（正式版）DB51∕T 2167-2016 《微生物检测领域设施和环境条件监测指南》

微生物检测领域设施和环境条件监测指南2016-10-01实施2016-10-01实施四川省质量技术监督局发布 1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14一般要求 45有要求的设施和环境条件识别 46有监测要求的设施和环境条件识别 47设施和环境条件监测 4附录A(资料性附录)洁净室及相关受控环境采样布点方法 6附录B(资料性附录)洁净室及相关受控环境的监测 8附录C(资料性附录)仪器和设备 附录D(资料性附录)培养基和试剂的配制 20参考文献 工GB/T27025《检测和校准实验室能力的通用要求》、国家认证认可监督管理委员会(CNCA)发布的《检验检测机构资质认定评审准则》、中国合格坪定国家決可委员会(CNAS)发布的CNAS-CL09:2013《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》,以及与微生物检测相关的标准、规范中都对微生物检测实验室设施和环境条件做出了要求。本标准提出微生物检测领域设施和环境条件监测指南，旨在为实验室提供设施和环境管理的科学路径，以满足相关要求。GB/T27025中5.3.2和《检验检测机构资质认定评审准则》中提出：“……依据相关的规范、方法和程序有要求，当影响检验检测结果质量时，应监测、控制和记录环境条件……”的要求。首先，要求中讲到“相关的规范、方法和程序有要求，或对结果的质量有影响时”才需要“监测、控制和记录环境条件”。实验室在具体应用中，对相关的规范、方法和程序的要求中，哪些环境条件对结果的质量会造成影响的识别有差异，有些实验室甚至要求每个场所都要记录温度、湿度，因此会由于做很多无用功而大大影响工作效率。第二，对要求中“控制”的理解。当相关的规范、方法和程序有要求，或对结果的质量有影响时，实验室应通过布局、使用设施、设备来控制环境条件，使之满足相关的规范、方法和程序的要求，确保对结果不会产生不良影响。典型的控制如洁净实验室及相关受控环境、涉及生物安全的实验室等等。第三，对要求中“监测”的理解。对设施和环境条件的要求，最重要的是持续满足要求。所以，除了完成建设安装设施设备后的验收之外，持续的监测必不可少，以证明在使用过程中设施和环境条件持续符合相关要求。然而，持续监测对实验室是较难的工作，不同类型的实验室对环境条件要求不同，使得不同实验室监测的内容也有较大的差异；相同类型的实验室因使用目的不同，监测的内容也不尽相同，因此实验室应针对设施和环境条件有要求的区域，编制专门的作业指导书，用以指导对设施和环境条件的监测。第四，对要求中“记录”的正确理解包括三个方面，一是控制的记录，即使用设施、设备控制后，环境条件达到要求的验收证明记录；二是检测时，检测人员对环境条件的记录，用以表明环境条件满足相关规范、方法和程序的要求，或对结果的质量不会产生影响；三是定期监测的记录，用以表明环境条件能持续满足相关规范、方法和程序的要求，或对结果的质量不会产生影响。本标准依据GB/T27025《检测和校准实验室能力的通用要求》、国家认证认可监督管理委员会(CNCA)颁布的《检验检测机构资质认定评审准则》和其他有关准则、规范的要求，从有要求的环境设施条件识别、有监测要求的环境设施条件识别、环境设施条件监测三个方面给出指南。本标准主要由范围、术语和定义、一般要求、有要求的环境设施条件识别、有监测要求的环境设施条件识别、环境设施条件监测和四个资料性附录构成。1本标准适用于微生物检测领域中有洁净度要求的设施国合格坪定国家決可委员会(CNAS)CL09件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。