探秘H7N9大流行流感疫苗：Vero细胞高产毒株特性与制备工艺解析

探秘H7N9大流行流感疫苗：Vero细胞高产毒株特性与制备工艺解析一、引言1.1H7N9流感病毒的危害与流行现状自2013年3月底，H7N9型禽流感在上海和安徽两地首次被发现以来，这种新型甲型流感病毒便迅速进入了人们的视野。其作为一种新型三重重配体病毒，大部分病例的感染途径为直接或间接暴露于受感染活禽或带毒禽类污染的环境。H7N9流感病毒对人类健康构成了严重威胁。感染该病毒后，肺炎是主要临床表现，患者病情发展极为迅速，常常快速进展为急性呼吸窘迫综合征、感染性休克和多器官功能障碍综合征。大部分患者的症状较为严重，仅有少数表现为轻症。而且H7N9病例早期发病无特异性表现，这给早期诊断带来了困难，后期重症病例治疗效果差，病死率高，对患者的生命健康造成了极大的挑战。在传播范围上，H7N9流感病毒不断扩散。2013年4月4日21时，上海新增4宗确诊人感染H7N9禽流感病例，上海共6宗患者中已有4宗死亡，另两名患者中有1名4岁患儿。4月5日，江苏省确诊2例人感染H7N9禽流感病例，浙江省湖州市1例人感染H7N9禽流感患者死亡。截至2013年10月31日，我国内地共报告136例人感染H7N9禽流感确诊病例，病例分布于12省市的42个地市。此后，在多个流感季中，H7N9禽流感疫情时有发生，呈现出一定的季节性和地域性特点。H7N9流感病毒的出现，也给经济和社会带来了冲击。在经济方面，禽类养殖业首当其冲，遭受了巨大的经济损失。大量禽类被扑杀，市场消费信心受挫，禽类产品的销售受到严重影响，产业链上下游相关企业均受到波及。在社会层面，由于其高致病性和传播的不确定性，容易引发公众的恐慌情绪，对社会的稳定和正常生活秩序造成干扰。H7N9流感病毒自出现以来，凭借其快速的传播能力、严重的致病性以及对经济社会的负面影响，已然成为公共卫生领域的重大挑战。1.2流感疫苗的重要性流感疫苗作为预防流感的关键手段，在公共卫生领域发挥着不可或缺的作用。在预防流感大流行方面，流感病毒具有高度的变异性，每年可导致全球约300万至500万人感染，其中约29万至65万人需要住院治疗。一旦新型流感病毒出现并引发大流行，后果不堪设想。接种流感疫苗能够刺激人体免疫系统产生针对流感病毒的抗体，有效降低流感发病率，减少重症和死亡风险，从而为预防流感大流行筑牢防线。高危人群，如老年人、孕妇、慢性病患者等，感染流感后出现严重并发症的风险较高。老年人的免疫系统功能逐渐衰退，对病毒的抵抗力较弱；孕妇在怀孕期间身体的生理状态发生变化，免疫系统也会受到一定影响；慢性病患者由于基础疾病的存在，身体机能较差，感染流感后容易引发肺炎、心脏疾病等严重并发症。流感疫苗对于这些高危人群尤为重要，能够显著降低他们感染流感后的发病风险和并发症的严重程度，保护他们的生命健康。流感疫情的爆发往往会导致医疗资源紧张，医疗机构的接诊压力增大。大量流感患者涌入医院，使得医疗资源，如床位、药品、医护人员等，面临巨大的挑战。流感疫苗的应用可以有效减少流感病例的数量，从而减轻医疗机构的接诊压力，降低医疗费用，使医疗资源得到更合理的分配，提高公共卫生服务水平，让有限的医疗资源能够更好地服务于其他有需要的患者。1.3Vero细胞用于流感疫苗生产的优势在流感疫苗的生产历程中，细胞基质的选择对疫苗的质量、产量和安全性起着决定性作用。Vero细胞作为一种被广泛应用的细胞基质，具有诸多显著优势，使其在流感疫苗生产领域脱颖而出。Vero细胞的生长速度极为迅速，其倍增时间约为24小时，这一特性使其能够在短时间内实现大规模扩增。在流感疫苗生产中，快速的细胞生长意味着可以在更短的时间内获得大量的细胞用于病毒培养，从而显著提高疫苗的生产效率，满足市场对流感疫苗的大量需求。相较于其他一些生长缓慢的细胞系，Vero细胞的这一优势极大地缩短了疫苗的生产周期，为应对流感疫情的突发和季节性流感的预防提供了有力支持。遗传稳定性是Vero细胞的另一大优势。在细胞繁殖过程中，Vero细胞不易发生变异，能够保持稳定的遗传特性。这一特性对于流感疫苗生产至关重要，它保证了疫苗生产的一致性和稳定性。每一批次生产的疫苗都能够保持相似的质量和免疫原性，避免了因细胞变异而导致的疫苗质量波动。在疫苗生产过程中，稳定的细胞遗传特性使得生产工艺易于控制和标准化，从而提高了疫苗的安全性和有效性，增强了公众对流感疫苗的信任。Vero细胞对多种生物制剂敏感，这使得它能够适应不同类型流感病毒的培养需求。无论是甲型流感病毒还是乙型流感病毒，Vero细胞都能为其提供良好的生长环境，促进病毒的有效复制。在应对流感病毒的高度变异性时，Vero细胞的这种广泛适应性显得尤为重要。当新的流感病毒亚型出现时，Vero细胞能够迅速适应并用于培养新型病毒，为研发针对新病毒的疫苗提供了可能，有助于快速应对流感疫情的变化。Vero细胞来源方便，容易建立细胞库和保存，并且可以连续传代。这为流感疫苗的持续生产提供了便利条件，降低了生产成本。同时，Vero细胞在微载体表面能良好地贴附生长，易在生物反应器中进行放大培养，这使得大规模工业化生产流感疫苗成为现实，进一步提高了疫苗的产量，满足全球范围内对流感疫苗的需求。1.4研究目的与意义本研究聚焦于H7N9大流行流感疫苗Vero细胞高产毒株，旨在深入探究其生物学特性，并优化制备工艺，解决流感病毒在Vero细胞上产量不稳定的问题，为流感疫苗的高效生产提供技术支持。同时，通过对高产毒株的研究，研发具有自主知识产权的Vero细胞H7N9大流行流感疫苗，提高我国在流感疫苗研发和生产领域的自主创新能力，增强应对流感大流行的能力，对防控流感大流行具有重要的现实意义。二、H7N9流感病毒Vero细胞高产株的构建2.1反向遗传学技术原理反向遗传学技术作为现代病毒学研究的重要手段，在流感病毒研究领域发挥着关键作用。与传统遗传学从表型到基因的研究路径不同，反向遗传学是从生物的遗传物质入手，直接在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造。对于流感病毒而言，其基因组由8个节段的单股负链RNA组成。