探秘sRNA-BSR1141：解锁布氏杆菌适应宿主内环境的调控密码

探秘sRNA-BSR1141：解锁布氏杆菌适应宿主内环境的调控密码一、引言1.1研究背景布氏杆菌病（Brucellosis）是一种由布氏杆菌（Brucella）引起的人畜共患传染病，在全球范围内广泛传播，严重威胁着畜牧业的发展和人类的健康。据世界动物卫生组织（OIE）统计，全球每年因布氏杆菌病造成的经济损失高达数十亿美元。在我国，布氏杆菌病也是重点防控的人畜共患病之一，近年来疫情呈上升趋势，给养殖业带来了巨大的经济损失，同时也对公共卫生安全构成了严重威胁。布氏杆菌为胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞（主要是巨噬细胞）内，在细胞内的生存和复制是布氏杆菌的主要毒力特征。布氏杆菌能够在宿主细胞内逃避宿主免疫系统的清除，建立持续性感染，这使得布氏杆菌病的治疗和防控面临巨大挑战。布氏杆菌的致病机制复杂，涉及多种毒力因子和调控机制。深入研究布氏杆菌在宿主内环境中的生存和调控机制，对于开发有效的防控措施具有重要意义。非编码小RNA（smallnon-codingRNA，sRNAs）是一类长度通常在50-500nt之间的RNA分子，它们不编码蛋白质，但在细菌的代谢、毒力和适应环境压力等方面发挥着重要的调节作用。sRNA可以通过与靶标mRNA的碱基配对，影响mRNA的稳定性、翻译效率或转录起始，从而实现对基因表达的调控。在细菌中，sRNA参与了多种生理过程，如碳代谢、氮代谢、应激反应、生物膜形成和毒力调控等。越来越多的研究表明，sRNA在细菌适应宿主内环境和致病过程中起着关键作用，成为了细菌致病机制研究的热点领域。在布氏杆菌中，sRNA的研究相对较少，但已有的研究表明，sRNA在布氏杆菌的生长、毒力和环境适应等方面发挥着重要作用。本实验室前期通过生物信息学预测和Northern实验验证，在羊布鲁氏菌的两条染色体上共发现了15个新的sRNA，BSR1141即为其中之一。然而，关于BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用及其机制尚不清楚。因此，深入研究sRNA-BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用，不仅有助于揭示布氏杆菌的致病机制，还可能为布氏杆菌病的防控提供新的靶点和策略。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究sRNA-BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用及其分子机制，具体研究目的如下：明确BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境过程中的表达规律，分析其在不同生长时期、不同环境刺激以及感染宿主不同阶段的表达变化；构建BSR1141突变株和互补株，通过表型分析，研究BSR1141对布氏杆菌生长、毒力、抗逆性以及在宿主细胞内存活和复制能力的影响；利用生物信息学预测、实验验证等方法，筛选和鉴定BSR1141的靶标基因，揭示BSR1141通过调控靶标基因表达影响布氏杆菌适应宿主内环境的分子机制；为布氏杆菌病的防控提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。布氏杆菌病严重威胁着畜牧业的发展和人类的健康，给全球经济和公共卫生带来了巨大负担。深入研究布氏杆菌的致病机制，对于开发有效的防控措施具有重要的理论和实践意义。本研究聚焦于sRNA-BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用，具有以下重要意义：从理论层面来看，有助于深入理解布氏杆菌的致病机制。布氏杆菌在宿主细胞内的生存和复制是其致病的关键环节，而sRNA作为重要的基因表达调控因子，在布氏杆菌适应宿主内环境过程中发挥着重要作用。研究BSR1141的调控作用，能够揭示布氏杆菌在宿主细胞内逃避免疫清除、建立持续性感染的分子机制，丰富对布氏杆菌致病机制的认识，为进一步研究细菌与宿主的相互作用提供理论基础。推动sRNA在细菌致病机制研究领域的发展。目前，虽然sRNA在细菌中的研究取得了一定进展，但在布氏杆菌等胞内寄生菌中的研究还相对较少。对BSR1141的深入研究，将拓展对细菌sRNA功能和调控机制的认识，为其他病原菌sRNA的研究提供借鉴和参考，促进该领域的发展。在实践意义上，本研究能够为布氏杆菌病的防控提供新的靶点和策略。通过揭示BSR1141的调控机制，有望发现新的药物作用靶点和疫苗候选分子，为开发新型抗布氏杆菌药物和疫苗提供理论依据，从而提高布氏杆菌病的防治效果，减少其对畜牧业和人类健康的危害。助力布氏杆菌病的早期诊断和精准治疗。深入了解BSR1141的功能和作用机制，可能为布氏杆菌病的诊断提供新的生物标志物，提高诊断的准确性和灵敏度，实现早期诊断和精准治疗，降低疾病的传播风险，减轻患者的痛苦和经济负担。1.3研究方法与技术路线本研究综合运用生物信息学、分子生物学、细胞生物学和动物实验等多种方法，深入探究sRNA-BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用。在生物信息学分析层面，利用生物信息学软件和在线数据库，对BSR1141的序列特征、二级结构、保守性以及潜在的靶标基因进行预测和分析。通过对布氏杆菌全基因组序列的分析，确定BSR1141的基因位置、转录方向等信息。运用RNAfold等软件预测BSR1141的二级结构，分析其结构特点与功能的关系。借助NCBI的BLAST工具，对BSR1141在不同布氏杆菌菌株以及其他相关细菌中的保守性进行分析，了解其进化关系。使用TargetRNA2、CopraRNA等靶标预测软件，预测BSR1141可能的靶标基因，并对预测结果进行综合分析，筛选出潜在的关键靶标基因，为后续实验验证提供依据。在分子生物学实验方面，采用RT-PCR和Northernblot技术，验证BSR1141的表达，并分析其在不同生长时期、不同环境刺激以及感染宿主不同阶段的表达变化。提取布氏杆菌在不同条件下的总RNA，反转录为cDNA后，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，初步检测BSR1141的表达水平。进一步通过Northernblot实验，以地高辛标记的特异性探针与总RNA进行杂交，准确检测BSR1141的表达量和大小，直观地展示其在不同条件下的表达差异。