性肿瘤（转化的肿瘤）移植性实体瘤动物模型人类肿瘤异种移植模型多细胞球状体体外肿瘤模型肿瘤的传代方式：从一代动物移植到下一代。实验动物：兄妹交配近亲繁殖的大鼠或小鼠方法：

1、细胞悬液接种：无菌分离肿瘤细胞，给同系受体动物每只皮下接种1×104～106个肿瘤细胞，数天或数周接种部位出现可触及的肿瘤。一、移植性实体瘤动物模型

2、组织块移植接种：

在无菌条件下从荷瘤动物取出肿瘤，以生理盐水或PBS洗去血圬物，去掉包膜以及坏死组织，然后将组织切成1-2nm3的小块。用套管针或眼科镊子直接植人同一品系动物或裸鼠预定部位的皮下。部位：肋腹、后背或腿部用途：各种整体实验，如：肿瘤对辐射的反应性，肿瘤放射敏感性等特点：

重复性、稳定性、定量性好因常用小鼠故对人体缺乏反应性AnimalTumorModelsinVivo

RoutesofChallengeIP(Intraperitoneal)SC(Sub-cutaneous)IM(Intra-Muscular)ID(Intra-dermal)IV(Intravenous)IT(Intra-thecal)PO(Orally)动物肿瘤和人体肿瘤的可比性

ProblemswithTransplantedAnimalandHumanTumorModels1、体积（Volume）：

小鼠肿瘤的绝对体积比人体肿瘤小，但肿瘤和其载体（整个身体）体积的比值，小鼠的要大得多。2、乏氧细胞（Hypoxiccells）：由于氧合程度的不同，肿瘤细胞和其附近血管的距离决定了细胞的放射敏感性。人和啮齿类动物肿瘤内毛细血管和组织坏死之间的距离是十分相似的，两者间乏氧细胞的比例差别也很小。3、肿瘤的组织类型

两类肿瘤的组织类型和它们的生长率有一定的差异。可以通过选择获到所需要的人体肿瘤模型。有些小鼠肿瘤和人体肿瘤的特点是一样的。因此，应根据所用实验肿瘤的具体特性制定实验计划，或根据实验时间的要求选择实验对象。介绍几种常用的方法。实体瘤照射效应的评价指标

SOLIDTUMORASSAYSYSTEMSSOLIDTUMORASSAYSYSTEMS（1）实体瘤体内原位分析

Solid

Tumoranalyzed

insitu

1、肿瘤生长速率（Tumorgrowthrates）：通过测量肿瘤大小（平均直径或体积）表示肿瘤生长速率的快慢。样本量要大。是评价实体瘤对某种处理方案反应的最简单、最常用的终点指标。TumorGrowthMeasurementsGrowthdelay方法：实验中每天或每两天（由肿瘤生长速率而定）测量肿瘤大小，所得结果用时间（横坐标）与肿瘤大小（纵坐标）绘制肿瘤曲线。当肿瘤长到一定大小时（大鼠：8～10mm；小鼠2～4mm）则可进行多种方案处理，观察处理后肿瘤生长速率的变化。一是从照射时算起，肿瘤再长到与照射当时同等大小所需的时间；一是从照射时算起，肿瘤长到指定大小所需的时间（TX射线），与对照组肿瘤长到同等大小所需时间（T肿瘤）相比较。优点：照射的剂量范围大(从几个戈瑞到几十戈瑞均可），但是每个剂量点需要8～10只动物，实验周期较长，从肿瘤接种到实验结束大约需要2～3个月左右．而且要求实验动物在试验期间不能因肿瘤转移等非实验因素而造成死亡。2、50％肿瘤控制实验

50%tumorcontrolassay（TCD50）定义：指荷瘤动物中50％的肿瘤得到控制或治愈所需要的照射剂量

实验时将荷瘤动物分成若干实验组，用大剂量照射肿瘤局部，连续定期观察并记录不同剂量照射组小鼠局部肿瘤消退数，然后以照后不同天数肿瘤局部控制率或治愈率为纵坐标，照射剂量为横坐标作图，可得不同条件下的剂量效应曲线；取不同处理各组达到50％被控制的剂量即TCD50