反向遗传学技术通过构建流感病毒的感染性cDNA分子克隆，利用碱基突变、缺失、插入和互补等手段对病毒基因组进行体外操作。具体来说，首先提取流感病毒的RNA，然后通过反转录得到cDNA。将这些cDNA分别克隆到特定的载体中，构建成重组质粒。这些重组质粒包含了流感病毒的全部基因信息。在拯救病毒阶段，将构建好的重组质粒共转染到合适的细胞中，如293T细胞、MDCK细胞等。细胞内的转录和翻译机制会以这些重组质粒为模板，合成流感病毒的RNA和蛋白质，进而组装成具有感染性的流感病毒粒子。通过这种方式，研究者可以精确地控制病毒的基因组成，从而研究病毒基因的功能、表达调控机制以及病毒致病的分子机理。在流感疫苗研发中，反向遗传学技术能够快速生成基因修饰的疫苗候选株。通过将编码流感病毒表面抗原（如血凝素HA和神经氨酸酶NA）的基因与具有高产特性的病毒株内部基因进行重配，可以获得高产且免疫原性良好的流感病毒株，为流感疫苗的高效生产奠定基础。2.2遗传重配实验设计2.2.1实验材料准备实验所需的细胞为Vero细胞，来源于中国典型培养物保藏中心，它作为病毒培养的宿主细胞，为病毒的生长和繁殖提供适宜的环境。293T细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），在病毒拯救过程中发挥关键作用，用于重组质粒的转染，以产生具有感染性的病毒粒子。病毒材料包括A/Anhui/1/2013（H7N9），从安徽感染患者样本中分离得到，此病毒株携带H7N9的表面抗原基因，是遗传重配的重要基因供体。A/Kunming/1/2005Va（H3N2），从昆明地区流感患者中分离，作为母本株提供内部基因，其内部基因有助于提高病毒在Vero细胞上的生长特性。实验试剂涵盖RNA提取试剂盒（Qiagen公司产品），用于从病毒样本中高效提取RNA，其先进的裂解和纯化技术能保证RNA的完整性和纯度。反转录试剂盒（ThermoFisherScientific公司产品），可将提取的RNA反转录为cDNA，为后续的基因操作提供模板。高保真DNA聚合酶（NewEnglandBiolabs公司产品），在PCR扩增过程中，以其高保真特性确保扩增的基因片段准确性，减少碱基错配的发生。限制性内切酶（NewEnglandBiolabs公司提供多种类型），用于切割DNA片段，以便进行基因重组操作，其特异性的识别和切割位点保证了基因重组的精确性。T4DNA连接酶（ThermoFisherScientific公司产品），能够将切割后的DNA片段连接起来，实现基因的重组。Lipofectamine2000转染试剂（Invitrogen公司产品），在细胞转染过程中，可有效将重组质粒导入细胞，提高转染效率。仪器方面，PCR仪（Bio-Rad公司产品）用于基因扩增，其精确的温度控制和快速的升降温速度，保证了PCR反应的高效进行。高速离心机（Eppendorf公司产品），可用于核酸和蛋白质的分离与纯化，通过高速旋转产生的强大离心力，实现不同物质的有效分离。二氧化碳培养箱（ThermoFisherScientific公司产品），为细胞培养提供稳定的温度、湿度和二氧化碳浓度环境，满足细胞生长的需求。酶标仪（BioTek公司产品）用于检测病毒滴度和抗原含量，通过测量吸光度等参数，准确评估病毒的生长情况和疫苗的质量。2.2.2基因重配方法首先进行病毒RNA的提取，使用RNA提取试剂盒，按照其说明书操作，从A/Anhui/1/2013（H7N9）病毒样本中提取总RNA。在提取过程中，通过裂解液迅速裂解病毒颗粒，释放出RNA，然后利用硅胶膜吸附RNA，经过多次洗涤去除杂质，最终得到高纯度的病毒RNA。将提取的RNA反转录为cDNA，采用反转录试剂盒，在反应体系中加入RNA模板、随机引物、反转录酶、dNTP等成分，在适宜的温度条件下进行反转录反应，合成cDNA。反转录过程中，反转录酶以RNA为模板，按照碱基互补配对原则合成cDNA，为后续的基因扩增提供模板。以反转录得到的cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增H7N9的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因。设计特异性引物，引物的设计依据H7N9的HA和NA基因序列，确保能够准确扩增出目的基因片段。PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、高保真DNA聚合酶和缓冲液等，在PCR仪中进行扩增反应。反应过程经过变性、退火、延伸等多个循环，使目的基因片段得以大量扩增。将扩增得到的HA和NA基因片段与经过限制性内切酶酶切处理的A/Kunming/1/2005Va（H3N2）母本株内部基因表达载体进行连接。使用限制性内切酶切割表达载体，使其产生与HA和NA基因片段互补的粘性末端，然后在T4DNA连接酶的作用下，将基因片段与载体连接起来，构建重组质粒。连接反应体系包括基因片段、载体、T4DNA连接酶和缓冲液等，在适宜的温度下进行连接反应，形成重组表达载体。将构建好的重组质粒利用Lipofectamine2000转染试剂共转染至293T细胞中。在转染前，将293T细胞培养至对数生长期，使其处于良好的生长状态。然后按照Lipofectamine2000转染试剂的说明书，将重组质粒与转染试剂混合，形成复合物，再将复合物加入到293T细胞中，使重组质粒进入细胞。转染后的细胞在二氧化碳培养箱中培养，培养条件为37℃、5%CO2，培养一段时间后，细胞内的转录和翻译机制会以重组质粒为模板，合成流感病毒的RNA和蛋白质，进而组装成具有感染性的流感病毒粒子。收集转染后细胞的上清液，接种至Vero细胞中进行培养。将收集到的上清液加入到已经长满单层的Vero细胞培养瓶中，在二氧化碳培养箱中继续培养，使病毒在Vero细胞中进一步繁殖和扩增。培养过程中，定期观察细胞病变效应（CPE），当细胞出现明显的病变，如细胞变圆、脱落等，收获病毒液。通过空斑实验、血凝实验等方法对重配后的病毒进行鉴定和滴定，确定其生物学特性和病毒滴度，筛选出高产毒株。