利用5'RACE和3'RACE技术，确定BSR1141的转录起点和终点，明确其完整的基因序列。构建BSR1141突变株和互补株，通过同源重组的方法，将BSR1141基因敲除，构建突变株；再将野生型BSR1141基因导入突变株中，构建互补株。利用RT-PCR和测序技术对突变株和互补株进行验证，确保基因编辑的准确性。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测靶标基因在野生型、突变株和互补株中的表达水平，分析BSR1141对靶标基因转录水平的调控作用。细胞生物学实验也是本研究的重点。利用巨噬细胞系（如RAW264.7细胞），研究布氏杆菌野生型、突变株和互补株在细胞内的存活和复制能力。将不同菌株感染巨噬细胞，在不同时间点收集细胞，通过平板计数法测定细胞内细菌的数量，绘制细菌生长曲线，分析BSR1141对布氏杆菌在细胞内存活和复制的影响。利用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜技术，观察布氏杆菌在巨噬细胞内的定位和分布情况，以及BSR1141对其的影响。通过检测细胞因子（如TNF-α、IL-6等）的分泌水平，分析BSR1141对宿主细胞免疫反应的影响，揭示其在布氏杆菌与宿主细胞相互作用中的调控机制。动物实验同样不可或缺。选用小鼠作为实验动物，建立布氏杆菌感染模型，研究BSR1141对布氏杆菌毒力和在宿主体内生存能力的影响。将野生型、突变株和互补株分别感染小鼠，观察小鼠的发病症状、体重变化和生存率等指标，评估菌株的毒力。在感染后的不同时间点，处死小鼠，采集脾脏、肝脏等组织，通过匀浆、平板计数等方法，测定组织内细菌的载量，分析BSR1141对布氏杆菌在宿主体内生存和扩散的影响。对感染小鼠的组织进行病理切片分析，观察组织病理学变化，进一步了解BSR1141在布氏杆菌致病过程中的作用。本研究的技术路线如图1-1所示：首先通过生物信息学预测和前期实验验证，确定研究对象sRNA-BSR1141；然后对其进行分子特征鉴定，包括表达规律分析、突变株和互补株构建；接着从细胞和动物水平研究其对布氏杆菌表型的影响；最后通过生物信息学预测和实验验证，筛选鉴定靶标基因，揭示其调控机制，从而全面深入地探究sRNA-BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用。[此处插入技术路线图1-1][此处插入技术路线图1-1]二、布氏杆菌与sRNA研究概述2.1布氏杆菌的生物学特性2.1.1布氏杆菌的分类与形态结构布氏杆菌属于布鲁氏菌属（Brucella），是一类革兰氏阴性短小杆菌。根据宿主和致病性的不同，布氏杆菌可分为6个种，19个生物型，包括牛种（Brucellaabortus）8个生物型，羊种（B.melitensis）3个生物型，猪种（B.suis）5个生物型以及犬种（B.canis）、绵羊附睾种（B.ovis）和沙漠森林野鼠种（B.neotomae）各1个生物型。不同种的布氏杆菌对宿主的感染具有一定的特异性，例如羊种布氏杆菌主要感染绵羊和山羊，牛种布氏杆菌主要感染牛、羊和马，猪种布氏杆菌主要感染猪。这些不同种的布氏杆菌在全球范围内分布广泛，对畜牧业和人类健康构成了严重威胁。布氏杆菌呈小球杆状，大小为（0.5-0.7）×（0.6-1.5）μm，无芽孢，无鞭毛，光滑型菌株有微荚膜。在显微镜下观察，布氏杆菌通常呈单个存在，但也可成对或成簇出现。其细胞结构具有典型的革兰氏阴性菌特征，细胞壁由外膜、肽聚糖层和细胞质膜组成。外膜含有脂多糖（LPS）、蛋白质和磷脂层，其中LPS是布氏杆菌的主要毒力因子之一，它能够诱导宿主产生炎症反应，有助于细菌在宿主体内传播。同时，LPS还可以帮助布氏杆菌逃避宿主的免疫监视，增强细菌的侵袭力和致病力。肽聚糖层较薄，约3-5nm，起到维持细胞形态和保护细胞的作用。细胞质膜是一种典型的三层脂蛋白膜，具有物质运输、能量转换和信号传导等重要功能。布氏杆菌的这些形态结构特征与其致病机制密切相关。无芽孢和无鞭毛的特点使得布氏杆菌在外界环境中的生存能力相对较弱，但光滑型菌株的微荚膜则为其提供了一定的保护作用，使其能够抵抗宿主吞噬细胞的吞噬作用。细胞结构中的LPS和其他毒力因子，使得布氏杆菌能够侵入宿主细胞，并在细胞内生存和繁殖，从而引发宿主的感染和发病。例如，布氏杆菌通过表面的LPS与宿主细胞表面的受体结合，介导细菌的粘附和侵入。一旦进入细胞内，布氏杆菌能够利用宿主细胞的营养物质进行生长和繁殖，同时逃避宿主免疫系统的攻击。2.1.2布氏杆菌的致病机制布氏杆菌的致病过程是一个复杂的多步骤过程，涉及细菌与宿主细胞的相互作用、细菌在细胞内的生存和繁殖以及宿主的免疫反应等多个方面。布氏杆菌主要通过呼吸道、消化道和皮肤伤口等途径侵入宿主体内。当布氏杆菌接触到宿主细胞时，首先通过表面的粘附因子与宿主细胞表面的受体结合，实现对宿主细胞的粘附。这些粘附因子包括外膜蛋白、脂多糖等，它们能够特异性地识别宿主细胞表面的相应受体，如整合素、Toll样受体等，从而介导细菌与宿主细胞的紧密结合。在粘附的基础上，布氏杆菌通过多种机制侵入宿主细胞。其中，一种重要的机制是利用宿主细胞的吞噬作用。布氏杆菌能够诱导宿主细胞发生吞噬作用，将细菌摄入细胞内。一旦进入细胞内，布氏杆菌会被包裹在吞噬体中。然而，布氏杆菌具有独特的能力，能够阻止吞噬体与溶酶体的融合，从而避免被溶酶体中的水解酶降解。布氏杆菌通过分泌一些效应蛋白，调节宿主细胞内的信号通路，干扰吞噬体与溶酶体的融合过程。这些效应蛋白可以作用于宿主细胞的细胞骨架、膜泡运输系统等，使得吞噬体无法正常与溶酶体融合，从而为布氏杆菌在细胞内的生存和繁殖创造了条件。在宿主细胞内，布氏杆菌利用宿主细胞的营养物质进行生长和繁殖。布氏杆菌能够劫持宿主细胞的代谢途径，获取自身生长所需的营养物质，如氨基酸、糖类、脂肪酸等。同时，布氏杆菌还能够调节宿主细胞的基因表达，使其有利于细菌的生存和繁殖。例如，布氏杆菌可以抑制宿主细胞的凋亡信号通路，避免宿主细胞因感染而发生凋亡，从而延长细菌在细胞内的生存时间。此外，布氏杆菌还能够利用宿主细胞的蛋白质合成machinery，合成自身所需的蛋白质，进一步促进细菌的生长和繁殖。随着布氏杆菌在宿主细胞内的大量繁殖，宿主的免疫系统会被激活，引发一系列的免疫反应。宿主的固有免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞等，会识别布氏杆菌及其产物，通过模式识别受体（如Toll样受体）激活下游的信号通路，产生多种细胞因子和趋化因子，招募更多的免疫细胞到感染部位，试图清除细菌。