。1.Injectmicewithenoughcellstoformatumor3.Determinethedoseofradiationthatisneededtocure50%ofmice.100500Percentofmicewithtumors2.Irradiatewhen6mmdiam01020304050607080GyThreshold-sigmoidcurvethatgoesfrom10%to90%cureoverabout10Gyinaclinicalfractionationscheme(whichishardtodoinmice).评价某种放射治疗方案对肿瘤的抑制程度；优点：在用同品系动物做实验时重复性较好，标准误差一般不超过5％，可为临床放疗提供极为有价值的资料。

缺点：实验所需的动物数量较多，每个剂量组一般需要动物10～20只，实验周期因肿瘤生长的速度而异，一般较长(短者3个月，长至4～5个月），因此有可能在实验观察期动物因肿瘤转移等其他原因而死亡，得不到需要的数据．肿瘤局部控制率的照射剂量可提供分析的范围较窄3、核素活性丢失的测试

Nuclideactivitylosingassay

先让肿瘤内处于活跃增殖周期的细胞标记上125I-UdR。测定肿瘤在受照射后不同时间内核素活性丢失的情况，可反映肿瘤受损伤的程度。特点：用时较短(约10天左右），所用动物也少，仅用几只即可；但其敏感性仅限于低剂量的一到两个数量级的细胞杀灭(SF=0.1~0.01)如肿瘤有免疫性，还会受肿瘤内非肿瘤细胞的干扰。（2）稀释测定技术

Dilutionassay1、TD50有限稀释实验（TD50limitingdilutionassay）方法：

荷瘤动物→照射→取瘤→制细胞悬液→计数→倍比浓度稀释→接种→观察肿瘤出现情况→计算50%动物发生肿瘤的肿瘤数（TD50）将受0剂量照射的荷瘤动物的TD50与受不同剂量照射的荷瘤动物的TD50值相比，分别计算出各剂量的存活分数。存活分数＝TD50对照TD50照射特点：比较烦琐，实验的步骤多，而且需要的动物量相当大，整个一批实验所用时间也较长。目前如能采用其他方法说明问题，一般不再采用此法。1.肺集落测定（Lungcolonyassay）方法：荷瘤动物原位照射肿瘤后→取瘤制成单细胞悬液→将已知数量的单细胞悬液经静脉注入受体动物→3周后处死动物→计数肺集落形成数。（3）集落测定

Colonyassay将受不同剂量原位照射的肿瘤细胞注入受体动物后所形成的肺集落数与0剂量照射形成的肺集落数相比，可求出各照射剂量下的存活分数，并绘制出肿瘤细胞经体内照射后的剂量存活曲线。Lungcolonyassay2.体内－体外测定技术（In-vivo/in-vitroassay）某些细胞或实体肿瘤的细胞既可在动物体内生长成实体瘤，又可进行离体单细胞集落培养，也就是说可进行体内、外迅速转换，并迅速生长。采用体外集落形成方法，测定体内照射后肿瘤细胞存活率的方法。方法：将受不同剂量体内局部照射的肿瘤取出，分别制备单细胞悬液，将一定数量的细胞种入培养皿中，在离体条件下培养10～14天后，存活细胞可形成集落，计数集落，计算出存活的肿瘤细胞数，与0剂量下存活的肿瘤细胞数相比，得出某剂量下细胞的存活分数。In-vivo/in-vitroassay二、人类肿瘤异种移植模型

HumanCancersinAnimalHosts

XenogeneicTumorModels多种人类肿瘤细胞可以在免疫缺陷的动物体中以异种移植生长。用于异种移植的受体动物有：裸鼠

(Nude)or（AthymicMice）米色鼠

(BeigeMice)：NKDeficientSCIDMice–Severecombinedimmuno-deficientmiceImmunosuppressionbyIrradiationorDrugTreatment机体中免疫豁免位置（ImmunologicallyPrivilegedSites）仓鼠的颊囊（HamsterCheekPouch）角膜（CorneaoftheEye）优点：保留人类的核型及该个体肿瘤的组织形态、生化和细胞遗传特性到至少10代。缺点：1、有肿瘤被排斥的反应；2、移植肿瘤细胞在小鼠体内发生动力学和细胞选择（肿瘤的生长速度比在人体内时快），出现乏氧细胞；3、移植肿瘤在小鼠体内维持人类肿瘤的组织学特性，而基质组织则来源于小鼠。在对人类肿瘤细胞异种移植物的研究中，血管系统的供应起十分重要的作用，因此，所得结果的确切性则较鼠类肿瘤的研究差。ResponseofHumantumorxenograftsandclinicalcompleteremissionrates三、肿瘤细胞的单层vs