JG/T292洁净工作台国家认证认可监督管理委员会《检验检测机构资质认定评审准则》(2015版)和以下术语和定义适用于本标准，为方便使用，以下重复列出了GB/T25915.1、GB50073、GB5059123.3洁净室及相关受控环境cleanroomandrelevantcontrolledenvironments洁净室及其附属的、辅助的、相联系的开放或封闭的内部或周边空间，该空间空气悬浮粒子浓度、温度、压力以及其它相关参数都能被控制在期望的范围内。为检测设施或其部分性能而实施的规定程序。3.5用于空气洁净度分级的空气中悬浮的固体和液体粒子，其粒径在0.1μm～5μm。注2:参见GB50073-2013,2.0.7。3.6给定的粒径检测仪所显示的、与被测粒子的响应量相当的球形体直径。3.5洁净度cleanliness以单位体积空气中大于或等于某粒径粒子的数量来区分的洁净程度。以ISON级表示的、洁净室及相关受控环境按空气悬浮粒子浓度划分的洁净度水平(或规定确定该水平的过程)。洁净区域内空气的流动形态和分布。单向流洁净室unidirectionalairflowcleanroom由方向单一、流线平行且速度均匀稳定的水平或垂直单向流流过房间工作区整个截面的洁净室。34示例：GB4789.1中3.1.4中规定，对食品微生物检验实验室环境的基本要求为实验室内环境的温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求。如医疗用品无菌检验时，需在ISO5级的洁净室进行，实验室应识别所需要的环境并人员、样品、生物、财产等安全保护的要求。注：实验室通过布局、安装设施提供符合要求的环境条件，如在洁净室内设置与外部联系的通外事故时可获得及时的救助。时，实验室应重新监测这些设施和环境条件；示例：实验室的紧急喷淋设施、洗眼器、消灯辐射照度值；注：新紫外线灯辐射照度值应不小于90μW/cm²(30W直管型紫外线灯),使用中紫外线灯紫外线灯辐射照度值应不57.3通常，实验室应具备相应检测能力，便于自行开展监测。如果实验室自身不具备检测能力，可委7.4自行开展设施和环境条件监测的，检测时所使用的仪器设备应按GB/T27025中5.6的要求进行管7.6如果监测结果表明，设施和环境条件已发生偏移，应在记录或报告中说明，并分析原因。如可能监测记录和报告(如果有)应一并存档。相关管理部门应在规定时间内收集果有),按照实验室档案管理程序的要求进行管理。7.9当使用洁净工作台时，应根据实验室实际情况，按JG/T292的要求监7.10当使用生物安全柜时，应根据实验室实际情况，按JG170的要求监测相应指标，以证明其持续6(资料性附录)A.1采样点布置应力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏，下列多点采样的采样点位置图示可作为参考(见图A.1)78监测项目温度(℃)相对湿度(%)送风量5级(class5)平均风速(m/s)12个月单向流(静态)6级(class6)换气次数n(h⁻)非单向流(静态)7级(class7)换气次数(h⁻¹)15~非单向流(静态)8级～9级(class换气次数(h⁻¹)10~非单向流(静态)不同等级之间不小于512个月不适用于非封闭洁净区洁净室与室外噪声12个月照度24个月一照度均匀度24个月小照度与平均照度之比，适用时可测6个月如使用紫外灯(30W直管型)注：洁净度5级相当于原百级，6级相当于原千级，7级相当于原万级，8级相当于原十万级，9级相当于原三十万级。9B.2.2空气洁净度指标B.2.2.1悬浮粒子表B.2给出了静态测试不同洁净度级别的洁净室及相关受控环境时，悬浮粒子最大允许数及证实持续符合要求的检测周期。表B.2不同洁净度级别的洁净室及相关受控环境悬浮粒子监测要求洁净度级别最大允许数(粒/m³)5级(class5)6个月6级(class6)12个月7级(class7)8级(class8)9级(class9)注：按测量方法相关不确定度要求，上述浓度数据的有效数字不超过3位。