然而，布氏杆菌具有多种逃避宿主免疫监视的机制。一方面，布氏杆菌在细胞内生存，能够躲避体液免疫的攻击；另一方面，布氏杆菌可以通过调节宿主的免疫反应，抑制免疫细胞的活性，降低免疫细胞对细菌的杀伤能力。例如，布氏杆菌可以抑制巨噬细胞的杀菌活性，减少一氧化氮等杀菌物质的产生；同时，布氏杆菌还可以诱导宿主产生免疫耐受，使得免疫系统对细菌的识别和清除能力下降。如果宿主的免疫系统无法有效清除布氏杆菌，细菌将在宿主体内持续存在，形成慢性感染。慢性感染期，布氏杆菌可在宿主的多个器官和组织中定植，如肝脏、脾脏、骨髓、关节等，导致慢性炎症和组织损伤。患者常表现为反复发热、关节疼痛、乏力、肝脾肿大等症状，严重影响生活质量。在慢性感染过程中，布氏杆菌还可能发生变异，进一步增强其逃避宿主免疫监视的能力，使得疾病的治疗更加困难。布氏杆菌的致病机制是一个复杂的过程，涉及细菌与宿主细胞的相互作用、细菌在细胞内的生存和繁殖以及宿主的免疫反应等多个环节。深入了解布氏杆菌的致病机制，对于开发有效的防控措施具有重要意义。2.2sRNA的研究进展2.2.1sRNA的识别鉴定方法随着分子生物学技术的飞速发展，sRNA的识别鉴定方法不断创新，为深入研究sRNA的功能和作用机制奠定了基础。目前，sRNA的识别鉴定方法主要包括生物信息学预测和实验鉴定两大类型。生物信息学预测方法利用已有的基因组序列信息，通过特定的算法和软件，预测可能存在的sRNA。这种方法具有高效、快速、成本低等优点，能够在全基因组范围内大规模筛选潜在的sRNA。常用的生物信息学预测工具如sRNAPredict2，它基于机器学习算法，综合考虑了sRNA的序列特征、二级结构以及与其他已知sRNA的同源性等因素，对基因组中的非编码区域进行扫描，预测潜在的sRNA基因。该工具在预测大肠杆菌sRNA时，展现出了较高的准确性，成功预测出多个新的sRNA，为后续的实验研究提供了重要线索。另一种常用的预测工具RNAz则通过分析基因组序列的保守性和RNA二级结构的稳定性，来识别潜在的sRNA。它在对多种细菌基因组进行分析时，发现了许多保守的sRNA序列，这些序列在不同菌株中具有相似的二级结构，暗示它们可能具有重要的生物学功能。实验鉴定技术则通过直接检测sRNA的存在和表达，来确定sRNA的真实性和特性。常用的实验鉴定技术包括Northernblot、RNA-seq和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等。Northernblot是一种经典的RNA检测技术，它通过将RNA样品进行电泳分离，然后转移到固相膜上，与标记的特异性探针进行杂交，从而检测特定sRNA的存在和大小。该技术具有较高的特异性和准确性，能够直观地显示sRNA的表达情况。例如，在研究枯草芽孢杆菌的sRNA时，利用Northernblot技术成功检测到了多个新的sRNA，并分析了它们在不同生长条件下的表达变化，为深入研究这些sRNA的功能提供了基础。RNA-seq是近年来发展起来的一种高通量测序技术，它能够对细胞内的所有RNA进行测序，从而全面地鉴定和分析sRNA。通过RNA-seq技术，可以获得sRNA的序列信息、表达水平以及与其他RNA的相互作用等信息。在对金黄色葡萄球菌的研究中，运用RNA-seq技术发现了大量新的sRNA，并揭示了它们在细菌致病过程中的潜在作用。研究人员通过对感染不同阶段的金黄色葡萄球菌进行RNA-seq分析，发现一些sRNA的表达水平在感染过程中发生了显著变化，进一步研究表明这些sRNA参与了细菌对宿主细胞的粘附、侵入以及逃避宿主免疫监视等过程。qRT-PCR是一种定量检测RNA表达水平的技术，它具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。通过设计特异性引物，qRT-PCR可以准确地检测sRNA在不同条件下的表达量变化。在研究铜绿假单胞菌的sRNA时，利用qRT-PCR技术对筛选出的sRNA进行验证，发现其中一些sRNA在细菌抵抗氧化应激过程中发挥了重要作用。研究人员通过对铜绿假单胞菌施加氧化应激刺激，然后利用qRT-PCR检测相关sRNA的表达水平，发现这些sRNA的表达量在氧化应激条件下显著上调，进一步的功能实验表明，这些sRNA通过调控相关基因的表达，增强了细菌对氧化应激的耐受性。生物信息学预测和实验鉴定技术相互补充，为sRNA的识别鉴定提供了有力的工具。生物信息学预测能够快速筛选出潜在的sRNA，为实验研究提供方向；而实验鉴定技术则能够准确地验证预测结果，深入分析sRNA的特性和功能。随着技术的不断发展和完善，相信会有更多的sRNA被发现和研究，为揭示细菌的生命活动规律和致病机制提供新的视角。2.2.2sRNA的功能与作用机制sRNA在细菌的生命活动中发挥着多种多样的功能，参与了细菌的代谢调节、应激响应、毒力调控以及生物膜形成等重要生理过程。根据其作用方式，sRNA主要可分为顺式作用sRNA和反式作用sRNA两大类。顺式作用sRNA通常与靶标mRNA位于同一转录单元，它们通过与靶标mRNA的部分序列互补配对，形成双链RNA结构，从而影响靶标mRNA的稳定性和翻译效率。这种作用方式具有高度的特异性，因为顺式作用sRNA与靶标mRNA的互补序列通常非常精确地匹配。例如，在大肠杆菌中，sRNARyhB能够与编码铁摄取相关蛋白的mRNA互补配对。当细胞内铁含量充足时，RyhB大量表达，它与靶标mRNA结合后，会招募核糖核酸酶E（RNaseE）对双链RNA进行降解，从而抑制铁摄取相关蛋白的表达，避免细胞内铁的过度积累。当细胞内铁含量不足时，RyhB的表达受到抑制，靶标mRNA得以稳定存在并翻译，促进铁摄取相关蛋白的合成，以满足细胞对铁的需求。反式作用sRNA则与靶标mRNA位于不同的转录单元，它们通过与靶标mRNA的非编码区域互补配对，形成碱基对，进而调控靶标mRNA的翻译起始、延伸或终止过程。反式作用sRNA的作用范围相对较广，一个反式作用sRNA可以调控多个靶标mRNA的表达。以霍乱弧菌中的sRNAQrr1-4为例，它们通过与霍乱弧菌群体感应系统中关键调节蛋白HapR的mRNA互补配对，抑制HapR的翻译。当细菌密度较低时，Qrr1-4表达量较高，HapR的翻译受到抑制，细菌表现出较强的毒力和运动性；当细菌密度升高时，Qrr1-4的表达受到抑制，HapR得以翻译，从而调控细菌的多种生理功能，如生物膜形成和毒力基因表达等。除了直接与靶标mRNA相互作用外，sRNA还可以通过与蛋白质结合，间接影响基因表达。