2.3重配株的筛选与鉴定2.3.1筛选方法与指标将重配后的病毒液进行系列稀释，每个稀释度接种多个长满单层Vero细胞的96孔细胞培养板，每孔接种100μL病毒稀释液，设置3个复孔。同时设置正常细胞对照孔，加入等量的细胞维持液。将接种后的96孔板置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中孵育1小时，使病毒充分吸附到细胞上。然后吸弃孔内液体，每孔加入含2μg/mLTPCK-胰酶的细胞维持液200μL，继续培养。在培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞病变效应（CPE），记录出现CPE的孔数。当细胞病变达到一定程度，如50%以上的细胞出现变圆、脱落等病变时，判定为阳性孔。采用Reed-Muench法计算50%组织细胞感染量（TCID50），公式为lgTCID50=L+d（s-0.5），其中L为病毒最低稀释度的对数，d为稀释系数，s为CPE阳性孔比率总和。病毒滴度越高，说明病毒在Vero细胞中的生长繁殖能力越强，越有可能是高产毒株。同时，采用血凝试验测定病毒的血凝效价。取96孔V型微量反应板，每孔加入50μL生理盐水。在第一孔中加入50μL病毒液，充分混匀后，吸取50μL转移至第二孔，依次进行倍比稀释，直至最后一孔。然后每孔加入50μL1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置45分钟后观察结果。以出现完全血凝的病毒最高稀释度作为该病毒的血凝效价，血凝效价越高，表明病毒表面的血凝素含量越高，病毒的活性和感染性越强。通过综合比较不同重配病毒株的病毒滴度和血凝效价，筛选出在Vero细胞上具有高产特性的重配株。2.3.2毒株型别鉴定实验采用RT-PCR技术对筛选出的重配毒株进行型别鉴定。首先提取重配毒株的RNA，使用RNA提取试剂盒，按照说明书操作进行提取。将提取的RNA反转录为cDNA，采用反转录试剂盒进行反转录反应。根据H7N9和H3N2病毒的基因序列，设计特异性引物。H7N9的HA基因上游引物序列为5’-ATGAGCAAAAGCAGG-3’，下游引物序列为5’-TTACTTCTGGGTAGAA-3’；NA基因上游引物序列为5’-ATGAGCTTCTTTAGC-3’，下游引物序列为5’-TTACTGCTGCTGCTG-3’。H3N2的内部基因引物根据具体基因进行设计，确保引物的特异性和扩增效率。在PCR反应体系中，加入cDNA模板、上下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等成分。反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增结束后，取5μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。在电泳结果中，若出现与预期大小相符的特异性条带，则表明该重配毒株含有相应的基因片段。对RT-PCR扩增得到的基因片段进行测序。将PCR产物送往专业的测序公司进行测序，得到基因的核苷酸序列。将测序结果与GenBank中已公布的H7N9和H3N2病毒的基因序列进行比对分析，使用BLAST软件进行序列比对。通过比对，可以确定重配毒株的基因来源和型别，判断是否为预期的H7N9与H3N2基因重配毒株。三、Vero细胞高产重配株(H7N9Va)的生物学特性3.1生长特性研究3.1.1病毒培养条件优化为了探究不同接种量对病毒生长的影响，将H7N9Va病毒分别以0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI和1MOI的接种量接种至长满单层的Vero细胞培养瓶中，每个接种量设置3个重复。接种后，将培养瓶置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中孵育1小时，使病毒充分吸附到细胞上。然后吸弃孔内液体，每瓶加入含2μg/mLTPCK-胰酶的细胞维持液，继续培养。在培养过程中，每天定时观察细胞病变效应（CPE），并在接种后的24小时、48小时、72小时和96小时分别收集病毒液，采用Reed-Muench法测定病毒滴度（TCID50）。实验结果显示，当接种量为0.01MOI时，病毒在72小时时的滴度达到最高，为7.5lgTCID50/mL，且CPE明显，细胞病变均匀。而接种量为0.001MOI时，病毒生长缓慢，96小时时滴度仅为6.0lgTCID50/mL；接种量为0.1MOI和1MOI时，虽然病毒在早期生长较快，但细胞病变过于迅速，导致病毒产量在后期下降，96小时时滴度分别为7.0lgTCID50/mL和6.5lgTCID50/mL。综合考虑病毒生长速度和产量，确定0.01MOI为最佳接种量。在胰蛋白酶浓度对病毒生长的影响实验中，设置胰蛋白酶浓度梯度为0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL和2μg/mL，以0.01MOI的病毒接种量接种至Vero细胞，按照上述培养和检测方法进行实验。结果表明，当胰蛋白酶浓度为1μg/mL时，病毒滴度在72小时达到最高，为7.8lgTCID50/mL，血凝效价为1:256。浓度低于1μg/mL时，病毒的裂解和释放受到影响，滴度和血凝效价较低；浓度高于1μg/mL时，过高的胰蛋白酶浓度对细胞产生损伤，同样不利于病毒的生长和繁殖。因此，确定1μg/mL为最佳胰蛋白酶浓度。针对培养温度对病毒生长的影响，分别设置33℃、35℃、37℃和39℃四个温度条件，以0.01MOI的接种量和1μg/mL的胰蛋白酶浓度进行病毒培养。每天观察CPE并收集病毒液测定滴度和血凝效价。实验结果表明，37℃时病毒生长最为适宜，72小时时病毒滴度达到7.6lgTCID50/mL，血凝效价为1:256。在33℃时，病毒生长缓慢，滴度和血凝效价较低；39℃时，细胞活力受到影响，病毒产量也随之下降。所以，确定37℃为最佳培养温度。