球形培养

Monolayersvs.3-Dspheroidcultures哺乳动物细胞培养时或贴壁生长或悬浮生长。即使悬浮生长时也是单层生长。但某些细胞，特别是啮齿动物的几种肿瘤细胞系却可成球形生长(growasspheroids.)1、体外肿瘤模型系统－

多细胞球状体定义：某些肿瘤细胞在培养中形成多细胞球状体，即每通过一次细胞分裂，子细胞粘在一起形成球形细胞团，随培养时间增加，细胞团逐渐增大，有时可成为由数百万细胞组成的一个大细胞团。形态：显微镜下观察，球体的外层由健康的细胞紧密相靠，随着球体积逐渐增大，分裂的子细胞互相粘在一起，当球长得很大时，其中大部分由于乏氧和营养不足而形成坏死区域，存在自然乏氧细胞，靠近中间的细胞其增殖周期延长；成熟的球体，犹如体内肿瘤一样，其内部的细胞是异质性的．因此，可用于观察一些因素对肿瘤的影响。

细胞群的组成

1）非同步的，处于周期细胞的细胞

2）不在细胞周期的G1期样细胞

3）G1期样乏氧细胞（约20％）与原发肿瘤的相似之处：分化特性：如特殊组织形态的生长或抗原的表达。细胞的异质性：诱导增殖的梯度和静止生长体积动力学优点：更好的模拟了体内实体瘤，有利于增敏剂和化疗药物的研究。缺点：必须是悬浮生长细胞，成团生长，不分离。多细胞球体生长曲线的测定在显微镜下以测微尺测量20～40个球体的直径，取其平均值，以天数为横坐标，平均直径为纵坐标．获得多细胞球体的生长曲线。生长较慢的肿瘤细胞不适合于球体培养。因它需要较长的培养期，使实验周期延长，而且要消耗大量的培养液。第二节肿瘤的生长和消退

TumorGrowthandRegression正常人体的细胞群根据其功能，可以分为以下几组：1、休止细胞群：没有细胞分裂或DNA成分改变2、增殖不稳定的细胞群：在机体的生命期内不断增殖，但速度渐慢，增殖略大于丢失。3、更新或增殖稳定的细胞群：4、肿瘤细胞群：受自动稳定控制系统的控制：到一定程度细胞增殖就会停止，主要有2种生长控制：

1）直接作用于细胞群，由子代细胞产生的对细胞增殖的反馈作用（接触抑制）

2）作用于细胞周围环境，可以同时对几种细胞群起作用,如激素此外，神经调节、营养、温度等也起一定的调节作用。1、正常组织增殖动力学2、肿瘤细胞群的增殖动力学肿瘤是生物体内按自身规律增殖的细胞群，它的增殖不受机体的正常稳定控制系统约束1）肿瘤内的细胞群分裂细胞：处于周期中的细胞，有一定的细胞周期时间。静止细胞：G0期细胞，保持生长能力。无增殖能力的细胞：从肿瘤治疗角度看已死亡。破碎细胞2）影响肿瘤生长的因素细胞周期（Cellcycle）生长分数（Growthfraction(G.F.)）细胞丢失（Celllossfactor）细胞周期（Cellcycle）某一给定肿瘤的细胞周期变化很大。有些细胞周期很短，有些很长同一类型的肿瘤可以有不同的细胞周期时间增殖慢的可等同于良性肿瘤（benigntumors）增殖快的通常等同于恶性肿瘤（malignancy）在人类肿瘤中，许多研究指出，细胞周期时间在15h到＞100h，平均2.3d