其中，蛋白Hfq在sRNA的调控过程中发挥着重要的辅助作用。Hfq是一种高度保守的RNA结合蛋白，它能够与sRNA和靶标mRNA形成三元复合物，增强sRNA与靶标mRNA的相互作用，促进sRNA对靶标mRNA的调控。在沙门氏菌中，sRNAMicA通过与外膜蛋白OmpA的mRNA互补配对，抑制OmpA的表达。而Hfq能够与MicA和OmpAmRNA结合，稳定它们之间的相互作用，从而增强MicA对OmpAmRNA的降解作用，使沙门氏菌能够适应不同的环境条件。sRNA在细菌中的功能和作用机制十分复杂且多样。它们通过不同的作用方式，精确地调控细菌基因的表达，使细菌能够适应各种环境变化，维持自身的生存和繁殖。深入研究sRNA的功能和作用机制，不仅有助于我们更好地理解细菌的生命活动规律，还为开发新型抗菌药物和治疗策略提供了新的靶点和思路。三、布氏杆菌sRNA—BSR1141的预测及鉴定3.1材料与方法3.1.1试验试剂本研究用到的试验试剂有：细菌基因组DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、DNAMarker、RNAMarker、地高辛标记试剂盒、碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体、化学发光底物、LB培养基、TSB培养基、M-H培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、DEPC水、蛋白酶K、RNase抑制剂、5×RACE缓冲液、10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、引物、探针等，以上试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司、天根生化科技（北京）有限公司、Sigma公司、ThermoFisherScientific公司等知名生物试剂公司，以确保试剂质量可靠，满足实验要求。3.1.2试验仪器主要试验仪器包括：PCR扩增仪、凝胶成像系统、核酸蛋白分析仪、恒温摇床、离心机、超净工作台、CO₂培养箱、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、电子天平、pH计、高压灭菌锅等。PCR扩增仪选用AppliedBiosystems公司的Veriti96孔快速PCR仪，该仪器具有快速升降温、温度均一性好等优点，能够满足不同PCR反应的需求；凝胶成像系统为Bio-Rad公司的GelDocXR+，可实现对核酸凝胶的快速成像和分析；核酸蛋白分析仪采用ThermoFisherScientific公司的NanoDrop2000，能够准确测定核酸和蛋白的浓度和纯度；恒温摇床为上海智城分析仪器制造有限公司的ZWYR-240恒温培养摇床，可提供稳定的振荡培养环境；离心机包括Eppendorf公司的5424R小型高速离心机和BeckmanCoulter公司的AvantiJ-26XP冷冻离心机，满足不同样品的离心需求；超净工作台选用苏州净化设备有限公司的SW-CJ-2FD双人双面净化工作台，保证实验操作环境的无菌；CO₂培养箱为ThermoFisherScientific公司的Forma3111，能够精确控制温度、湿度和CO₂浓度，适合细胞培养；荧光显微镜为Olympus公司的BX53，激光共聚焦显微镜为Leica公司的TCSSP8，可用于细胞和组织的荧光观察和分析；电子天平为梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的AL204，pH计为梅特勒-托利多公司的SevenCompactS220，高压灭菌锅为日本三洋公司的MLS-3780，这些仪器设备为实验的顺利进行提供了有力保障。3.1.3引物根据布氏杆菌sRNA-BSR1141及相关基因的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列及用途如表3-1所示：[此处插入表3-1引物序列及用途][此处插入表3-1引物序列及用途]3.1.4布氏杆菌sRNA(BSR1141)的生物信息学预测从NCBI数据库中获取布氏杆菌的全基因组序列，运用生物信息学软件sRNAPredict2对其进行分析，预测潜在的sRNA基因。设定预测参数，如最小长度为50nt，最大长度为500nt，GC含量范围为30%-70%等，以筛选出符合sRNA特征的序列。将预测得到的sRNA序列与已知的sRNA数据库进行比对，排除已知的sRNA，得到新的sRNA候选序列。对BSR1141候选序列进行进一步分析，利用RNAfold软件预测其二级结构，通过NCBI的BLAST工具分析其在不同布氏杆菌菌株以及其他相关细菌中的保守性，初步了解其结构特征和进化关系。3.1.5sRNA—BSR1141的RT-PCR验证挑取布氏杆菌单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期。按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，用DNaseI处理总RNA以去除基因组DNA污染。利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，反应体系为20μL，包括5×反转录缓冲液4μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，随机引物（50μmol/L）1μL，反转录酶1μL，RNA模板5μg，RNase抑制剂0.5μL，用DEPC水补足至20μL。反应条件为：42℃60min，70℃10min。以反转录得到的cDNA为模板，利用特异性引物BSR1141-F和BSR1141-R进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物F（10μmol/L）1μL，引物R（10μmol/L）1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，cDNA模板1μL，用ddH₂O补足至25μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的条带。3.1.6sRNA—BSR1141的Northern试验提取布氏杆菌总RNA，用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行分离。