江苏高考生物一轮复习：微难点4 PCR相关问题分析（学生卷）

微瓦点4|

PCR相关问题分析

核心提炼

I.PCR的几个基础问题

（l）PCR中文名称是“聚合酶链式反应”，其最大的特点是体外大量扩增目的DNA,便于后续的基因

表达载体构建或DNA电泳分析等。

（2）主要原理是DNA半保留复制（和DNA热变性），其特异性主要取决于引物设计和扩增条件控制（如

退火温度、Mg2+浓度等）。

（3）基本程序：高温变性一低温复性（退火）一中温延伸。

（4）基本反应体系为：模板（一般为提取的总DNA或总RNA）、dNTP（原料和能量）、耐高温的DNA聚

合酶、特异性引物、缓冲液（含Mg2+）等。

（5）PCR可以用如下反应式表示：

缓冲液

dNTP+模板+引物Mg2+,-/温的BNA聚含二

2"DNA片段

概念辨析

PCR与细胞内DNA复制的主要区别

比较项目PCR细胞内DNA复制

解旋方式高温解旋酶（ATP供能）

解旋结果模板全部解旋局部解旋

场所体外（微量离心管）细胞内（如细胞核、线粒体、叶绿体等）

耐高温的DNA聚合酶（SqDNA聚合

酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等

酶）

引物成分DNA短链一股为RNA短链

原料4种脱氧核昔酸脱氧核甘酸（实际为dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

能量电加热、dNTPATP和dNTP

子链合成

两条子链均连续合成一条链连续（先导链），另一条链不连续

连续性

主要过程变性一好性f延伸解旋f引物合成f子链延伸f恢复螺旋

产物数量aX2\a为起始模板数）一个DNA复制产生2个DNA

温度条件高温一低温一中温温和条件（生物的体温）

复制起

引物复制原点（21）

点的决定

产物的

两引物之间的长度整个DNA

长度

突变率较高较低(存在检验点和复杂的纠错机制等)

2.PCR过程模型

DNA

亦D他N雨A匕人任变性再与合成

样法品性D再N与A合成引物亚稀B瑟通孥」^

引物复性DNA/

引物/

的DNA

第I轮复制第2轮第制第：5轮复制

图形显示一轮循环产生的子锥长度小于互补链的长度，大概率在第三轮循环时，会合成出2个两条脱

氧核甘酸链等长的子代DNA,即第〃轮循环，合成等长的DNA分子数为2"一2〃。(最终30轮循环后大部

分是等长的。)

新视野V

JV,PCR引物

LPCR需要引物的原因

(1)引物是一小段单链DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基互补配对。

(2)原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苜酸加至已有单链的游离3'一羟基上，而不能使脱氧核糖

核伊酸自身发生聚合(即只能催化子链的延伸，而不是让DNA链从无到有)。

(3)细胞内DNA复制一般以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的,

且最终还要被去除。

(4)PCR反应一般以DNA作引物(主要因为RNA不稳定，易降解)。一般通过化学合成法获得。

2.设计引物的主要原则

(1)引物长度应大于16个核甘酸(通常为20〜30个核甘酸)，可防止随机结合。

(2)引物与靶序列间的及(DNA熔解温度)不应过低。

(3)引物内部不应有发夹结构［局部碱基互补)，即不能有4bp以上的【可文序列，否则会失效或特异性降

低，

(4)2个引物间不应有4hp以上的互补序列或同源序列,在T端不应有任何互补的碱基八

(5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。

(6)引物的5'端要设计合适的酶切位点或同源序列，以便构建基因表达载体。

(7)在实时荧光定量PCR时引物还要避免与探针的互补，因为探针是为了与目的DNA内部序列互补的。

3.引物的处理

由于引物延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，引物5'端对扩增特异性影响不大。有时需要

使经PCR扩增的H的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5,端添加不同的限制酶的识别序列，保

证日的基囚定向插入载体并可避免目的基囚自身环化。

4.引物的选择和互补链的判断

DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5,端的碱基与DNA母链3'端

的减基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子锌的合成方向是从引物开始由5'端向3'

端延伸。

举题□法

考向1PCR的过程与引物设计

回1(2023・江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图

I所示。请回答下列问题:

拟构建的390bp注：EGFP荧光蛋白

堪囚构—AnBl纳米抗体

EGFP

咛口片段PCR引物及

II®目的产物片段

I线性质粒

基因重组教体

克隆流程

PCR产物片段与

线性就体混合重嫩够

注：—»表示PCR，；眄;