B.2.2.2沉降菌和浮游菌表B.3给出了不同洁净度级别洁净室及相关受控环境对沉降菌和浮游菌监测和证实持续符合要求的检测周期。表B.3不同洁净度级别洁净室及相关受控环境沉降菌和浮游菌监测要求洁净度级别5级(class5)5浮游菌：6个月6级(class6)沉降菌：3个月浮游菌：12个月7级(class7)8级(class8)9级(class9)一B.2.3表面染菌密度当需对室内微生物表面污染状况做细致确认时可测表面染菌密度。洁净度级别物体表面平均菌落数(CFU/cm²)5级(class5)6级(class6)7级(class7)8～9级(class8～9)B.3检测要求B.3.1.2温度检测仪的最小分度值不大于0.2℃,湿度检测仪的测量精度为±3%;B.3.1.3每个温控区域至少设置一个测点，并位于房间中间，应在温、湿度读数稳定后记录。B.3.2送风量B.3.2.1单向流洁净室应采用平均风速(m/s)、非单向流或混合流洁净室宜采用换气次数(n)表示，换气次数应按下式计算：v—送风面平均速度(m/s);B.3.2.2检测室内微风速仪器的最小刻度不应大于0.02m/s;一般可用热球式风速仪；B.3.2.3单向流洁净室可采用室截面平均风速和截面积的乘积的方法确定送风量，测点位于高效过滤器出风面约15cm~30cm的位置，截面上测点间距不宜大于0.6m,测点数量不少于4个，取所有读数的算术平均值作为平均风速。为辅助风管，连接于过滤器风口外部，在套管出口平面上，均匀划分小方格(边长<200mm),在方格中心设测点。对于小风口，最少测点数不少于6点。也可采用锥形套管，上口与风口内截面相同或相近，下口面积不小于上口面积的一半，长度宜大于1.5倍风口边长，侧壁与垂直面的倾斜角不宜大于7.5°(图B.1)),以测定截面平均风速，乘以测定截面净面积，算出风量。b)风量罩法，选用带流量计的风量罩法时，可直接得出风量。风量罩面积应接近风口面积。测定时应将风量罩口完全罩住过滤器或出风口，风量罩边与接触面应严密无泄漏。c)风管法，如为矩形风管，测定面积应按奇数分成纵、横列，再在每一列上分成若干个相等的小截面，每个小截面宜接近正方形，边长不大于200mm,测点设于小截面中心。小管道截面上的测点数不宜少于6个。如为圆形风管，则按等面积圆环法划分测定截面和确定测定数。可在风管外壁针对划分的每行方格中心上开孔，便于插入热球风速仪测杆或毕托管。用毕托管时应先测定动压，然后由下式确定风量：Q=1.29F√Pa上二式中：F—管道截面积(m³);d)风口法，测新风量、回风量等负压风量时，如受环境条件限制，无法采用套管或风量罩，也不能在风管上检测时，则可用风口法。风口上有网、孔板、百叶等配件时，测定面应距其约50mm,测定面积按风口面积计算，测点数同套管法(B.3.2.4a))的规定。对百叶风口，也可在每两条百叶中间选不少于3点，并使测点正对叶片间的斜向气流。测定面积应按百叶风口通过气流的净面积计算。B.3.3.1压差检测应在所有房间的门关闭时进行；B.3.3.2有排风时，检测应在最大排风量时进行；B.3.3.3宜从平面最里面的房间依次向外检测相邻相通房间的压差，直至测出洁净区域与非洁净区、室外环境(或向室外开口的房间)之间的压差；B.3.3.4由于所测压差很小，建议设置永久性测点，位于洁净室中央，远离可能影响测点局部压力的送风口和回风口。B.3.4噪声测对角4点，距侧墙各1m,测点朝向各角；B.3.4.3当为混合流洁净室时(A)时应对测点值进行如下修正：相差(6～9)dB(A)时减1dB(A)、相差(4～5)dB(A)时减2dB(A)、相差3dB(A)时减3dB(A)、相差小于3dB(A)时B.3.5.2可采用便携式照度计检测，仪器技术要求见附录C;B.3.5.3检测必须在室温趋于稳定之后进行，如使用荧光灯，其使用时间已有100h以上，检测前已开启15min;如使用白炽灯，其使用时间已有10B.3.5.4检测距地面高0.8m,按1～2m间距墙面1m。