备课素材：引物与限制酶的选择方法-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

引物与限制酶的选择方法一、PCR引物设计例1、土壤盐渍化影响水稻生长发育.将水稻耐盐碱基因OsMYB56导人不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，图1过程①PCR扩增0s-MYB56需要添加引物，应选用的引物组合为（）A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3'分析：1、明确模板链的方向(含游离磷酸基团即为5'端，-OH端为3，端);2、扩增方向即为引物延伸方向(5'端→3'端);引物应与模板链3'端结合;3、引物与模板链严格遵循碱基互补配对原则（上方模板连碱基序列自己求）

答案:A例2、图3是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒PO具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr).请回答下列问题：为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定.图4所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是.

分析:分析图可知两种引物的扩增方向应相反，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，都能扩增大量片段，不符合要求;如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。

答案:乙、丙

例3、人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶.研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达,获得具有较好溶解性的乙醛脱氢酶2.所用质粒和操作过程如图6、图7.其中,Amp'为氨苄青霉素抗性基因,Tet'为四环素抗性基因.改造后的ALDH2基因编码区首端到末端(其中一条链)的序列为:5’-ATCCATGCGGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGTAGCG-3'.四种限制酶的识别序列及切割位点见表3.请回答下列问题：为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用（符合题意）的一对引物是（选填数字序号)①5'-TCTAGAATCCATGCGCTC-3②5'-TCTAGACGCTACTCACTG-3'③5'-CTGCAGATCCATGCGCTC-3'④5'-GGATCCCGCTACTCACTG-3'⑤5'-GGATCCATCCATGCGCTC-3'⑥5'-CTCGAGCGCTACTCACTG-3'分析：本题涉及基因表达载体的构建,为了更精确地构建基因表达载体，往往扩增目的基因时会在引物的5'端添加酶切位点,此时引物的碱基序列可以按照以下几个步骤设计:①正确选择限制酶(根据题意改造后的大肠杆菌抗四环素,因此选择限制酶BamHI和XbaI)②明确目的基因插入方向(从首端到末端逆时针插入)③扩增目的基因的引物5'端添加相应酶切位点(首端处的引物添加BamHI识别序列,末端处的引物添加XbaI识别序列)。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。根据ALDH2基因编码区首端到末端的序列为5'-ATCCATGCGGCTC……CAGTGTAGCG-3'，可推测得到的脱氧核苷链为（加）5'-TCTAGACGCTACACTG-3'，（加）5'-GGATCCATCCATGCGGCTC-3'，即②⑤符合题意。

答案:②⑤

二、限制酶的选择

1、根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

(2)不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。

(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)2.根据质粒的特点确定限制酶的种类例1.(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()

A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接

B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接

C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接

D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接

答案：C

分析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coliDNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；

酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。

例2、如图1所示某科学家欲将某生物中的目的基因(图1甲)和大肠杆菌质粒载体(图1乙),进行拼接构建重组DNA(图1丙),限制酶的酶切位点见下表1.下列分析合理的是().A.用EcoRI切割甲和乙B.B.用BglⅡ和EcoRI切割甲和乙C.用BglⅡ和Sau3AI切割甲和乙D.用EcoRI和Sau3AI切割甲和乙分析：若用EcoRI切割目的基因和大肠杆菌质粒载体,会产生相同的黏性末端,根据“无反向连接”原则,用DNA连接酶连接时目的基因和大肠杆菌质粒载体会发生反向连接,则A错误;用BglⅡ和EcoRI切割目的基因会产生两种DNA片段,则B错误;BglⅡ和Sau3AI属于同尾酶,用BglI和Sau3AI切割目的基因和大肠杆菌质粒载体,同A选项,也会发生反向连接,只有用EcoRI和Sau3AI切割目的基因和大肠杆菌质粒载体,产生不同的黏性末端,防止发生反向连接,只有这样目的基因与大肠杆菌载体连接后,目的基因的转录方向和图丙相同,确保目的基因能正确表达,则C错误;D符合。例3、限制酶的酶切位点和基因工程中用到的含目的基因(抗虫基因)的DNA.表2中列举了4种限制酶的识别序列和酶切位点.回答下列问题.

(1)将图2和图3中的DNA拼接成重组质粒时,若选择同一种酶切割含目的基因的DNA和质粒,则这种酶应该是

;为了防止目的基因和质粒的自身环化,应各用两种酶切割含目的基因的DNA和质粒(充分酶解),选择的限制酶可以分别是Sau3AI和___、HindⅢ和__.答案：HindⅢ

HindⅢ

BamHI分析：图3中目的基因的两端都有HindIⅢ的识别位点,图2中质粒的启动子和终止子内也有HindⅢ的识别位点,根据题意选择同一种酶切割含目的基因的DNA和质粒,所以可以用HindⅢ切割含目的基因(抗虫基因)的DNA和质粒;为了防止目的基因和质粒的自身环化,应该选用两种酶切割目的基因和质粒,由于限制酶Sau3AI和BamHI酶切割以后产生相同的黏性末端,Sau3AI和BamHI属于同尾酶，故