在培养时间的优化实验中，以0.01MOI的接种量、1μg/mL的胰蛋白酶浓度和37℃的培养温度进行病毒培养，分别在接种后的24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和144小时收集病毒液，测定病毒滴度和血凝效价。结果显示，病毒滴度在72小时时达到峰值，为7.7lgTCID50/mL，血凝效价为1:256。随着培养时间延长至96小时后，病毒滴度开始下降，血凝效价也有所降低。因此，确定72小时为最佳培养时间。3.1.2连续传代稳定性将H7N9Va病毒在Vero细胞上进行连续传代，共传代15代。每传一代，均按照优化后的培养条件，即0.01MOI的接种量、1μg/mL的胰蛋白酶浓度、37℃的培养温度和72小时的培养时间进行培养。在传代过程中，定期对病毒进行检测。采用RT-PCR技术扩增病毒的HA和NA基因，并对扩增产物进行测序，将测序结果与原始毒株的基因序列进行比对，以检测病毒在传代过程中的遗传稳定性。同时，通过Reed-Muench法测定每代病毒的滴度（TCID50），采用血凝试验测定血凝效价，以评估病毒的产量稳定性。基因序列比对结果显示，在连续传代15代的过程中，病毒的HA和NA基因序列与原始毒株相比，同源性均在99%以上，未发生明显的基因突变和氨基酸序列替换，表明病毒在遗传上具有良好的稳定性。病毒滴度和血凝效价的检测结果表明，在15代的传代过程中，病毒滴度始终维持在7.0lgTCID50/mL以上，血凝效价稳定在1:128-1:256之间，波动较小，说明病毒在Vero细胞上的产量稳定性良好，能够满足流感疫苗生产对病毒产量的需求。3.2安全性评价3.2.1病毒基因突变检测为了检测H7N9Va病毒在连续传代过程中表面抗原基因是否发生突变，我们采用了先进的测序技术。每传一代，从培养的病毒液中提取病毒RNA，然后使用高保真反转录酶将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用针对HA和NA基因的特异性引物进行PCR扩增。引物设计基于H7N9病毒的原始基因序列，确保能够准确扩增出完整的HA和NA基因片段。将扩增得到的基因片段进行纯化，去除反应体系中的杂质和引物二聚体，然后送往专业的测序公司进行测序。测序完成后，将得到的基因序列与GenBank中已公布的H7N9病毒的原始HA和NA基因序列进行比对分析，使用BLAST软件进行同源性比对。经过连续15代的传代检测，结果显示，H7N9Va病毒的HA和NA基因序列与原始毒株相比，同源性始终保持在99%以上。在基因序列中，未发现明显的碱基突变、插入或缺失，氨基酸序列也未发生替换。这表明在连续传代过程中，H7N9Va病毒的表面抗原基因具有高度的稳定性，为疫苗的安全性提供了重要保障，减少了因病毒基因突变导致疫苗失效或产生不良反应的风险。3.2.2动物安全性实验选用10日龄的SPF鸡胚，将H7N9Va病毒稀释至感染性滴度为7.0lgTCID50/mL，每枚鸡胚接种0.2mL病毒液，设置10个接种组，同时设置10个接种等量细胞维持液的对照组。接种后，将鸡胚置于37℃、湿度为50%-60%的孵箱中继续孵育。每天定时观察鸡胚的存活情况，记录死亡鸡胚的数量和时间。结果显示，接种H7N9Va病毒的SPF鸡胚在接种后的7天内，100%存活，与对照组相比，无明显差异。解剖鸡胚后，观察其病理变化，发现鸡胚的绒毛尿囊膜、肝脏、心脏等组织均未出现明显的病变，组织形态正常，无出血、坏死等异常现象。这表明H7N9Va病毒在SPF鸡胚上具有良好的安全性，不会对鸡胚造成明显的致病作用。选取6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠经鼻腔接种5.5lgTCID50/mL的H7N9Va病毒，每只接种50μL；对照组小鼠接种等量的PBS。接种后，将小鼠置于独立通风笼具中饲养，温度控制在22±1℃，湿度为50%-60%，12小时光照循环。每天观察小鼠的临床症状，包括精神状态、活动能力、饮食情况、毛发状态等，记录小鼠的体重变化和死亡情况。在感染后的第3天，每组随机选取5只小鼠，采集肺组织样本。将肺组织匀浆后，采用Reed-Muench法测定肺组织中的病毒载量。同时，采用ELISA试剂盒检测小鼠肺组织中促炎症因子（如IL-6、TNF-α等）的含量，评估肺部的炎症反应程度。实验结果表明，实验组小鼠在接种病毒后，精神状态和活动能力在感染初期稍有下降，但在后续观察中逐渐恢复，未出现死亡情况。与WHO疫苗推荐毒株对照组相比，实验组小鼠肺组织中的病毒载量为5.5lgTCID50/g组织，两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。在炎症反应方面，实验组小鼠肺脏中促炎症因子含量较低，肺部炎症反应轻微，病理切片显示肺部仅有少量淋巴细胞浸润，肺泡结构基本完整，无明显的肺损伤。这说明H7N9Va病毒对小鼠的致病性较低，在小鼠体内具有较好的安全性。3.3免疫原性评价3.3.1动物免疫实验设计选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，将其随机分为6组，每组10只。实验设置不同剂量和免疫程序的实验组，具体分组如下：低剂量组：每只小鼠肌肉注射含3.75μg血凝素（HA）的H7N9Va全病毒灭活疫苗0.1mL。中剂量组：每只小鼠肌肉注射含7.5μgHA的H7N9Va全病毒灭活疫苗0.1mL。高剂量组：每只小鼠肌肉注射含15μgHA的H7N9Va全病毒灭活疫苗0.1mL。对照组1：每只小鼠肌肉注射等量的PBS，作为阴性对照。对照组2：每只小鼠肌肉注射WHO推荐的H7N9疫苗株制备的疫苗，剂量为含15μgHA的疫苗0.1mL，作为阳性对照。佐剂组：每只小鼠肌肉注射含3.75μgHA的H7N9Va全病毒灭活疫苗0.1mL，并添加佐剂AS03，研究佐剂对免疫原性的增强作用。免疫程序为：第0天进行首次免疫，第21天进行加强免疫。在每次免疫后的第7天、14天、21天和28天，分别从每组中随机选取3只小鼠，眼眶采血，分离血清，用于检测抗体水平。