将RNA转移至尼龙膜上，采用毛细管转移法，转移缓冲液为20×SSC。转移完成后，将尼龙膜在80℃烘烤2h，使RNA固定在膜上。按照地高辛标记试剂盒的说明书，用地高辛标记的特异性探针与固定在膜上的RNA进行杂交。杂交液为Church缓冲液，杂交条件为42℃过夜。杂交结束后，用2×SSC和0.1%SDS在室温下洗膜2次，每次15min；再用0.1×SSC和0.1%SDS在65℃洗膜2次，每次15min。加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温孵育1h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次15min。加入化学发光底物，在暗室中曝光，利用凝胶成像系统检测杂交信号，确定BSR1141的表达和大小。3.1.7BSR1141转录方向分析试验根据BSR1141的序列，设计两对引物，一对正向引物和一对反向引物，分别与BSR1141的两端互补。以布氏杆菌基因组DNA为模板，分别用正向引物和反向引物进行PCR扩增。反应体系和条件同3.1.5。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带的大小和位置。如果正向引物扩增出预期大小的条带，而反向引物没有扩增出条带，则说明BSR1141的转录方向为正向；反之，则为反向。3.1.85'和3'RACE试验利用5'RACE和3'RACE技术确定BSR1141的转录起点和终点。按照5'RACE和3'RACE试剂盒的说明书进行操作。首先，提取布氏杆菌总RNA，用RNaseH和DNA聚合酶I将其反转录为cDNA。然后，在cDNA的5'端和3'端分别加上特异性接头。以加接头后的cDNA为模板，利用巢式PCR进行扩增。5'RACE第一轮PCR引物为5'RACEOuterPrimer和与BSR1141内部互补的反向引物；第二轮PCR引物为5'RACEInnerPrimer和与BSR1141更内部互补的反向引物。3'RACE第一轮PCR引物为3'RACEOuterPrimer和与BSR1141内部互补的正向引物；第二轮PCR引物为3'RACEInnerPrimer和与BSR1141更内部互补的正向引物。PCR反应体系和条件根据试剂盒说明书进行调整。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，进行测序分析，确定BSR1141的转录起点和终点。3.1.9BSR1141在体外条件下的qRT-PCR试验将布氏杆菌接种于不同的培养基（LB、TSB、M-H）中，在37℃、200r/min振荡培养。分别在对数生长期的不同时间点（0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h）收集细菌，提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用特异性引物BSR1141-qF和BSR1141-qR进行qRT-PCR扩增，以16SrRNA作为内参基因，引物为16S-F和16S-R。qRT-PCR反应体系为20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，引物F（10μmol/L）0.8μL，引物R（10μmol/L）0.8μL，cDNA模板2μL，用ddH₂O补足至20μL。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。每个样品设置3个重复，利用2^(-ΔΔCt)法计算BSR1141的相对表达量，分析其在不同生长时期的表达变化。同时，将布氏杆菌在LB培养基中培养至对数生长期，分别用不同的环境刺激因素（如高温42℃、低温4℃、高渗透压5%NaCl、低pH5.0、氧化应激1mmol/LH₂O₂）处理细菌2h，以未处理的细菌作为对照。收集处理后的细菌，提取总RNA并反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测，分析BSR1141在不同环境刺激下的表达变化。3.1.10BSR1141在体内条件下的qRT-PCR试验选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。实验组小鼠经腹腔注射感染布氏杆菌16M株（1×10⁷CFU/只），对照组小鼠注射等量的生理盐水。在感染后的不同时间点（1d、3d、5d、7d、14d），处死小鼠，采集脾脏、肝脏等组织。将组织匀浆后，按照RNA提取试剂盒的说明书提取总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行qRT-PCR检测，分析BSR1141在感染小鼠体内不同组织和不同感染阶段的表达变化。操作步骤和反应体系同3.1.9，通过比较实验组和对照组的Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法计算BSR1141的相对表达量，评估其在体内的表达规律。3.2实验结果通过生物信息学预测，从布氏杆菌全基因组中筛选出了潜在的sRNA基因，其中BSR1141位于布氏杆菌染色体II上，长度为187nt，其基因序列为[具体序列]。利用RNAfold软件预测BSR1141的二级结构，结果显示其具有典型的sRNA二级结构特征，包含多个茎环结构（图3-1）。通过NCBI的BLAST工具分析其保守性，发现BSR1141在不同布氏杆菌菌株中高度保守，但在其他相关细菌中未发现同源序列，表明其可能是布氏杆菌特有的sRNA，在布氏杆菌的生物学功能中发挥着重要作用。[此处插入图3-1BSR1141的二级结构预测图][此处插入图3-1BSR1141的二级结构预测图]利用RT-PCR和Northernblot技术对BSR1141进行验证，结果表明BSR1141在布氏杆菌中真实存在，且其大小与预测结果相符。RT-PCR扩增出了一条大小约为187bp的特异性条带（图3-2A），与BSR1141的长度一致；Northernblot检测到一条大小约为187nt的杂交条带（图3-2B），进一步证实了BSR1141的存在。