相同行景方框表示

同源序列

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有,扩增程

序中最主要的不同是

(2)有关基因序列如图2。引物F2—F、Fl—R应在下列选项中选用

EGFV基因序列：5'ATGGTGAGCAAGGGC…

GACGAGCTGTACAAG3；

AnRl基因序列：5'CATGTCCAGCTGCAG…

CCAAAACCACAACCA3'

图2

A.ATGGTG-CAACCA

B.TGGTTG-CACCAT

C.GACGAG-CTGCAG

D.CTGCAG-CTCGTC

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组旃作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。

这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有o

(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有。

A.稀释涂布平板需控制每个平板30〜300个菌落

B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物FI-F和F2-R

进行了PCR扩增，质粒P1〜P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有—。

(6)对于PCR产物电泳垢果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因

度式(2020•江苏卷汝I果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出己知序列两侧的

序列，具体流程如下图所示(以EcoRI酶切为例)。请据图回答问题：

染色体DNA

吧【空睁脸

片段

5’不万余列帝岂知殍列阳未知序丁片段F

II连接|DNA连接施

环状DNA

HI扩增|7的DNA聚合梅

...........................................nPCR产:物

IV测序、分析|

片段F的

53v完整序列

(1)步骤I用的EcoRI是一种,酹，它通过识别特定的切割特定位点。

(2)步骤H用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3'一羟基与5'一磷酸间形成；PCR

循环中，升温到95℃是为了获得；7?用DNA聚合酶的作用是催化。

(3)若下表所列为己知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤HI选用的PCR引物必须是(从

引物①®@④中选择，填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核甘酸序列)

已知5-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3,

।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।।

序列3,-TTGATACGCGAGTACT-CGTTACGCATCGGAGA-5,

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3;

PCR

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3z

引物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3z

④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核

甘酸序列)，结果正确的是o

A.5'-AACTATGCG•••AGCCCTT-3z

B.5'-AATTCCATG…CTGAATT-3'

C.5'-GCAATGCGT…TCGGGAA—3'

D.5'-TTGATACGC-CGAGTAC-3z

审答指导

(1)一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5'端向3'端延伸。

(2)具体操作：①沿着引物的方向确定模板DNA；②确定引物延伸得到的目标DNA：③找到引物与模

板DNA的结合位置；④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从5,端一3'端。

考向2PCR技术中的数量关系

圆2(2011.江苏卷节选)请回答基因工程方面的有关问题：

(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(见下图)。图中引物为首.链DNA片

段，它是了•链合成延伸的基础。

第

一

轮

循

环

理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。

(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(见

下组)，请分别说明理由。

第1组「引物I---------LLLLLI-----------

弓1物CAGGCT

[用物口•-----r-r-T-T-r-i-----------

AGCCrG

第2组J⑼物I'•--------r-T-r-1-n............——

引物’用仙n，AACTGCAGTT

51物II•[1J_II1[[[1--------

CGACTGATTA

①第］组：;

②第2组：。

(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是

因为。

考向3新情境下PCR技术

即3(2024.南通一模)重叠延伸PCR定点突变过程分为两步，如图\o内皮抑素能通过抑制血管内皮细

胞的增殖和血管的生成限制肿瘤细胞的生长。研究人员利用重叠延伸PCR定点突变技术将内皮抑素基因

endo改造为能进入癌细胞并有较强抑癌作用的突变基因endo(ni),并再与抗Her2(人表皮生长因子受体2)

的纳米抗体基因。加形成融合基因。加一e〃曲(〃?)，导入大肠杆菌并表达，主要过程如图2,其中表

示卡那霉素抗性基因，调节基因及4的表达产物能和操纵基因LacO结合抑制基因的表达，IPTG能与Laci

的表达产物结合，诱导FI的基因的表达。请回答下列问题:

欲突变位点

5'一3'

3'-5'

里3,

5'——

-5'

3’开

PCRI

5'=PCR2引物为F2、R2

3'

*3'

5'

5'-6

5'3

3,7%w”6

再*PCR3弓I物为F1、R2

5'4-------------------3'

3'二W*

⑴图1中PCRI和PCR2配制反应体系时需加入不同的o图2中构建重组质粒时使用的限制

酶是o

(2)下列①〜⑥是相关引物，其中突变1F为引物①，则突变IR、突变2F、突变2R分别

为、、O

①5'-GCGGCATGCGGGGCGATCGCGTGACTGCCAGTGCTGTCC-3/

②5'-CCGGAATTCCATATGCGCCGCCG-

CCGCCGCCGCCGCCGCCGC-3z

③5f-GATCGCCCCGCATGCCGCGAGAG-

CCACTGACGAGTCCGC-3'