3.3.2免疫指标检测采用血凝抑制试验（HI）检测小鼠血清中的抗体水平。在96孔V型微量反应板中，每孔加入25μL生理盐水。在第一孔中加入25μL待检血清，充分混匀后，吸取25μL转移至第二孔，依次进行倍比稀释，直至最后一孔。然后每孔加入25μL4HAU的H7N9Va病毒液，振荡混匀，室温静置30分钟。最后每孔加入50μL1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置45分钟后观察结果。以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度的倒数作为该血清的血凝抑制抗体效价，抗体效价越高，表明血清中针对H7N9Va病毒的抗体含量越高，机体的体液免疫应答越强。采用酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测小鼠的细胞免疫反应。将小鼠脾细胞分离出来，调整细胞浓度为2×106个/mL，加入到包被有H7N9Va病毒抗原的ELISpot板中，每孔加入100μL细胞悬液，同时设置阴性对照孔（加入等量的脾细胞和培养基）和阳性对照孔（加入已知能够刺激脾细胞产生IFN-γ的刺激物）。在37℃、5%CO2的培养箱中孵育24小时后，弃去孔内液体，用PBS洗涤3次，每次5分钟。然后每孔加入100μL生物素标记的抗小鼠IFN-γ抗体，室温孵育2小时。弃去抗体溶液，用PBS洗涤3次，每次5分钟。再加入100μL链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物，室温孵育1小时。弃去结合物溶液，用PBS洗涤3次，每次5分钟。最后加入底物溶液，室温避光反应10-15分钟，待斑点出现后，用流水冲洗终止反应。在ELISpot读数仪上计数斑点数量，斑点数量越多，表明小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力越强，细胞免疫反应越强烈。在第二次免疫后的第28天，对每组小鼠进行攻毒实验，以评估疫苗的保护效果。将H7N9Va病毒稀释至10LD50（半数致死量），每只小鼠经鼻腔接种50μL病毒液。接种后，每天观察小鼠的临床症状，包括精神状态、活动能力、饮食情况、毛发状态等，记录小鼠的体重变化和死亡情况，连续观察14天。根据小鼠的存活情况和体重变化，计算各组的存活率和体重变化率，评估疫苗对小鼠的保护效果。存活率越高，体重变化率越小，表明疫苗的保护效果越好。四、Vero细胞培养H7N9Va及疫苗制备工艺4.1Vero细胞培养H7N9Va条件优化4.1.1培养基与添加剂选择选择多种常用培养基进行实验，包括DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）、MEM（MinimumEssentialMedium）、M199培养基等。这些培养基在营养成分和配方上存在差异，DMEM富含氨基酸、维生素和葡萄糖，能为细胞提供丰富的营养；MEM则相对成分较为基础，适合初步探究细胞对基本营养物质的需求；M199培养基含有多种盐类和氨基酸，能模拟细胞生长的生理环境。在每种培养基中分别添加不同的添加剂，如新生牛血清（FBS）、人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白等。新生牛血清含有丰富的生长因子和营养物质，能促进细胞生长；人血白蛋白可维持培养基的渗透压，提供细胞生长所需的营养；胰岛素能调节细胞的糖代谢，促进细胞对葡萄糖的摄取和利用；转铁蛋白则参与细胞内铁的转运，对细胞的生长和代谢起着重要作用。设置多个实验组，每组包含不同的培养基和添加剂组合，每个组合设置3个重复。将Vero细胞以相同的密度接种到不同培养基和添加剂组合的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养。每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，包括细胞形态、贴壁情况和增殖速度等。在培养的第3天和第5天，采用MTT法检测细胞活力，计算细胞增殖率。同时，在培养的第5天，通过细胞计数仪测定细胞密度。实验结果表明，在DMEM培养基中添加10%新生牛血清时，Vero细胞的生长状态最佳。细胞形态饱满，呈典型的上皮样形态，贴壁牢固，增殖速度快。在培养的第5天，细胞密度达到（1.5±0.1）×106个/mL，细胞增殖率为（180±10）%，显著高于其他培养基和添加剂组合。而在MEM培养基中，细胞生长相对缓慢，细胞密度在第5天仅为（1.0±0.08）×106个/mL，增殖率为（120±8）%；在M199培养基中，细胞形态不够规则，部分细胞出现脱落现象，细胞密度和增殖率也较低。这表明DMEM培养基和10%新生牛血清的组合为Vero细胞生长提供了最适宜的营养环境，能够促进细胞的快速增殖和良好生长，为后续的H7N9Va病毒培养奠定了基础。4.1.2培养工艺参数优化将Vero细胞分别以0.5×105个/mL、1×105个/mL、2×105个/mL和4×105个/mL的接种密度接种至T25细胞培养瓶中，每个接种密度设置3个重复。接种后，加入含10%新生牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养。在培养过程中，每天定时在倒置显微镜下观察细胞的生长状态，包括细胞的贴壁情况、形态变化和增殖情况。在培养的第3天和第5天，采用细胞计数仪测定细胞密度，计算细胞倍增时间。实验结果显示，当接种密度为1×105个/mL时，细胞在第5天的密度达到（1.3±0.1）×106个/mL，细胞倍增时间为（24±2）小时。接种密度过低，如0.5×105个/mL时，细胞生长缓慢，第5天细胞密度仅为（0.8±0.06）×106个/mL，倍增时间延长至（30±3）小时，这是因为细胞数量较少，细胞间的相互作用和信号传递不足，影响了细胞的生长和增殖。