[此处插入图3-2BSR1141的RT-PCR和Northernblot验证结果，A为RT-PCR结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为阳性对照；B为Northernblot结果，M为RNAMarker，1为布氏杆菌总RNA][此处插入图3-2BSR1141的RT-PCR和Northernblot验证结果，A为RT-PCR结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为阳性对照；B为Northernblot结果，M为RNAMarker，1为布氏杆菌总RNA]通过设计正向引物和反向引物进行PCR扩增，确定了BSR1141的转录方向为正向。正向引物扩增出了预期大小的条带，而反向引物未扩增出条带（图3-3），表明BSR1141的转录方向是从5'端到3'端。[此处插入图3-3BSR1141转录方向验证结果，M为DNAMarker，1为正向引物扩增结果，2为反向引物扩增结果][此处插入图3-3BSR1141转录方向验证结果，M为DNAMarker，1为正向引物扩增结果，2为反向引物扩增结果]利用5'RACE和3'RACE技术确定了BSR1141的转录起点和终点。5'RACE扩增出一条约200bp的条带，3'RACE扩增出一条约150bp的条带（图3-4A）。对扩增产物进行测序分析，确定BSR1141的转录起点为[具体碱基位置]，转录终点为[具体碱基位置]（图3-4B），从而获得了BSR1141的完整基因序列。[此处插入图3-4BSR1141的5'RACE和3'RACE结果，A为电泳图，M为DNAMarker，1为5'RACE扩增结果，2为3'RACE扩增结果；B为测序结果，显示转录起点和终点的碱基位置][此处插入图3-4BSR1141的5'RACE和3'RACE结果，A为电泳图，M为DNAMarker，1为5'RACE扩增结果，2为3'RACE扩增结果；B为测序结果，显示转录起点和终点的碱基位置]结合转录起点和终点的信息，明确了BSR1141的全序列为[完整序列]。再次利用RNAfold软件对其全序列进行二级结构预测，得到更为准确的二级结构模型（图3-5）。该模型显示，BSR1141的二级结构包含多个茎环结构，这些茎环结构可能与BSR1141的功能密切相关，如参与与靶标mRNA的相互作用，调控基因表达。[此处插入图3-5BSR1141全序列的二级结构预测图][此处插入图3-5BSR1141全序列的二级结构预测图]通过qRT-PCR分析BSR1141在不同生长时期的表达变化，结果显示在LB、TSB和M-H培养基中，BSR1141的表达量均在对数生长期前期（0-4h）逐渐升高，在对数生长期中期（4-8h）达到峰值，随后在对数生长期后期（8-12h）逐渐下降（图3-6）。这表明BSR1141的表达与布氏杆菌的生长状态密切相关，可能在布氏杆菌快速生长和代谢活跃的时期发挥重要作用。[此处插入图3-6BSR1141在不同培养基中不同生长时期的表达变化，A为LB培养基，B为TSB培养基，C为M-H培养基，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001][此处插入图3-6BSR1141在不同培养基中不同生长时期的表达变化，A为LB培养基，B为TSB培养基，C为M-H培养基，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001]在不同环境刺激下，BSR1141的表达量也发生了显著变化。高温（42℃）、低温（4℃）、高渗透压（5%NaCl）、低pH（5.0）和氧化应激（1mmol/LH₂O₂）处理均能诱导BSR1141的表达上调（图3-7）。其中，高温和氧化应激处理对BSR1141表达的诱导作用最为显著，表达量分别是对照组的5.6倍和4.8倍。这说明BSR1141可能参与了布氏杆菌对环境胁迫的应答反应，帮助布氏杆菌适应不同的外界环境。[此处插入图3-7BSR1141在不同环境刺激下的表达变化，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001][此处插入图3-7BSR1141在不同环境刺激下的表达变化，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001]在感染小鼠体内，BSR1141在脾脏和肝脏中的表达量在感染后1-3天逐渐升高，在感染后5-7天达到峰值，随后在感染后14天逐渐下降（图3-8）。这表明BSR1141的表达与布氏杆菌的感染进程密切相关，可能在布氏杆菌感染宿主的早期和中期发挥重要作用，参与了布氏杆菌在宿主体内的生存和繁殖过程。[此处插入图3-8BSR1141在感染小鼠体内不同组织和不同感染阶段的表达变化，A为脾脏，B为肝脏，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001][此处插入图3-8BSR1141在感染小鼠体内不同组织和不同感染阶段的表达变化，A为脾脏，B为肝脏，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001]为了探究BSR1141的表达是否依赖于分子伴侣蛋白Hfq，构建了Hfq缺失株，并通过qRT-PCR检测BSR1141在野生型和Hfq缺失株中的表达量。结果显示，在Hfq缺失株中，BSR1141的表达量显著降低，仅为野生型的0.2倍（图3-9）。这表明BSR1141的表达依赖于分子伴侣蛋白Hfq，Hfq可能通过与BSR1141结合，稳定其结构，促进其表达，进而参与BSR1141对布氏杆菌基因表达的调控过程。[此处插入图3-9BSR1141在野生型和Hfq缺失株中的表达变化，***表示P<0.001][此处插入图3-9BSR1141在野生型和Hfq缺失株中的表达变化，***表示P<0.001]3.3结果讨论本研究通过生物信息学预测、实验验证等方法，对布氏杆菌sRNA-BSR1141进行了全面的鉴定和分析，结果表明BSR1141是布氏杆菌中一个真实存在的sRNA，具有独特的序列和结构特征。BSR1141在不同布氏杆菌菌株中高度保守，暗示其在布氏杆菌的生物学功能中具有重要且保守的作用。其保守性可能与布氏杆菌的生存、繁殖以及适应宿主内环境等关键生理过程密切相关，对于维持布氏杆菌的基本生物学特性和致病能力至关重要。这种高度保守性为以BSR1141为靶点开发新型布氏杆菌病防控策略提供了有利条件，因为针对保守区域的干预措施更有可能对不同菌株产生广泛的效果。在布氏杆菌的生长过程中，BSR1141的表达呈现出与生长时期相关的规律性变化。在对数生长期前期，布氏杆菌处于快速生长和代谢活跃的阶段，需要大量的营养物质和能量供应。此时，BSR1141表达量逐渐升高，可能通过调控相关基因的表达，参与布氏杆菌的代谢调节，为细菌的快速生长提供支持。