（正式版）DB51∕T 1843-2014 《猪A群轮状簿R∕T-PCR检测技术规范》

猪A群轮状病毒RT-PCR检测技术规范2014-10-01实施2014-10-01实施四川省质量技术监督局发布I 鼾、手JOdL 本标准的附录A为规范性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：西南民族大学。本标准主要起草人：任玉鹏、岳华、汤承、张斌、张焕容、杨发龙、王远微。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。《兽医实验室生物安全技术管理规范》(2003农业部公告第302号)猪轮状病毒(porcinerotavirus,PRV)是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，基因组由11个节段的双4设备和试剂4.1.1PCR扩增仪4.1.5微量高速离心机(适合于对PCR反应管进行离心操作)24.1.9移液器(0.1μL～2.5μL、0.1μL～10μL、20μL～200μL、200μL～1000μL)4.2.1引物(10μmol/L)P1:5'-TCAAGCACGATTTGP2:5'-GCCTGGTGGAAATACT扩增片段长度274bp。4.2.32mol/L醋酸钠溶液(pH4.0):见附录A.2。4.2.5氯仿/异戊醇(49/1)混合溶液。4.2.6PrimescriptTMR4.2.7TaqDNA聚合酶(5U/μL)。4.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.3。4.2.950×TAE缓冲液：见附录A.4。4.2.10核酸染料(Gold4.2.12异丙醇。4.2.13DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.6。4.2.166×上样缓冲液(6×LoadingBuffer)。4.2.18水：所用水应符合GB/T6682中三级水(三蒸水)规格。4.2.19阳性对照：猪A群轮状病毒4.2.20阴性对照：用符合GB/T6682中的三级水代替RT-PCR扩增模板。5RNA提取5.1.1肠内容物：选择疑似病症的猪只，无菌采集小肠内容物1g,用10mmol/LPBS缓冲液稀释10倍；在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融2次，10000r/min离心10min,取上清液备用。5.1.2肛门拭子：将肛门拭子等棉拭子浸入1mL的10mmol/LPBS缓冲液中30min,充分混匀后反复冻融2次，12000r/min离心10min,取上清液备用。5.1.3腹泻粪便：采集病猪新腹泻粪便1g,用10mmol/LPBS缓冲液将粪便稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融2次，10000r/min离心10min,取上清液备用。35.2.2取处理后待检样品上清液100μL,加入变性液300μL颠倒混匀，加入30μL2mol/L乙酸钠(pH值4.0)。反复颠倒离心管5次，在25℃的室温下放置5min。12000r/min、4℃离心5.2.3依次加入150μL饱和酚、150μL氯仿-异戊醇，反复颠倒混匀5次，冰浴15min。5.2.412000r/min、4℃离心20m5.2.5加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置10min沉淀RNA。解，在-20℃条件下保存备用。6.2cDNA的合成体系为10μL:5×PrimescriptTMBuffer2.0μL,PrimescriptTMRTEnzymeMix 聚合酶(5U/μL)0.125μL、引物P1(10μmol/L)1μL、引物P2(10μmol/L)1μL、ddH2014.375μL、模板cDNA2μL,总体系25μL。7.2PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃30s,51℃30s,72℃30s的循环，进行35个循环，最后72℃延伸8min,4℃保存。8.1用TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶(见附录A)。9.1阳性对照出现一条274bp大小的条带，且阴性对照样本不出现条带。9.2在满足10.1条件下，被检样品的PCR产物经电泳后出现一条约274bp的条带判定为核酸阳性(+);被检样品的PCR产物经电泳后不出现274bp的条带判定为核酸阴性(-)。45(规范性附录)相关试剂的配制将250g异硫氰酸胍、17.6mL0.75十二烷基肌酸钠溶293mL水中。65℃搅拌混匀，溶解充分。室温下保存，使用前按每50mL变性液加0.36mL14.4在100mL容量瓶中，加入16.4g乙酸钠，加入适量灭菌双蒸水，用冰乙酸调pH至4.0后定容。A.32%琼脂糖凝胶的配制用琼脂糖1.0g,1×TAE电泳缓冲液100mL,混匀后在微波炉中完全融化，待冷却至50℃~60℃18.61g,加入适量灭菌双蒸水，用氢氧化钠调pH至8.0时定容。A.4.2TAE电泳缓冲液(50×)配制羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)10