无菌检测和微生物限度常见问题

无菌检测和微生物限度常见问题

1、答：严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,

这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性〜但是滤器如果可以提供

滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌

也是未尝不可的.

如果供试品没有抑菌作用，可以在加完培养基后用无菌的注

射器把菌液注入，摇匀如果供试品有抑菌作用，正如安哥洛卡所讲,

在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌，摇匀，抽虑，加培养基.无菌

检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。只

是注意：1、避免人为污染。2、阳性菌加入数量

2、问：离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么？

答：原理：利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离；

操作：取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液

如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离

心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml,加稀释剂至原规定量.

注意事项：真菌由于沉降系数比较小，500r/min离心5min,

黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离

心沉淀法.

3、问：稳定性实验的微生物及无菌检查，是否每次都要做？

答：是；

原因；一实验期内可能会染菌；

二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡”，有些成为碎片，这些碎

片在一定的条件和时间下，可以自我修复而复活.

三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所

有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无

菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有

问题。

4、问：眼部给药制剂如何做卫生学检验？

答：液体制剂：无菌检查；

半固体及固体制剂：微生物限度检查

5、问：滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查？

答：一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品，

故其成品的微生物质量应要求统一为无菌；所以，滴眼剂产品的临

床合理用药应与其卫生标准要求一致，即将其微生物质量要求统

一为无菌，显然更为合理；

二滴眼剂的微生物质量要求为无菌，是与各国药典在滴眼剂

要求上的统一，及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善

等方面看，滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要

性。

三同时，中国已加入WTO,进出口药品已有明确质量要求（在

国外药典中，眼用药品都以无菌要求），同时临床用药更加合理与

规范。

故现行药典将滴眼剂的卫生标准统一为强制性无菌要求。

6、问：如何进行灭菌验证？

答：可用生物指示剂进行验证，

湿热灭菌：湿热脂肪芽泡杆菌泡子

干热灭菌：枯苴芽抱杆菌抱子

7、问：为何洁净度沉降菌的检查只用营养琼脂？

答：一玫瑰红钩培养基对细菌的生长有抑制作用，而营养琼脂

对于真菌的生长则没有抑制作用，所以选用营养琼脂作为培养基

二营养琼脂主要为培养细菌，而且培养时间是2天，原因为细

菌为原核生物，生长与繁殖的能力较霉菌等真核生物强，所以控制

了细菌，霉菌等真菌也在一定程度上也得到了控制

三厂家在制定自己的内控标准时，可以同时对细菌和真菌进

行控制.

8、问：微生物培养时间范围如何界定？

答：含量测定所允许的误差为±2虬如果照此限度，无菌培养

时间为14天*24小时/天=336小时，它的2%为6.72小时，前后共

13.44小时；又加上无菌检验没有必要达到含量测定所要求的精

度，所以我们完全可以在培养的第十四天的任何上班时间观察结

果下结论.微生物限度检查培养时间分别为48小时及72小时，

它们的2%分别为0.96小时，1.44小时，即我们只能在准确培养

时间的前后「2小时内计数.

9、问：抗生袤乳膏，需加聚山梨酯80、司盘、单硬脂酸甘

油酯乳化，后离心集菌（离心后不分层），再薄膜过滤。但基质

堵住膜孔，过滤速度非常慢，怎么办？

答：1、可以用十六烷酸异丙酯萃取基质，使之分层，取水

层进行薄膜过滤（回收率差）。

2、样品加入吐温-80,乳化（45度）-----薄膜过滤。

关键词：抗生素乳膏、十六烷酸异丙酯、萃取、吐温-80、

乳化（45度）、薄膜过滤

10、问：陶瓦盖作用及使用范围

答：陶瓦盖的主要作用为防止菌落蔓延生长成片或发生重叠

影响计数，通常在在效价测定中使用，在微生物限度检查中仅在易

形成片状菌某些剂型如蜜丸、水丸中使用.