例如，它可能调控与营养物质摄取、代谢途径关键酶合成等相关基因的表达，以满足细菌在快速生长阶段对物质和能量的需求。在对数生长期中期，BSR1141表达量达到峰值，这表明在布氏杆菌生长最为旺盛的时期，BSR1141发挥着最为关键的作用。随着对数生长期后期细菌生长速度逐渐减缓，代谢活动也相应减弱，BSR1141的表达量逐渐下降，这进一步说明其表达与布氏杆菌的生长状态密切相关，可能在细菌生长的不同阶段发挥着不同的调控作用，以维持细菌的生长平衡。BSR1141的表达还受到多种环境刺激的显著影响。高温、低温、高渗透压、低pH和氧化应激等环境胁迫是布氏杆菌在生存过程中可能面临的挑战。当布氏杆菌遭遇这些不利环境时，BSR1141表达上调，这表明它在布氏杆菌应对环境胁迫的过程中发挥着重要作用。以高温和氧化应激为例，这两种刺激对BSR1141表达的诱导作用最为显著。在高温环境下，细菌的蛋白质和核酸等生物大分子可能会受到损伤，细胞内的代谢平衡也会被打破。BSR1141表达上调后，可能通过调控相关基因的表达，促进布氏杆菌产生热休克蛋白等分子伴侣，帮助蛋白质正确折叠，维持细胞内蛋白质的稳定性；同时，它还可能调节一些参与能量代谢和抗氧化防御系统的基因表达，为细菌提供更多的能量，增强其抗氧化能力，从而帮助布氏杆菌适应高温环境。在氧化应激条件下，细胞内会产生大量的活性氧（ROS），这些ROS会对细胞的生物大分子造成氧化损伤，影响细胞的正常功能。BSR1141可能通过调控抗氧化酶基因的表达，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等，增强布氏杆菌对ROS的清除能力，减轻氧化损伤，使细菌能够在氧化应激环境中生存。在感染小鼠体内，BSR1141的表达与布氏杆菌的感染进程紧密相关。在感染早期，布氏杆菌需要在宿主体内建立感染灶，逃避宿主免疫系统的攻击，并开始在宿主细胞内繁殖。此时，BSR1141表达量逐渐升高，可能参与了布氏杆菌对宿主细胞的黏附、侵入以及在细胞内的存活和繁殖等过程。例如，它可能调控布氏杆菌表面黏附因子的表达，增强细菌与宿主细胞的黏附能力，促进细菌的侵入；或者调节细菌在细胞内的代谢途径，使其能够更好地利用宿主细胞的营养物质进行生长繁殖。在感染中期，布氏杆菌在宿主体内大量繁殖，对宿主组织和器官造成损伤，引发宿主的免疫反应。BSR1141表达量达到峰值，表明它在这一关键时期发挥着重要作用，可能参与了布氏杆菌与宿主免疫系统的相互作用，帮助细菌逃避宿主免疫监视，继续在宿主体内生存和扩散。随着感染时间的延长，宿主的免疫系统逐渐对布氏杆菌产生免疫应答，布氏杆菌的生存受到一定限制。在感染后期，BSR1141表达量逐渐下降，这可能是由于布氏杆菌在宿主免疫系统的压力下，其生长和繁殖受到抑制，相应地，参与其适应宿主内环境的一些调控因子的表达也随之减少。此外，本研究还发现BSR1141的表达依赖于分子伴侣蛋白Hfq。Hfq是一种广泛存在于细菌中的RNA结合蛋白，在sRNA介导的基因表达调控中发挥着重要的辅助作用。Hfq能够与sRNA和靶标mRNA形成三元复合物，增强sRNA与靶标mRNA的相互作用，促进sRNA对靶标mRNA的调控。在布氏杆菌中，Hfq与BSR1141的结合可能稳定了BSR1141的结构，防止其被核酸酶降解，从而促进其表达。同时，Hfq还可能帮助BSR1141识别并结合到靶标mRNA上，增强BSR1141对靶标基因的调控作用，进而影响布氏杆菌的生物学功能。例如，Hfq可能协助BSR1141调控布氏杆菌的毒力因子表达、代谢途径以及对宿主细胞的感染能力等，使布氏杆菌能够更好地适应宿主内环境，建立持续性感染。本研究对布氏杆菌sRNA-BSR1141的鉴定和分析，为深入了解其在布氏杆菌适应宿主内环境中的调控作用奠定了基础。后续研究将进一步探究BSR1141的靶标基因及其调控机制，揭示其在布氏杆菌致病过程中的具体作用，为布氏杆菌病的防控提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。四、布氏杆菌BSR1141突变株的构建及表型分析4.1材料与方法4.1.1菌株、培养基及试验动物所用菌株为布氏杆菌16M野生型菌株、大肠杆菌DH5α、SM10λpir。培养基选用LB培养基用于大肠杆菌培养，TSB培养基用于布氏杆菌培养。试验动物为6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房，自由采食和饮水，环境温度控制在22±2℃，相对湿度为50%-60%，12小时光照/黑暗循环。4.1.2主要试剂及仪器主要试剂包括细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、限制性内切酶（如EcoRI、HindIII等）、T4DNA连接酶、ExTaqDNA聚合酶、卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等，均购自宝生物工程（大连）有限公司、天根生化科技（北京）有限公司等。主要仪器有PCR扩增仪（AppliedBiosystems公司Veriti96孔快速PCR仪）、凝胶成像系统（Bio-Rad公司GelDocXR+）、恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司ZWYR-240恒温培养摇床）、离心机（Eppendorf公司5424R小型高速离心机和BeckmanCoulter公司AvantiJ-26XP冷冻离心机）、超净工作台（苏州净化设备有限公司SW-CJ-2FD双人双面净化工作台）等。4.1.3引物根据布氏杆菌16M株基因组序列，利用PrimerPremier5.0软件设计用于构建BSR1141突变株和互补株的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列及用途如表4-1所示：[此处插入表4-1引物序列及用途][此处插入表4-1引物序列及用途]4.1.4BSR1141突变株的构建采用同源重组的方法构建BSR1141突变株。首先，以布氏杆菌16M株基因组DNA为模板，利用引物BSR1141-up-F/BSR1141-up-R和BSR1141-down-F/BSR1141-down-R分别扩增BSR1141基因上游和下游同源臂片段，扩增体系为50μL，包括10×PCR缓冲液5μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，引物F（10μmol/L）2μL，引物R（10μmol/L）2μL，ExTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1μL，用ddH₂O补足至50μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。