甾体激素类药物的分析专家讲座

第十章甾体激素类药品分析

Analysisofsteroidhormones

第1页激素（Hormone，荷尔蒙）是人体内各种内分泌腺所分泌一个生物活性物质。激素作用于特定称为靶器官组织、细胞上而发挥作用。假如激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等。第2页ABCD12345678910111213141516171819

基本结构

概述甾体激素类药品均含有环戊烷骈多氢菲母核。第3页

分类甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白同化激素第4页

（一）肾上腺皮质激素△4–3–酮基（紫外吸收）天然皮质激素：氢化可松

母核有21个碳原子C17–醇酮基（还原性）第5页醋酸地塞米松结构修饰曲安息龙地塞米松磷酸钠提升结构稳定性增强抗炎作用第6页（二）雄性激素和蛋白同化激素

天然雄性激素：睾酮

△4–3–酮基4位引入卤素或19位去甲基或将A环结构改造均显著降低雄性作用，增加蛋白同化作用

母核有19个碳原子

A环中有△4–3–酮基结构第7页结构修饰增加脂溶性，制成油注射剂可口服、延效丙酸睾酮甲睾酮增加位阻，难代谢氧化，稳定性增强可口服第8页蛋白同化激素苯丙酸诺龙4-氯醋酸睾丸素

母核有18或19个碳原子第9页（三）孕激素C17-

-甲酮基△4–3–酮基天然孕激素：黄体酮

母核有21个碳原子

口服被快速破坏失效，只能肌注第10页结构修饰醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）炔诺孕酮（睾酮类孕激素）炔诺酮（睾酮类孕激素）口服、长期有效口服、长期有效，17-OH作成庚酸酯，注射一次可维持3个月第11页（四）雌激素

天然雌性激素：雌二醇

母核有18个碳原子

A环为苯环，C3位上有酚羟基，C17位上有β-羟基

结构不稳定，口服无效第12页结构修饰

炔雌醇

戊酸雌二醇

苯甲酸雌二醇乙炔基引入，使仲醇变叔醇，增加空间位阻，妨碍酶对药品氧化代谢，可口服17位羟基酯化，酯在体内迟缓水解，延效3位羟基酯化，酯在体内迟缓水解，延效可口服高效长期有效第13页人工合成代用具：非甾体化合物己烯雌二酚高效、长期有效第14页△4–3–酮C17–α–醇酮基C17–β–羟基C17–甲酮基A环为3–OH苯环肾上腺皮质激素++雄性与蛋白同化激素++雌性激素++孕激素++判别反应UV、羰基试剂、氨基脲反应还原性（碱性酒石酸酮、氨制AgNO3）可成酯与亚硝基铁氰化钠、间二硝基苯反应UV、与重氮苯磺酸盐反应二、特殊官能团与分析方法第15页第二节判别试验一、物理常数测定二、化学判别法三、制备衍生物测定熔点四、紫外分光光度法五、红外分光光度六、薄层色谱法七、高效液相色谱法第16页第二节判别试验二、化学判别法（一）呈色反应（1）与强酸呈色反应强酸：

H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与HSO4-作用呈色。第17页显色荧光加水稀释氢化可松棕黄色至红色绿色黄色至橙黄色炔雌醇橙红黄绿玫红絮状↓炔雌醚橙红黄绿红色↓泼尼松黄→橙—黄色渐变蓝绿色泼尼松龙深红—灰色絮状↓地塞米松淡红棕色—颜色消失苯甲酸雌二醇黄绿色蓝色淡橙色与硫酸显色反应第18页1、C3–酮基和C20–酮基（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼反应生成腙。(2)官能团呈色反应（2）与羟胺或氨基脲分别生成含有一定熔点肟或缩氨脲。第19页+HCl黄色3，20-双腙室温下长时间加热第20页结论：成腙反应中

C20–酮基受C18甲基空间位阻影响，反应较慢，需加热或较长时间放置，才完成反应。

C11–酮基受C18、C19位甲基甲基妨碍，不发生反应。

C3–酮基空间位阻最小，最易起反应，室温下先生成单腙。第21页2、C17–α–醇酮基呈色反应（还原性）

能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色。其中以四氮唑盐显色反应最为惯用，不但可用作层析法显色剂，还可用于含量测定.