11、问：如何枝据消毒物品的特性确定合格的灭菌时间和温

度？

答：一般情况二，含有糖分的培养基温度需控制在115215

〜20min,不含糖分的培养基温度控制在121℃15〜20min,而含

菌的培养基（使用过）温度需控制在12dC30min左右，此外每

次使用时，应放入必要的监视指标。

12、问：如何减少培养基灵敏度下降引起的误差？答：目前大

多数单位使用干粉培养基，使用较方便，但由于其极易吸潮，如

存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。新鲜配制的

培养基应在2C〜20C避光保存，但不得冻结，保存时间不得过

2周。硫乙醇盐流体培养基储存过程中，若氧化还原层超过

1/5,须经水浴加热煮沸lOmin方可使用，但只限一次。否则可

使培养基中糖、微生物和氨基酸受到破坏，影响质量

13、问：如何控制细菌的培养时间？

答：不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响样品经

24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但

变大，而且还有很多新生长出来的菌落，培养72h后，菌落数增

加不多，但菌落明显变大，而且混杂的霉菌生长旺盛，影响结果

的观察计数。同时这也是一些样品经72h培养后细菌总数技术有

明显增加的一个原因。培养24h和培养48h计数结果有明显差

异，后者合格率明显降低，所以在规定的培养环境下，应严格遵

守培养时间，以便真实的反映出样品中细菌总数的水平。

14、问：菌种保藏与管理应执行哪些程序？

答：菌种保藏与管理应有完整的程序，保藏的菌种必须具备

该菌种的详细历史及有关资料。一般是首先填写菌种卡片，登记

菌种名称编号，来源历史，形态特征，生化与血清学鉴定，以及

菌种传代次数、最宜培养基和培养条件、保藏方法、贮存条件及

保藏地址等

15、问：青霉素酶的保存条件及温度对其活性的影响

答：青霉素酶能够在41保存6个月以上活性不发生显著改

变。与同时采用的加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的力法

比较，没有显著的不同；

温度对青霉素酶的活性影响很大。55C时对青霉素G呈现最

高水解活性，随着温度的升高或降低，酶水解活性逐渐下降。缓冲

液pH对酶活性存在一定的影响，最适酸碱度为pH7.0,在应用本

脑进行青霉素制剂无菌检查等应用时，需特别注意测试温度及酸

碱度的影响.

16、问：标准灭菌时间

按F0=Ft*10(t-121)/10计算,F0要大于8,在160—170

度是短时间就能做到的，为什么干热灭菌要两小时以上呢？

答：湿热灭菌和干热灭菌的效果是不同的，饱和蒸汽的穿透

性比干热空气穿透强得多，蒸汽冷凝时放出的潜热传给待灭菌品，

使之升温并使待灭菌品所带的微生物尤其是表面的微生物发生水

合作用，从而加速了它们的死亡。所以在达到同样灭菌效果的前

提下，湿热灭菌所需要的时间要短得多。

(公式F0=Ft*10(t-121)/10只适合于湿热灭菌，F0系

T=121℃及Z=10℃下的FT值。如果把121℃理解为“标准状

态”，那么F0可理解为“标准灭菌值”)

