（正式版）DB51∕T 2905-2022 《猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范》

DB51TechnicalspecificationforisolationandidentI 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 5 6 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定4缩略语DNAmarker：DNA相对分子质量5.1主要试剂25.2主要仪器设备稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5mL~1mL，并将水泡液装入保存管，用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮2g~5g，装存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，不能立即使用应置于-70℃冷冻保装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，不能立即使用即放SVA分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照G3按常规方法将PK-15细胞分装在25cm2细胞培养瓶浓度应为2×105个/mL~3×105个/mL，培养48h。，37℃、5%CO2条接种2瓶~4瓶细胞，另设细胞对照2瓶~4瓶。液面，最后溶解脱落。对照细胞单层应完好，细胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞若接种细胞第1代72h后未出现明显CPE，按上述收毒方法收获细胞/病毒液再接种生长良好的单层PK-15细胞进行盲传，即1mL第一代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37°C培养。如此盲传3代~5代，再进行RT-LAMP和RT-PCR引物针对SVAVP1蛋白基因保守区域，引物取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20反应体系中各组分见表2，反应体系可根据表中各组分比例4体积(µL）BstDNA聚合酶缓冲液BstDNA聚合酶12221反应体系见表3，反应体系可根据表中各组分比体积(µL）5131159结果判定9.1RT-LAMP阳性对照出现1条梯状条带并发出绿色荧光，阴性对照无条带不显色，结果出现与阳性对照一致条带，且显色反应样品管发出绿色荧光，判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果无条带，显色反应样品管无绿色荧光变化，判定为9.2RT-PCR出现与阳性对照大小一致的特异性扩增条带，则判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果未出现特异性扩9.3病毒分离鉴定进行RT-LAMP或RT-PCR核酸鉴定，若8.1或8.2鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，SVA分离鉴定阳性；若8.1或8.2鉴定结果变为阴性，则判定为6NaClNa2HPO4∙12H2ONaOH或者HCl调pH值7.0~7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121℃、15min高0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳A.31.0%琼脂糖凝胶板制备0.5ug/mLGoldView微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。7猪A型塞内卡病毒VP1蛋白基因LAMP和RT-PCR扩CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGGACGCCGTCTTCCCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCCGCTTCCCGACCCGCTACTCGTTTCGGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTTACAGTTTGGCCTGTTTCACTTACTTTAGATCAGACCTTGA