适用：肾上腺皮质激素。第22页＋2Cu2++4OH-+Cu2O+H2O橙红色＋2Ag++2OH-+2Ag+CH3COOH黑色醋酸去氧皮质酮第23页+H2O+CH3COOH++OH-醋酸泼尼松深红色三苯甲鐕四氮唑盐第24页结论：

三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色法测含量。

四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药品中杂质“相关物质”检验显色剂。

反应在碱性条件下（水解）进行。第25页

适用：含有甲酮基或活泼亚甲基甾体激素类药品。3.甲酮基呈色反应

能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色。孕激素（1）甲酮基：黄体酮专属性反应。黄体酮其它甾体亚硝基铁氰化钠蓝紫色淡橙色或不显色第26页结论：

在碱性条件下进行。

与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应。（2）亚甲基反应：硫酸普拉睾酮

乙醇间二硝基苯氢氧化钠紫红色第27页

适用：雌激素类药品。4.酚羟基呈色反应

能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料。苯甲酸雌二醇H++红色第28页有机氟Fˉ有机破坏有机氯5、卤元素呈色反应茜素氟蓝—硝酸亚铈硝酸—硝酸银呈蓝紫色

ClˉAgCl氯原子结合在母核环上第29页6、沉淀反应（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）沉淀反应（2）氨制AgNO3（多伦试液）沉淀反应（3）与AgNO3沉淀反应

适用：含炔基甾体激素类药品（炔雌醇、炔诺酮）。

机理：↓HNO3++NaOH滴定，电位法指示终点第30页（4）与HNO3-AgNO3沉淀反应

适用：甾体激素类药品C21位上有氯原子取代，如丙酸氯倍他索。

机理：有机氯原子水解加热无机氯原子结合在母核环上氯原子氧瓶燃烧法破坏无机氯原子硝酸—硝酸银AgCl第31页

原理：一些甾体激素类药品含有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯结构，可先行水解，依据水解产物来判别。7、水解产物反应

适用：本类药品C3、C17或C21位上羟基酯

结果：醋酸酯水解后生成醋酸可与乙醇反应，生成有香气醋酸乙酯。

戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭戊酸或己酸，进行判别。第32页三、制备衍生物测熔点（二）酯水解醇制KOH

水解m.p.为150℃~156℃（一）酯生成+KOH丙酸睾丸素睾丸素m.p.为201℃+第33页m.p.约182℃（分解）（三）缩氨基脲生成苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨脲H2NCONHNH2（四）酮肟生成炔诺酮HONH2炔诺酮肟m.p.约195℃（分解）醋酸泼尼松第34页△４-3-酮（五）UV-ViS分光光度法240nm左右280nm左右苯环其它共轭结构原理200-760nm有特征吸收。方法可要求最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小。第35页

示例曲安息龙丙酸倍氯米松溶剂甲醇乙醇浓度20μg/ml20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为0.57～0.60，在239nm与263nm处吸收度比值为2.25～2.45第36页结构特征：酚羟基

C17–OHC17–乙炔基eg1:炔雌醇（六）IR法原料药第37页1505cm-13505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环骨架振动第38页eg2：黄体酮△４-3-酮结构特征：C17-酮基第39页1700cm-1

C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1

C-H双键第40页七、TLC法八、HPLC应用甾体激素类药品原料与制剂判别甾体激素类药品原料与制剂判别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）方法对照品法对照品法结果判断要求供试品溶液所显主斑点颜色和位置与对照品溶液主斑点相同要求在含量测定项下统计色谱图中，供试品峰tR与对照品峰tR一致第41页第三节特殊杂质检验