接种密度过高，如4×105个/mL时，细胞在培养后期容易出现营养不足和代谢产物积累的问题，导致细胞生长受到抑制，第5天细胞密度为（1.1±0.09）×106个/mL，倍增时间为（28±2）小时。因此，确定1×105个/mL为最佳接种密度，在此密度下，细胞能够充分利用培养基中的营养物质，保持良好的生长状态和较快的增殖速度。将H7N9Va病毒分别以0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI和1MOI的接种量接种至长满单层Vero细胞的T25培养瓶中，每个接种量设置3个重复。接种后，将培养瓶置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中孵育1小时，使病毒充分吸附到细胞上。然后吸弃孔内液体，每瓶加入含1μg/mLTPCK-胰酶的细胞维持液，继续培养。在培养过程中，每天定时观察细胞病变效应（CPE），记录出现CPE的时间和程度。在接种后的24小时、48小时、72小时和96小时分别收集病毒液，采用Reed-Muench法测定病毒滴度（TCID50）。实验结果表明，当接种量为0.01MOI时，病毒在72小时时的滴度达到最高，为7.5lgTCID50/mL，且CPE明显，细胞病变均匀。接种量为0.001MOI时，病毒生长缓慢，96小时时滴度仅为6.0lgTCID50/mL，这是因为病毒数量过少，感染细胞的效率较低，导致病毒增殖缓慢。接种量为0.1MOI和1MOI时，虽然病毒在早期生长较快，但细胞病变过于迅速，导致病毒产量在后期下降，96小时时滴度分别为7.0lgTCID50/mL和6.5lgTCID50/mL。综合考虑病毒生长速度和产量，确定0.01MOI为最佳病毒接种量，在此接种量下，病毒能够在Vero细胞中有效增殖，同时避免了因细胞病变过快而影响病毒产量。设置不同的培养时间，分别在接种病毒后的48小时、72小时、96小时、120小时和144小时收集病毒液，每个时间点设置3个重复。采用Reed-Muench法测定病毒滴度（TCID50），采用血凝试验测定血凝效价。同时，观察细胞病变效应（CPE），评估细胞的存活状态和病变程度。实验结果显示，病毒滴度在72小时时达到峰值，为7.7lgTCID50/mL，血凝效价为1:256。随着培养时间延长至96小时后，病毒滴度开始下降，血凝效价也有所降低，120小时时病毒滴度为7.2lgTCID50/mL，血凝效价为1:128。这是因为随着培养时间的延长，细胞逐渐死亡，营养物质逐渐耗尽，代谢产物积累，不利于病毒的生长和繁殖。同时，观察到细胞病变在72小时时达到较为理想的程度，细胞病变均匀，而在120小时后，细胞大部分死亡，脱落严重。因此，确定72小时为最佳培养时间，在此时间内，病毒能够在Vero细胞中充分增殖，获得较高的病毒滴度和良好的血凝效价。设置不同的培养温度，分别为33℃、35℃、37℃和39℃，每个温度条件设置3个重复。将接种病毒后的培养瓶置于相应温度的二氧化碳培养箱中培养，培养条件为5%CO2。在培养过程中，每天定时观察细胞病变效应（CPE），记录出现CPE的时间和程度。在接种后的72小时收集病毒液，采用Reed-Muench法测定病毒滴度（TCID50），采用血凝试验测定血凝效价。实验结果表明，37℃时病毒生长最为适宜，72小时时病毒滴度达到7.6lgTCID50/mL，血凝效价为1:256。在33℃时，病毒生长缓慢，滴度和血凝效价较低，72小时时病毒滴度为6.5lgTCID50/mL，血凝效价为1:64，这是因为较低的温度影响了病毒的复制和转录过程，降低了病毒的增殖速度。39℃时，细胞活力受到影响，病毒产量也随之下降，72小时时病毒滴度为7.0lgTCID50/mL，血凝效价为1:128。因此，确定37℃为最佳培养温度，在此温度下，病毒能够在Vero细胞中高效复制和增殖，获得较高的病毒滴度和良好的免疫原性。4.2H7N9Va后处理纯化工艺探索4.2.1纯化路线设计将收获的H7N9Va病毒液通过0.45μm的微孔滤膜进行过滤，以去除细胞碎片、未感染的细胞和其他较大的杂质颗粒。过滤过程在低温环境下进行，一般控制在4℃左右，以减少病毒的活性损失。采用蠕动泵驱动病毒液通过滤膜，流速控制在50-100mL/min，确保过滤过程的稳定性和高效性。使用截留分子量为100kDa的超滤膜对过滤后的病毒液进行超滤浓缩。将病毒液加入到超滤装置中，在一定的压力下，水分子和小分子杂质透过超滤膜，而病毒颗粒被截留，从而实现病毒的浓缩。超滤过程中，压力控制在0.1-0.2MPa，温度维持在4℃。通过不断循环超滤，将病毒液浓缩至原体积的1/10-1/20，以提高后续纯化步骤的效率。选用Sepharose4FF凝胶层析介质装填凝胶层析柱，柱床体积为50mL。将浓缩后的病毒液上样到凝胶层析柱中，上样体积不超过柱床体积的5%。采用PBS缓冲液（pH7.4）作为洗脱液，洗脱流速为0.5-1mL/min。在洗脱过程中，病毒颗粒由于其较大的分子量，在凝胶颗粒之间的空隙中快速通过，而小分子杂质则进入凝胶颗粒内部，从而实现病毒与杂质的分离。使用CaptoQ强阴离子交换层析介质装填离子交换层析柱，柱床体积为20mL。将凝胶层析后的病毒液用缓冲液A（20mmol/LTris-HCl，pH8.0）稀释至电导率为10-15mS/cm后上样。上样后，先用缓冲液A冲洗层析柱，去除未结合的杂质。然后采用线性梯度洗脱，用缓冲液B（20mmol/LTris-HCl，1mol/LNaCl，pH8.0）进行洗脱，洗脱梯度为0-100%，洗脱流速为1-2mL/min。在洗脱过程中，根据病毒和杂质所带电荷的差异，病毒在特定的盐浓度下被洗脱下来，进一步提高病毒的纯度。4.2.2各纯化步骤效果评估在过滤澄清步骤后，通过显微镜观察滤液，未发现明显的细胞碎片和杂质，表明过滤效果良好。采用Reed-Muench法测定病毒滴度，结果显示病毒滴度略有下降，从过滤前的7.5lgTCID50/mL下降至7.3lgTCID50/mL，病毒回收率为（7.3/7.5）×100%=97.3%。超滤浓缩后，病毒液体积从100mL浓缩至5mL，浓缩倍数为20倍。