Figure7.1Thenumbersofcelldistributeinthecellcycle生长分数（Growthfraction）细胞群体中有增殖能力的细胞数与细胞总数之比值：在人体GF变化范围很大，直接测定很困难。有点可低于1%。有的较高，在人体大于10%就非常不一般了。肿瘤内常常存在可变动而比例又很高的静止细胞(没有进入细胞周期的细胞)。细胞丢失率（Celllossfactor，Ф

）细胞丢失率（Ф）：意味着从组织中丢失的细胞数。肿瘤的生长速率是细胞增殖与细胞丢失相平衡的结果。多数情况下，肿瘤的生长速率比已知的肿瘤细胞周期时间和生长分数下应有的生长速率慢得多。原因：细胞丢失If

=0,Td=Tpot

whereTdistheactualvolumedoublingtimeandTpotispotentialvolumedoublingtime

=1-Tpot/TdifG.F.=1thenTpot=Tc

Understeadystateconditions,constantcellnumberismaintainedbythebalancebetweencellproliferationandcelllossi.e.

=1.0.Intumors(andembryos)

<1.0有以下几个途径：营养不良性坏死远离血管的细胞；细胞增殖死亡死于免疫打击转移脱落结论：如果细胞周期时间短、生长比例较高、细胞丢失少，那么肿瘤生长较快。肉瘤与癌细胞丢失的不同：肉瘤细胞丢失系数低于癌细胞丢失系数。大剂量照射后，当癌细胞的新生暂时终止或减低时，原有的癌细胞则因其高丢失系数不断死亡并被清除，肿瘤缩小。而肉瘤则不同，由于其丢失系数低，在同样的辐射剂量下，体积缩小慢。尽管从长远看，两种肿瘤的治愈率可能是相同的，而近期内肉瘤则比癌对射线表现出相对的抗性。决定肿瘤生长速度的因素：1）群体中增殖细胞的细胞周期时间；2）生长比例。处于增殖状态的细胞群；3）因细胞死亡或细胞从肿瘤内丢失所致的细胞丢失率。第三节低氧及再氧合

Hypoxic&Reoxygenation

1930-1950Gray,Mottram,Flanders–氧效应1955Thomlinson&Gray–肿瘤条索1960-1965Powers&Tolmach–体内存活曲线ChurchillDavidson-HBOinpatients低氧的研究史分类：慢性乏氧（ChronicHypoxia）O2

扩散距离受限原因：O2

通过呼吸组织受限

(diffusionlimitedhypoxia)肿瘤生长过快超过血供范围，有O2

饥饿区。急性乏氧（Acutehypoxia）血管紊乱和组织间压力血管临时关闭rapidlyre-opentosupplytissueswithO2慢性乏氧

ChronicHypoxia一、乏氧细胞（Hypoxia

cell）氧含量非常低的细胞，对辐射不敏感肿瘤主要由两部分细胞组成。一部分是含氧细胞，对辐射敏感；另一部分是乏氧细胞(10～20%)，对辐射不敏感。肿瘤细胞只是在靠近能从间质获得氧和营养的区域才能增殖和活跃生长。理论计算氧在组织内的扩散距离约150um,考虑到氧的扩散系数和消耗值，实际值约70um。缺氧是肿瘤内坏死的主要因素。在接近坏死区有1～2层细胞，此处细胞氧含量最低。乏氧与肿瘤体积无关联。结论在两个极端之间，有一个氧张力连续下降的现实，可预期有一区域内的细胞处于氧张力高得足以让细胞有形成克隆的能力，但又低得足以保护细胞不受电离辐射的影响。从而，在这个区域的细胞，将因它们的低氧张力而在放射冶疗中受到保护，而且这些细胞又将是提供肿瘤再生长的据点。人体肿瘤内乏氧的事实1、用小鼠肿瘤做模拟的实验已无可争议的证实肿瘤内有乏氧的现象；2、体外组织学观察提示乏氧存在的可能性；3、核素标记的硝基咪唑类化合物(一种定向性的专与乏氧细胞结合的化合物），可被肿瘤内某些细胞结合。4、可用氧探针预测肿瘤内乏氧情况。5、在头颈鳞癌．子宫颈癌、支气管癌．膀胱移行细胞癌中，冶疗前的血红蛋白水平是有力的预后指标。80组织中的急、慢性乏氧81急性乏氧（AcuteHypoxia）肿瘤中的血管网结构异常血管扩张、扭曲、细长并伴有A-V的关闭和或分流。毛细血管的周细胞经常缺失。基膜很薄。二、组织氧合