B.3.6.2紫外线辐照计的检测波长为253.7nm,应在计量部门检定的有效期内使用。检测时，待其稳尽量少走动；nmin—最少测点数(小数一律进位为整数);√A—被测对象的面积(m²);对于非单向流或混合流洁净室，指房间面积；对于单向流洁净面积(m²)7级2224322862242c)每一受控环境的采样点不宜少于2点。对于洁净度5级及优于5级以上的洁净室，应适当增加d)采样点应均匀分布于洁净室或洁净区的整个面积内，并位于工作区高度(距地0.8m,或根据工艺确定),当工作区分布于不同高度时，可以有1个以上检测面。e)乱流洁净室(区)内采样点不得布置在送风口正下方。f)每一测点上每次的采样量必须满足最小采样量的要求，见表B.6。5级(class5)一6级(class6)27级(class7)28～9级(class8～9)22表中最小采样量大于2.83L的，可用2.83L/min计数器采样多于1min或用28.3L/min计数器采样1min,其余类推。g)每点采样次数应满足可连续记录下3次稳定的相近数值，3次平均值代表该点数值。h)当怀疑现场计算出的检测结果可能超标时，可增加测点数。5%时，28.3L/min粒子计数器水平采样管长度不应超过3m,2.83L/min粒子计数器水平采样管长度不应超过0.5m。k)若仪器采样口流速与室内气流速度不相等，其比例应在0.3:1～7:1之间。1)当因检测差错或微粒浓度异常低下(空气极为洁净)造成单个非随机的异常值，并影响计算结m)每一检测空间只允许删除一次检测值，并且保留的检测值不少于3个。假定某次检测了m个点，每个点检测了n次(各个点的检测次数不一定相等)。结果及参数计算如m—某一洁净室(内)的总采样点数，个。23456789tB.3.7.4结果判定(判断悬浮粒子的洁净度级别)应同时满足以下两个条件：UCL≤相应级别悬浮粒子要求。B.3.8.1沉降菌和浮游菌的采样装置有以下两类第二类：有源采样装置，如撞击采样器(技术要求见附录C)、离心采样器、过滤采样器。B.3.8.2空气洁净环境中浮游菌的静态或空态检测前，应对室内各类表面进行擦拭消毒，但不得对室B.3.8.3用于检测的培养基或培养条、稀释液、棉拭子等每批均应作空白对照，结果应为阴性。同时每一间洁净室或每一个控制区应设1个阴性对照皿，即模拟操作过程，将培养皿a)使用直径90mm(Φ90)的培养皿采样。当采用其他直径培养皿时，应使其总面积和Φ90皿总b)检测菌落总数应使用大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA),检测真菌总数应使用沙氏琼脂培养基(参d)无特定要求时，培养皿应布置在地面及其以上0.8m之内的任意高度。e)动态监测时也可根据具体情况f)采样点数应不少于B.5中对测点数的规定，并同时满足表B.8中的最少培养皿数。洁净度级别5级(class5)6级(class6)47级(class7)38～9级(class8～9)2h)培养皿应从内向外布置，从外向内收皿。i)每布置完1个皿，皿盖只允许斜放在皿边上，对照皿盖挪开即盖上。j)布皿前和收皿后，均应用双层包装保护培养皿，以防污染。k)收皿后应倒置摆放，并应及时(2h之内)放入培养箱培养。检测菌落总数的培养温度为(35~37)℃,培养时间为(24～48)h;检测真菌的培养温度(27～29)℃,培养时间为3d。m)对培养后的皿上菌落计数时，应采用5～10倍放大镜查看，若有2个或更多的菌落重叠，可分辨时则以2个或多个菌落计数。n)当单皿菌落数太大受到质疑时，可按以下原则之一进行处理并做好详细记录。o)每个测点平均菌落数取到小数点后1位。p)计数各个培养皿的菌落数。每个测点的沉降菌平均菌落数M按式B.10计算：M…M;—1号到i号测点平皿菌落数(多个测点时为其平均值),CFU/30min;i—培养皿总数。