杂质起源：原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂和溶剂。一、相关物质检验

其它甾体：有些杂质与该甾体激素药品结构类似，也含有一定药理作用而又互不相同，所以在甾体激素类药品质量控制中，“其它甾体”程度检验显得很主要。第42页检验方法：（含有一定分离能力）判定方法：要求杂质斑点数目要求杂质斑点颜色1、TLC法（本身对照法）eg：氢化可松中其它甾体检验供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1）浓度：3.0mg/ml

对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1）60μg/ml

层析：供试液对照液点样、展开、斑点检出。判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液主斑点比较，不得更深。第43页2、HPLC法（本身对照法）≤图A中峰1面积四分之三判定方法：要求杂质峰数目要求杂质峰面积第44页二、游离磷酸盐检验

方法：对照品比色法

杂质起源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯化时残余过量磷酸盐。

结果判断：供试品溶液吸光度不得大于对照溶液吸光度。740nm

原理：供试液+钼酸铵+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸钼蓝第45页三、有机溶剂残留量检验eg：地塞米松磷酸钠

方法：GC色谱法

杂质起源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量甲醇和丙酮。

结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％丙酮要求不得过≤5.0%第46页四、硒检验氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定

杂质起源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激素类药品，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺，药品可能引入杂质硒。

方法：药品

结果判断：供试品溶液吸光度不得大于硒对照溶液吸光度（0.005％～0.01％）

。378nm五、雌酮六、乙炔基第47页第四节含量测定

惯用方法容量法比色法紫外分光光度法荧光法气相色谱法高效液相色谱四氮唑盐比色法异烟肼比色法铁-酚试剂比色法第48页一、HPLC法USP、BP、JP均采取方法：RP－HPLC（内标法）

测定对象：甾体激素类药品原料和制剂。eg：黄体酮含量测定

色谱条件：固定相ODS，检测波长254nm

流动相甲醇-水（65:35）内标物己烯雌酚系统适用性试验：n>1000，R符合要求。

第49页测定样品：黄体酮原料、注射液。

定量方法：内标法内标-1第50页二、UV-ViS分光光度法1、△４-3-酮240nm（±）2、苯环280nm（±）雌激素肾上腺皮质激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素（一）UV分光光度法缺点：专属性不强第51页示例：醋酸地塞米松片含量均匀度检验（1）配制供试液，取10片分别进行测定

（2）测定：240nm

（3）计算

第52页（二）比色法有色甲瓒四氮唑盐醇酮基-a-17COH-1、四氮唑盐比色法（1）原理：肾上腺皮质激素类C17-α－醇酮基强还原性。[H]氯化三苯四氮唑（TTC）三苯甲瓒↓深红第53页蓝四氮唑（BT）525nm第54页25℃氢氧化四甲基铵对照液供试液ATTC40～45′暗（2）方法：对照品法（3）影响原因A.基团对反应速度影响C11=O＞C11－OHC21－OH未酯化＞C21-OH酯化第55页B、溶剂和水分影响

以无水乙醇为溶剂，水含量大时，呈色减慢，不超出5％对结果没有影响。C、O2与光线影响避光、隔绝空气、快速、充N2D、碱种类及加入次序以氢氧化四甲基铵结果最正确加入次序：皮质激素溶液四氮唑盐碱试液第56页E.温度与时间室温（25℃）反应40～45minF.干扰物影响

油膏、冷霜等制剂含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂对BT显色反应有干扰，要先分离后测定。第57页（1）原理异烟腙（黄）HCl420nm2、异烟肼比色法C3-酮基+异烟肼H2O肾上腺皮质激素雄性激素蛋白同化激素孕激素第58页（2）方法：对照品法60℃异烟肼无水甲醇对照液供试液A暗60′第59页（3）影响原因A.反应速度（反应专属性）C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应B.溶剂选择异烟肼盐酸盐→受溶解度影响无水甲醇无水乙醇对试剂稳定性好呈色强度较无水乙醇中高对植物油溶解度小第60页C.水分、温度、O2