TissueReoxygenation氧合或再氧合是氧分子结合进细胞内。是物理现象，细胞内的氧浓度可因细胞所处环境而随时改变。氧化则是物质的化学现象，在氧化反应中物质失去电子(或电子偏离J，氧化后元素价升高，物质的化学性能发生改变。意义：改变组织氧合状况，提高临床上对肿瘤放射治疗的治愈率方法：

1、高压氧舱

2、照射同时，于常压下吸入含有95％氧气与5％二氧化碳的混合气体

3、照射前给病人吸入10％氧气的方法

4、采用传递修饰剂（如氟碳乳剂），由于它携带大量的氧，能进入组织的乏氧区后放出氧概念：

分次照射后乏氧细胞变成为氧合细胞的现象。三、乏氧细胞再氧合

HypoxicCell

Reoxygenation再氧合在放射治疗中的重要性乏氧细胞再氧合是临床肿瘤放射治疗中，小剂量分次照射方案制定的重要细胞学基础。理想的最适的分次方案，需要对拟进行照射的特定肿瘤中的再氧合有具体的了解。第四节

肿瘤细胞的剂量－效应曲线

Dose-effectcurveof

tumorcell

正常组织和肿瘤组织均有一个S形的剂量---效应曲线，即在较小剂量时无致死效应，随着剂量增高，致死效应迅速增大；在肿瘤致死效应约80％～90％处的照射剂量能使肿瘤细胞全部被消灭。而此剂量已超过正常组织的耐受量。组织损伤％肿瘤控制％AB百分比050100百分比050100局部肿瘤消除最适并发症无并发症局部控制AB最适并发症无并发症无并发症局部控制肿瘤细胞体内照射的存活曲线体内肿瘤照射后肿瘤细胞的存活曲线是双相性。第一相的存活率主要与肿瘤的有氧细胞有关；第二相的存活率主要与乏氧细胞有关。92SolidSubcutaneousLymphosarcomaTwo-componentcurveExtrapolatingback:SF~1%;implies99%ofcellswerewelloxygenatedlow-doseresponse:killingofaeratedcellsbeginkillinghypoxiccells>9GySolidtumorhasprotectedhypoxiccells(i.e.,clonogenic)normoxiccomponenthypoxiccomponentHypoxicCellFractioninTumorsPairedsurvivalcurvesDistancebetweenindicates%ofhypoxiaTheoretical;whatdoesrealdatalooklike?94HypoxicCellFractioninMouseTumorAircurvemicebreathingairmixtureofhypoxicandaeratedcellsHypoxiccurvemiceasphyxiatedbybreathingN2orcellsirradiatedinvitroinN2OxiccurvecellsinvitroinO2肿瘤细胞的剂量效应曲线—细胞存活曲线线性二次方程（linearquadraticmodel;L-Q）公式1、L-Q公式的定义

S=e－(αD+βD2)

S：存活比例e：自然对数D：分次照射的剂量α、β：系数细胞存活曲线S=e－(αD+βD2)S=e-αD

e-βD2=Sα·Sβ上述公式表明，某一剂量造成的细胞杀伤可由直接致死效应和间接致死效应组成，即α型和β型细胞杀伤。S.F.=e-aDSinglelethalhitsS.F.=e-(aD+bD2)SinglelethalhitsplusaccumulateddamageCellkillistheresultofsinglelethalhitsplusaccumulateddamagefrom2independentsublethaleventsThegeneralizedformulaisE=aD+bD2ForafractionatedregimenE=nd(a+bd)=D(a+bd)Whered=doseperfractionandD=totaldosea/bisdoseatwhichdeathduetosinglelethallesions=deathduetoaccumulationofsublethallesionsi.e.aD=bD2andD=a/binGyS.F.1.00.10.010.001DOSEGya/inGyaDbD2LinearQuadraticModel