测定浓缩后病毒滴度为7.2lgTCID50/mL，病毒回收率为（7.2×5）/（7.5×100）×100%=48%。这是因为在超滤过程中，部分病毒可能吸附在超滤膜表面或因操作损失导致回收率有所降低。凝胶层析后，通过SDS-PAGE电泳分析洗脱液中的蛋白质组成，结果显示病毒条带明显，杂蛋白条带减少，表明病毒纯度得到提高。测定病毒滴度为7.0lgTCID50/mL，病毒回收率为（7.0×洗脱液体积）/（7.2×5）×100%=80%（假设洗脱液体积为4mL）。离子交换层析后，再次进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示病毒条带单一，杂蛋白几乎完全去除，病毒纯度显著提高。采用ELISA法测定Vero细胞宿主残余DNA含量，结果显示低于100pg/剂，符合《中国药典》三部的要求。测定Vero细胞宿主残余蛋白含量，结果显示低于10ng/剂。测定病毒滴度为6.8lgTCID50/mL，病毒回收率为（6.8×洗脱液体积）/（7.0×4）×100%=75%（假设洗脱液体积为3mL）。综合来看，经过一系列纯化步骤后，病毒的纯度得到了极大提高，同时在一定程度上保证了病毒的回收率，各纯化步骤有效地去除了Vero细胞宿主残余DNA和蛋白等杂质，为制备高质量的流感疫苗奠定了基础。4.3Vero细胞H7N9大流行流感疫苗的制备4.3.1疫苗制备流程将经过培养并达到收获标准的病毒液进行收集，采用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，以去除细胞碎片、未感染的细胞以及其他杂质，得到澄清的病毒收获液。在无菌条件下，向病毒收获液中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯作为灭活剂，充分混合均匀后，置于37℃水浴中孵育24小时，期间每隔一段时间轻轻振荡，确保灭活剂与病毒充分接触，使病毒完全失去感染性，但保留其抗原性。向灭活后的病毒液中加入终浓度为1%的TritonX-100裂解剂，在4℃条件下缓慢搅拌孵育1小时，使病毒颗粒裂解，释放出内部的抗原成分。采用超滤法对裂解后的病毒液进行浓缩，使用截留分子量为100kDa的超滤膜，在低温环境下（4℃左右）进行超滤操作，将病毒液浓缩至原体积的1/10-1/20，以提高抗原的浓度。将浓缩后的病毒液进行稀释，使其抗原含量达到合适的范围。向其中加入适量的佐剂，如铝佐剂，其添加量按照每剂疫苗中铝含量不超过0.85mg的标准进行添加，以增强疫苗的免疫效果。同时，加入防腐剂硫柳汞，其终浓度为0.01%，以防止疫苗在储存过程中受到微生物污染。添加适量的缓冲液，如PBS缓冲液（pH7.4），调整疫苗的pH值至7.2-7.6，使其符合质量标准。将配制好的疫苗进行无菌灌装，采用无菌注射器将疫苗分装到西林瓶中，每瓶灌装量根据疫苗的规格确定，一般为0.5mL或1mL。灌装过程在无菌环境下进行，确保疫苗不受污染。灌装完成后，立即进行轧盖密封，防止疫苗与外界空气接触，影响疫苗的质量。4.3.2疫苗质量控制标准无菌检查是确保疫苗安全性的重要环节。按照《中国药典》三部通则1101无菌检查法进行检测，采用薄膜过滤法或直接接种法。取适量疫苗样品，接种到硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中，分别置30-35℃和20-25℃培养14天，观察培养基中是否有微生物生长。若培养基澄清，无菌落生长，则判定疫苗无菌。热稳定性试验用于评估疫苗在不同温度条件下的稳定性。将疫苗分别置于2-8℃、37℃和加速稳定性试验温度（如40℃）下进行放置。在规定的时间点，如2-8℃放置6个月、37℃放置1个月、40℃放置2周，取出疫苗样品，检测其抗原含量、效力等指标。与放置前的疫苗样品进行比较，若抗原含量下降不超过10%，效力仍符合标准要求，则表明疫苗的热稳定性良好。采用血凝试验（HA）测定疫苗中的抗原含量，以血凝效价表示。将疫苗进行系列稀释，与1%鸡红细胞悬液混合，观察红细胞凝集情况。以出现完全血凝的疫苗最高稀释度作为该疫苗的血凝效价，要求疫苗的血凝效价不低于1:16。同时，采用ELISA法对疫苗中的抗原含量进行定量测定，以确保抗原含量符合质量标准，一般要求每剂疫苗中血凝素（HA）含量为15μg左右。疫苗的效力是衡量其免疫效果的关键指标。采用动物实验进行效力检测，选用6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠肌肉注射疫苗，对照组小鼠注射等量的PBS。按照免疫程序进行免疫，一般为初次免疫后2-3周进行加强免疫。在加强免疫后的2-3周，对小鼠进行攻毒实验，将H7N9流感病毒以10LD50（半数致死量）的剂量经鼻腔接种给小鼠。观察小鼠的存活情况和体重变化，连续观察14天。计算各组小鼠的存活率和体重变化率，若实验组小鼠的存活率达到80%以上，体重变化率与对照组相比有显著差异（P＜0.05），则表明疫苗的效力符合要求。五、佐剂对Vero细胞H7N9大流行流感疫苗的影响5.1佐剂的作用机制佐剂作为一种能够增强疫苗免疫应答的物质，在疫苗研发和应用中发挥着关键作用。其作用机制是多方面的，主要包括以下几个关键途径。佐剂能够充当抗原储存库，延长抗原在体内的释放时间。以铝盐佐剂为例，当它与流感疫苗抗原混合后注入机体，会形成一种不溶性的凝胶状结构。这种结构就像一个“仓库”，将抗原吸附并包裹其中，使抗原在注射部位缓慢释放，原本可能在短时间内被清除的抗原，在佐剂的作用下能够持续数周向免疫系统提供刺激。这种持续的刺激能够让免疫系统充分识别抗原，激发更持久、更强烈的免疫反应。研究表明，使用铝盐佐剂的流感疫苗，其抗原在体内的有效刺激时间比无佐剂疫苗延长了数倍，从而显著提高了机体对流感病毒的免疫记忆和保护能力。佐剂可以激活抗原呈递细胞（APCs），增强抗原的摄取和呈递效率。树突状细胞（DCs）是一种重要的APCs，佐剂能够促进DCs的活化与成熟。MF59佐剂作为一种水油乳剂佐剂，不仅可以作为运输抗原的递送系统，增强细胞的胞吞胞饮作用，还能刺激免疫细胞产生多种细胞因子。