17、问：验证是不是要3批样品的一次，还是一批样品的3

次，还是3次样品3次得实验？

答：

1)、验证的目的，是要考察实验方法的可行性(避免出现假

阳性、假阴性)，

2)、在样品的药物组成、成份、给药途径一致的前提下，验

证时，“同一个批号的做3次''或"3个批号的各做一次“，均

可。

18、问：做实验的好习惯是什么？

答：1).实验前后清洁洗手，完毕清理实验现场，器皿洗净

归原，仪器等电源关闭。

2).试剂、样品标签详细准确，包括剂量，规格，时间，实

验人员等等；实验记录详细准确，以便备查和分析。

3).提前分析实验内容及步骤，准备好全部的试剂及相应工

具、仪器，不懂或者有疑问的步骤和地方问清楚，重点难点重点

标出，做到心中有数；实验完毕及时分析。

4).科学计划、合理分配时间，做到忙而不乱。实验中仔细

观察试验过程，及时记录可疑或者需要注意的地方。

5）.多读文献多与别人交流，开拓区路，改进方案，对于实

验的进展及方向做到一定的把握。

19、问：限度检查所用器皿用自来水洗后一定用纯化水再洗

吗？

答：GMP认证中关于QC的规程中”分析用玻璃器皿清洁规程

”要求如下

1.0目的提供玻璃器皿的清洁方法的文件指导。2.0范围化

验室部门所有玻璃器皿。3.0责任化验室人员。4.0程序4.1玻

璃器皿每次使用后，使用者必须使其清洁并放于固定位置备用。

4.2一般玻璃器皿清洁，用饮用水或去污剂洗涤后，器壁应不挂

水珠，再用少量纯化水冲洗器皿三次，放固定位置自然干燥。

4.3定量分析用玻璃器皿（如滴定管；移液管等）清洁，先把器

皿内的水沥掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段时间，放掉洗

液，用饮用水冲洗后，再用纯化水冲洗三次，倒置自然干燥。

4.4水分测定用的玻璃器皿清洁过程同1或2,清洁后置于

105107T洪箱内烘干。然后存放于干燥器中。

20、问：洁净室甲醛气体熏蒸消毒验证方案是什么？

答：

1）、甲醛消毒方法

在所有的消毒液中甲醛最常用。当相对湿度在65%以上、温

度在24~4（TC时，甲醛气体的消毒效果最好，但若采用过多的甲

醛，会因聚合而析出白色粉未附在建筑物或设备表面。一般甲醛

的消毒方法如下：

A：消毒前先用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗房间建筑物

和设备表面，然后用5%麝香草酚溶液喷酒或擦洗，静置1小时

后，再用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗一次。

B：计算体积（包括房间及风管体积），按10ml/m3的比例

准备浓度为3696的甲醛溶液（甲醛密度为1.lg/ml）,按

2〜3g/m3的比例准备高镒酸钾溶液。

C：在房间中放入试验装置，如不锈钢培养皿支架；直径

90mm双碟玻璃培养皿；枯草杆菌试纸，每张试纸上枯草杆菌数

量为1*106个，每个培养皿中放2张试纸，1张做无菌试验，1

张做含菌数试验。培养皿的数量应根据房间面积确定。

D：消毒流程：在不锈钢容器中加入高镒酸钾，用双层纱布

盖住桶口，再倒入36%浓度的甲醛溶液甲醛气体扩散（约

30min）启动空调器让甲醛气体循环（约20min）关闭通风系

统，房间熏蒸消毒，不少于7hr房间排气，用新鲜空气置换（约

2hr）开启空调系统用75%酒精喷酒环境。

E：质监部门取样培养。判断标准：试纸内枯草杆菌数量小

于1*103个为合格。

F：取样后用丝绸沾0.1%的新洁尔灭溶液擦洗机器表面；用

0.1%新洁尔灭溶液或l%GermWarfare溶液或75%酒精喷洒建筑物

四周。0.1%新洁尔溶液与l%GermWarfare溶液溶液每月轮换一

次。

2）、气体熏蒸灭菌后室内环境中残留量的测试

用甲醛气体进行熏蒸灭菌后，需用全新空气换气若小时，由

于甲醛的环境标准只有（「2）*10-6,要使环境中的残留的甲

醛浓度尽可能低至不致使人嗅出特殊气味(<0.55*10-6>,并对

眼睛无刺激(<1*10-6>,然后根据测定的室内环境中甲醛残留

量的结果，正确设定换气时间，以保证在达到作业环境中无菌的

前提下，对人身心健康不致产生不良影响。

(1)取样方法及取样量

在各取样场所，用约30L的塑料袋收集室内空气，将袋内空

气用吸收瓶、泵、气流计等组成的装置捕集至瓶内吸收液中(样

本数应呈3)。

(2)供试液的配制

取0.5%硼酸溶液20ml作为吸收液，用溶液吸收法，以

lL/min的速度分另」让各取样场所的空气通过lOmin,然后将吸

收液移至25.0ml的容量瓶中，加水使成25.0ml,即得。

(3)试验操作

A：取供试液2.0ml至带栓试管中，加5moi/L的NaOH溶液

2.0011及人用仃溶液2.0川1,轻摇数次混匀后，室温放置20min。

然后加灯04溶液2.01111,摇2〜5min至无气流生成为止；同时用

水2.0ml同法制成对照液，在波长550nm附近测最大吸光度。

B：分别取甲醛标准液0、0.5、1.CL1.5、2.0ml,加水使

成2.0ml,然后按A操作，测定吸光度，制出甲醛浓度

(ug/ml)与吸光度的关系检量线。

环境中的甲醛浓度(10-6)可由下式求出：

22.4273+t

甲醛浓度(10-6)=aX--------------------X25X--------------

30.03273V

式中a------供试液中甲醛浓度，

V----采样气体量，L

t----采样时平均温度，℃

22.4-----Imol气体在0、1个大气压(101.325kPa)下

的体积，L；

30.03——甲醛相对分子质量；

25-----供试液全量，ml。

(4)试液准各

A：甲醛标准液

a甲醛稀释液：精取中国药典中规定“甲醛溶液”1ml,加水

准确至200nli作为甲醛稀释液.精取10ml至碘瓶内，确加入

0.lmol/L碘液50ml,加lmol/L氢氧化锂溶液20ml。避光放置

15min后，加15ml的10%硫酸，用硫代硫酸钠液(0.lmol/L)

滴定。另用水10ml进行空白试验。

(Va-Vb)XI.5013

甲醛稀释液中的甲醛浓度(mg/ml)二--------------------

10

式中Va------甲醛稀释液消耗0.lmol/L硫代硫酸钠液量,

ml；

Vb-----空白试验消耗0.lmol/L硫代硫酸钠液量，ml；

1.5013------1ml碘液(0.lmol/L)相对甲醛的量,mg；

10-------甲醛稀释液取样量,mlo

b：甲醛标准液：精取甲醛稀释液，加水准确稀释1000

倍，即得。

B：AHMT溶液

取4-氨基-3-腓-5-疏基-1,2,4-三嗖0.5g,加0.2mol/L

盐酸100ml溶解，避光保存。需要说明的是，用甲醛消毒时也

有不加高镒酸钾，而将甲醛直接放入空调器内送入房间及用氨水

中和的方法。不管采用什么方法，只要经过验证是可行的，都可

以使用。

关键词：洁