ResponsetoFractionationVariesWithTissue16128400.01.11Dose(Gy)S.F.LateRespondingTissues-a/b=2GyAcuteRespondingTissuesa/b=10Gya/bishigh(>6Gy)whensurvivalcurveisalmostexponentialandlow(1-4Gy)whenshoulderiswide2016128400.01.11Dose(Gy)S.F.SingleDoseLateEffectsa/b=2GySingleDoseAcuteEffectsa/b=10GyFractionatedLateEffectsFractionatedAcuteEffectsFractionationspareslaterespondingtissuesFractionationEffects①公式中e-αD产生的生物效应与剂量成正比，表示DNA单击双键断裂，在细胞存活曲线上与剂量表现为线性关系。α表示单击生物效应系数。②公式中e-βD2产生的生物效应与剂量平方成正比，表示DNA多击单键断裂，与可修复的损伤累积有关，存活曲线表现为连续弯曲，β表示多击生物效应系数。细胞存活曲线当单次照射引起上述两种效应相等,α/β值即为两种效应相等时的剂量。

e-αD=e-βD2

α/β=D正常早期反应组织具有较高的α/β值(10Gy左右)，说明直接作用效应相对明显，存活曲线表现的弯曲程度较小。正常晚期反应组织的α/β值较低（约3Gy），表明直接杀伤要比早反应组织少，可修复损伤累积引起的杀伤相对较多.细胞存活曲线细胞存活曲线L-Q公式设计最佳分次照射方案的一般原则⑴为使正常组织的晚期损伤相对低于对肿瘤的杀灭，每次量应低于1.8～2.0Gy；⑵每天照射的分次总剂量应小于4.8～5.0Gy⑶每分次的间隔时间应大于6小时；⑷在不致引起严重急性反应的前提下，尽量缩短总治疗时间；⑸最高总剂量应确定不会引起照射野内正常组织的晚期反应。两周内给予的总剂量不能超过55GyLQ公式对临床放疗的意义：

它把实验室有关细胞和组织分次剂量效应研究的成果和临床放射治疗有机地结合起来、在考虑放疗方案时引入了照射野内的早反应、晚反应组织(含肿瘤组织)对分次剂量和治疗总时间的不同效应的因素，使在提高放疗疗效的基础上更注意对晚反应组织的相应防护。LQ公式在临床应用的局限性（1）目前所用公式是假设在分次照射期间，细胞必须完全修复亚致死损伤，同时没有细胞的增值；这与实际有一定距离；(2）作为LQ公式临床应用的主要参数的α/β比值数据的测定主要来自动物实验，并受诸多因素的影响。因此，可能与实际有一定的距离；（3）该公式目前仅适用于一次剂量为8～10Gy以下的照射。第五节

放射治疗中的分次照射

Timeandfractionationinradiotherapy分次照射类型常规分割治疗（标准治疗）20世纪30年代，以临床实践经验为基础建立：每周5次每次2Gy超分割治疗每日照射次数超过1次，每次照射剂量较常规少。加速治疗:总剂量不增减，整个疗程缩短分段治疗：疗程中间有休息。少分割治疗：每周次数减少，每次剂量增加一、分次照射中的生物因素即分次放疗四个“R”原则：

1、放射损伤的修复(Repair)；

SLD→SLDR:最常见

PLD→PLDR:主要发生于非增殖细胞中，表现为低LET照射后，经过一段时间，细胞存活率增高。晚反应组织比早反应组织修复能力强。

晚反应组织比早反应组织有相对较少的单击损伤（α型损伤）和较多的由SLD累积引起的多击损伤（β型损伤），即早反应组织具有较高的

α/β值，而晚反应组织具有较低的α/β值。早反应与晚反应组织之间

差别的临床意义是分次剂量较大时，对晚反应组织相对有害除了慢性增殖的肿瘤外，用小剂量分割照射较利于治疗。为了获得最大的增强比，必须使晚反应组织完成修复。间隔时间>6h。中子照射时，在低剂量区有较高的RBE。SO:2、细胞再增殖

(Repopulation）1)正常组织（normaltissue）损伤之后，组织的干细胞及子代细胞在机体调节机制作用下，增殖、分化、恢复组织原来形态的过程称做再群体化。

2)肿瘤组织照射后可启动肿瘤内存活的克隆源细胞，使之比照射或用药以前分裂更快，称为加速再群体化。换言之，临床进行分次照