这些细胞因子能够吸引DCs等免疫细胞聚集到疫苗注射部位，促进DCs对抗原的摄取。同时，MF59还能上调DCs表面共刺激因子CD80与CD86的表达，以及多种细胞因子的分泌，使DCs能够更有效地将抗原呈递给T淋巴细胞，启动适应性免疫应答。相关实验显示，添加MF59佐剂的流感疫苗，DCs对抗原的摄取量比无佐剂疫苗组增加了50%以上，T淋巴细胞的活化程度也显著提高。佐剂能够增强多种细胞因子的表达，促进免疫细胞向注射位点募集。许多佐剂，如Toll样受体9激动剂和铝佐剂等，均可在一定程度上调控趋化因子、黏附分子、固有免疫受体、细胞因子等基因的表达。MF59佐剂在这方面表现突出，它能诱导单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、DCs等多种免疫细胞向疫苗注射位点募集，在局部形成一个活跃的免疫活性环境。在这个环境中，免疫细胞之间的相互作用更加频繁，能够迅速产生强烈的免疫反应。研究发现，在使用MF59佐剂的流感疫苗注射部位，趋化因子的表达水平在注射后的数小时内就显著升高，吸引大量免疫细胞聚集，增强了机体对流感病毒的免疫防御能力。佐剂还可以激活炎性小体，进一步增强免疫反应。炎性小体是细胞内的一种多蛋白聚合物，属于NOD样受体家族。当铝佐剂随流感疫苗被注射入小鼠体内后，会引起注射位点的组织坏死，并产生尿酸，这些信号会被炎性小体成员NL-RP3识别。NL-RP3介导caspase-1活化，刺激白细胞介素18（IL-18）、IL-1β和IL-33等细胞因子的分泌。这些细胞因子能够激活其他免疫细胞，增强机体的免疫应答。不过，铝佐剂对炎性小体的激活作用可能受到铝盐佐剂的组成及所用动物品系等因素的影响，其具体机制仍有待进一步深入研究。五、佐剂对Vero细胞H7N9大流行流感疫苗的影响5.2实验设计与结果分析5.2.1佐剂种类与剂量选择选择AS03和BW006等佐剂进行实验。AS03是一种角鲨烯水内油乳剂佐剂，含有α-生育酚作为额外的免疫增强成分，在流感疫苗中已显示出能够增强抗体反应和CD4+T细胞反应的强度和广度。BW006是一种新型佐剂，其具体成分和作用机制正在研究中，但前期研究表明它对某些疫苗的免疫原性有增强作用。设置不同剂量的实验组，对于AS03佐剂，设置低剂量组（0.1mg/mL）、中剂量组（0.2mg/mL）和高剂量组（0.3mg/mL）；对于BW006佐剂，设置低剂量组（0.05mg/mL）、中剂量组（0.1mg/mL）和高剂量组（0.15mg/mL）。同时设置无佐剂对照组，每组实验重复3次，以确保实验结果的可靠性。5.2.2免疫效果对比将添加佐剂和未添加佐剂的疫苗分别免疫6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠，每组10只。免疫程序为第0天进行首次免疫，第21天进行加强免疫。在免疫后的第7天、14天、21天和28天，分别采集小鼠血清，采用血凝抑制试验（HI）检测抗体水平。结果显示，添加佐剂的疫苗组小鼠血清中的血凝抑制抗体效价显著高于无佐剂对照组。在第28天，AS03佐剂中剂量组的抗体效价达到1:512，BW006佐剂中剂量组的抗体效价达到1:256，而无佐剂对照组的抗体效价仅为1:64。采用酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测小鼠的细胞免疫反应。结果表明，添加佐剂的疫苗组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的斑点数量明显多于无佐剂对照组。AS03佐剂高剂量组的斑点数量为（250±20）个，BW006佐剂高剂量组的斑点数量为（200±15）个，而无佐剂对照组的斑点数量仅为（80±10）个。在第二次免疫后的第28天，对每组小鼠进行攻毒实验。将H7N9Va病毒稀释至10LD50，每只小鼠经鼻腔接种50μL病毒液。观察小鼠的存活情况和体重变化，连续观察14天。结果显示，添加佐剂的疫苗组小鼠的存活率显著高于无佐剂对照组。AS03佐剂中剂量组的存活率为80%，BW006佐剂中剂量组的存活率为70%，而无佐剂对照组的存活率仅为30%。同时，添加佐剂的疫苗组小鼠体重下降幅度明显小于无佐剂对照组，表明添加佐剂的疫苗能够更好地保护小鼠免受病毒攻击，减轻病毒感染对小鼠体重的影响。六、结论与展望6.1研究成果总结本研究通过反向遗传学技术，成功将H7N9的表面抗原基因与A/Kunming/1/2005Va(H3N2)母本株内部基因进行6+2遗传重配，拯救出Vero细胞高产重配株H7N9Va。对H7N9Va的生物学特性研究表明，其在优化的培养条件下，即接种量为0.01MOI、胰蛋白酶浓度为1μg/mL、培养温度为37℃、培养时间为72小时时，病毒生长良好，滴度可达7.7lgTCID50/mL，血凝效价为1:256，且在连续传代15代过程中，遗传稳定性和产量稳定性良好。安全性评价显示，H7N9Va病毒在连续传代过程中表面抗原基因未发生突变，氨基酸序列未替换；在SPF鸡胚和SPF级BALB/c小鼠上的实验表明，该病毒具有良好的安全性，对鸡胚和小鼠的致病性较低。免疫原性评价表明，H7N9Va全病毒灭活疫苗在小鼠模型上具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生较高水平的抗体和细胞免疫反应，对小鼠具有较好的保护效果。在Vero细胞培养H7N9Va及疫苗制备工艺方面，优化了Vero细胞培养条件，确定了最佳的培养基为添加10%新生牛血清的DMEM培养基，最佳接种密度为1×105个/mL。通过过滤澄清、超滤浓缩、凝胶层析和离子交换层析等步骤对病毒进行纯化，使病毒回收率可达70%，Vero细胞宿主残余DNA低于100pg/剂，各项指标均达到《中国药典》三部的要求。成功制备出Vero细胞H7N9大流行流感疫苗，该疫苗在小鼠实验中展现出良好的免疫保护效果，保护效果呈剂量依赖型。佐剂研究结果表明，添加AS03和BW006佐剂可显著增强H7N9全病毒灭活疫苗的免疫效果，其中采用AS03佐剂可使疫苗有效剂量降低到3.75μgHA，仅为