④5'-GTGGCATGGCTCGGACGCAAACG-

GGCGCAGGCTG-3'

⑤5'-ATTTCTCGAGTTACTTGGAGGC-

AGTCATGAAGCTG-3'

⑥5'-CAGCCTGCGCCCGTTTGCGTCCG-

AGCCATGCCAC-3/

(3)导入重组质粒的大肠杆菌由于调节基因上”的表达产物能和操纵基因Zz/cO结合，阻止酶

的移动，抑制的转录。当菌株扩大培养到一定数量后在培养基中加入,使Dim一

持续表达。

(4)研究表明，乳腺癌常出现Her2基因的高表达(不同乳腺癌细胞的表达有差异)，因此Hcr2被认为是

乳腺癌检测和治疗的重要靶点。研究人员用不同浓度Dim-endo(m)融合蛋白处理乳腺癌细胞SKBR3、

MDA231.MCF7和正常乳腺细胞HBL100作为实验组，选取正常培养的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞作为

对照组，•段时间后分别测定对照组和实验组的细胞数并计算抑制率，结果如下图所示，抑制率的计算公

式是”

Dim—endo(m)融合蛋白对不同乳腺癌细胞的抑制率不同，其可能原因

是______________________________________________________________________________________________

(5)纳米抗体是传统抗体的重链可变区片段，只有传统抗体的1/10,但内部存在更多的二流键，结构更

稳定。与传统抗体相比，纳米抗体的优点是。

大题考向8结合PCR等考查基因工程

典题体睑

即1(2021・江苏卷)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结

合实验流程回答下列问题：

SnuiI

上游同源序列CCCGGG下游同源序列

5-GGATTCTAGA,e而懑而左同丽成的■而而■诃CAAGGTCAAT-3,

S^CCTAAGATCTiTGATCACCTAGGGGGGGdiCCCCTTTTAAATATAAAAiGnCCAGTTA-S'

y---，---------------二二二

'、、、、、经Sma1单酶切

PCR扩增

添加同源序列的m载体A用动手tag序列

—混合

,酶处理URA3Amp

URA3：醉母筛选标ie基因.

((-----缺失该基因醉母无法合成尿喘咤

4〃/:大肠杆菌筛选标记.

氨点青霉素抗性基因

URaAm结合体/〃力lag序列：编码特定氨基酸序列.

林入大肠杆菌可被特异性抗体识别

导入醉母表达

自动flag序列

培养筛选融合lag标签

UR.13Amp

重组质粒Ar〃获得目的菌株的蛋白M

(1)目的基因的扩增

①提取真菌细胞，经逆转录获得cDNA,进一步获得基因〃?片段。

②为了获得融合tag标签的皆白M,设计引物P2时，不能包含基因机终止密码子的编码序列，否则

将导致_________________________

③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除痴/DNA聚合酶(〃同酶似外的各成分混合后，加

热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有o

A.而“能最适催化温度范围为50〜60℃

B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物

C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸

D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酹的特异性

(2)重组质粒的构建

①将SmaI切开的载体A与添加同源序列的小混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以

促进_________________，形成A-m结合体。将A—m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚

合酶及酶等，完成质粒的环化。

②若正确构建的重组质粒A—m仍能被S〃?aI切开，则I的酶切位点可能在o

(3)融合蛋白的表达

①用含有尿喀咤的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-用，然后涂布

于无尿喘嘘的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是o

②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明

后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。

回2(2022.江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成

的作用机制具有重要意义。请回答下列问题:

(1)纤毛结构如图I所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由组成。基体由中心体转变而

来，中心体在有丝分裂中的功能是O

(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了

PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分

离出来，溶液中添加NaCl至2.0mo卜的目的是。PCR扩增时，需在催

化下，在引物的端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。

(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色

荧光，可指示其在细胞内位置。将X-GFQ基因融合片段M导入如图II所示载体质粒Y,构建Y-M重

组质粒(在反oRV位点插入片段)。请完成下表。

r--------------------------------------------------------------1

II

BglII/""QIII-c-cRV丝如H]

：.—L——：

!II-"1"I!

：旃启动子终再：

T/EcoRVBamH1EcoRV

载体质粒YV।物b

■g/11I）|——800bp——1-700bp-

0Q?”勿引物c-

X-G”P基因融合片段M

图n

限制的识别序列

HamH1G*GATCC

EcoRVGAT'ATC

HindIIIA*A（；CTT

BgZIIA*GATCT

序列编号Y-M连接处测序后部分序列

QI5f-A（；ATCTCC（；ATATT-3r