落数超过判定要求，则应重新采样2次，2次测试结果均合格才能判为合格。b)检测菌落总数应使用大豆酪蛋白琼脂培养基，检测真菌总数应使用沙氏琼脂培养基(参见附录c)采样点数应不少于表B.5中对测点数的规定。d)采样点应在离地0.8m高平面上均匀布置。乱流洁净室内不得在送风口正下方布点。静态或空e)每点采样1次，如无特殊要求，每次采样量应大于等于表B.9推荐的浮游菌最小采样量。当预洁净度级别最小采样量(L)5级及以上(class5及以上)6级(class6)7级(class7)8～9级(class8～9)注：每次采样时间不宜超过15min,不应超过30min。f)采样器应用支架固定，采样时检测人员应退出(手持离心式采样器除外)。检测人员的穿戴满足B.3.8.41)的要求。必须手持采样器时，应将手臂伸直，站于下风向。g)采样后宜在2h之内将采样器中的培养皿或培养基条送入培养箱中培养。h)每个测点的结果以平均值表示时，保留小数点后1位。采样量，不分级别，均应大于1m³。每点可用j)单点菌落数太大时，应按B.3.8.4n)的规定处理。k)计数各个培养皿的菌落数。每个测点的浮游菌平均菌落数N按式B.11)计算：n—测点菌落数(多个测点时为其平均值),CFU;b)用规格板标定出面积25cm²的区块，对于围护结构，每面结构不少于4块，对于设备，每件不少于2块，取样地点视具体情况确定。c)用生理盐水或磷酸盐缓冲液稀释菌悬液，检测菌落总数法见附录D)。d)将无菌棉拭于含10ml稀释液试管中浸湿，于管壁上挤干后，对一区块擦抹采样，横竖往返8经电动混匀器震荡20s或在手掌振打200次。e)取含菌液体1.0ml,以倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，于(35～37)℃培养箱中培养(24～48)h后计数。f)对于适用接触皿采样的表面，以无菌操作方式，先将培养基注入硬质或软质55mm(Φ55)平住整个区域5s,不得有环形或线性运动。g)对于围护结构，每面结构应用不少于4个培养皿按压，对于设备，每件用不少于2个培养皿按h)按压取样后的培养皿，应在2h之内，于(35～37)℃培养箱中培养(24～48)h后计数。i)菌数平均数取到小数点后1位。j)每个测点的表面染菌平均菌落数应符合表B.4的要求。(资料性附录)仪器和设备C.1.2冰箱：2℃~8℃。测量范围0℃~50℃,测量精度±0.5℃;玻璃液体温度计刻度最小分度值≤0.2℃,数显温度计的最小分辨率为0.1℃,校准周期≤12个月。项目设施检测为0.1m/s～1.0m/s,风管检测为0灵敏度/分辨率读数+0.1m/s的±(5%)响应时间满刻度的90%时小于1s校准周期≤12个月项目小量程为0Pa～100Pa;大量程为量程0Pa～100Pa时1Pa/量程0Pa～100Pa时满刻度的±1.5%,量程0Pa～100kPa数字声级计的技术要求为测量范围(A声级)30dB～120dB,测量精度±1.0dB,测量前使用校准利用光敏半导体元件的物理光电现象制成。当外来光线射到光探测器(光电元件)后，光电元件将光能转变为电能，通过读数单元(电流表或数字液晶板)显示光的照度值。照度计的技术要求为量程11x～50001x,示值误差≤0.8%,按要求对仪器进行期间核查和使用前项目最小粒径阈值时(50±20)%,大于或等于最小粒径阈值的1.5倍低浓度范围与实际预期的最低计数相比，伪计数不显著。自净阶段计数在一段时间内等于零，如高浓度范围在使用点，大于设施洁净度上限浓度2倍，且不超过制造商建议≤12个月，或规定的性能验证时养琼脂平板上，经35℃~37℃,48h培养后，计算出每平方米空气中所含的细菌菌落总数的采样器。技术要求为对空气中细菌捕获率≥95%,操作简单、携带方便、性能稳定并便于消毒。(资料性附录)无水磷酸氢二钠2.83g