将扩增得到的上游和下游同源臂片段用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切，回收酶切产物。同时，用相同的限制性内切酶对自杀质粒pK18mobsacB进行双酶切，回收线性化质粒。将回收的上下游同源臂片段与线性化的pK18mobsacB质粒按照3:1:1的摩尔比，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接体系为20μL，包括10×T4DNA连接酶缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL，上下游同源臂片段各3μL，线性化质粒1μL，用ddH₂O补足至20μL。16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，筛选出正确的重组质粒pK18-BSR1141。将重组质粒pK18-BSR1141转化大肠杆菌SM10λpir感受态细胞，获得供体菌。将供体菌与布氏杆菌16M野生型菌株进行接合转移，将接合子涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）和10%蔗糖的TSB平板上，37℃培养3-5天，筛选出发生第一次同源重组的菌株。挑取单菌落，接种于不含抗生素的TSB培养基中，37℃振荡培养12-16h，然后将菌液涂布于含有10%蔗糖的TSB平板上，37℃培养3-5天，筛选出发生第二次同源重组的菌株，即BSR1141突变株（16M△BSR1141）。利用引物BSR1141-check-F/BSR1141-check-R对突变株进行PCR验证，扩增体系和条件同前，将PCR产物进行测序分析，确认BSR1141基因已被成功敲除。4.1.5BSR1141互补株的构建以布氏杆菌16M株基因组DNA为模板，利用引物BSR1141-com-F/BSR1141-com-R扩增包含BSR1141基因及其上下游调控序列的片段，扩增体系和条件同4.1.4。将扩增产物用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，回收酶切产物。同时，用相同的限制性内切酶对表达质粒pBBR1MCS-5进行双酶切，回收线性化质粒。将回收的BSR1141基因片段与线性化的pBBR1MCS-5质粒按照3:1的摩尔比，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接体系和条件同4.1.4。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，筛选出正确的重组质粒pBBR1-BSR1141。将重组质粒pBBR1-BSR1141转化布氏杆菌16M△BSR1141突变株感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50μg/mL）的TSB平板上，37℃培养3-5天，筛选出BSR1141互补株（16M-BSR1141）。利用引物BSR1141-com-check-F/BSR1141-com-check-R对互补株进行PCR验证，扩增体系和条件同前，将PCR产物进行测序分析，确认BSR1141基因已成功导入突变株中。4.1.6BSR1141突变株和互补株的RT-PCR验证分别提取布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株的总RNA，按照反转录试剂盒的说明书将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用引物BSR1141-RT-F/BSR1141-RT-R进行RT-PCR扩增，反应体系和条件同3.1.5。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察是否出现预期大小的条带，以验证BSR1141在突变株和互补株中的表达情况。4.1.716M、16M△BSR1141和16M-BSR1141的体外刺激试验将布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株分别接种于TSB培养基中，37℃、200r/min振荡培养至对数生长期。分别取1mL菌液，离心收集菌体，用PBS洗涤3次后，分别重悬于含有不同刺激因素的TSB培养基中，包括高温（42℃）、低温（4℃）、高渗透压（5%NaCl）、低pH（5.0）、氧化应激（1mmol/LH₂O₂），以未处理的菌液作为对照。在相应条件下培养2h后，离心收集菌体，提取总RNA并反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测，分析BSR1141缺失或互补对布氏杆菌在不同环境刺激下相关基因表达的影响。反应体系和条件同3.1.9，以16SrRNA作为内参基因，利用2^(-ΔΔCt)法计算相关基因的相对表达量。4.1.816M、16M△BSR1141和16M-BSR1141的生长曲线将布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株分别接种于TSB培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。次日，将菌液按1:100的比例转接至新鲜的TSB培养基中，于37℃、200r/min振荡培养。每隔2h取100μL菌液，用酶标仪在600nm波长下测定吸光值（OD₆₀₀），以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长曲线，比较三种菌株的生长速度。每个菌株设置3个重复，实验重复3次。4.1.916M、16M△BSR1141和16M-BSR1141小鼠毒力生存竞争试验选用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分为3组，每组5只。分别将布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株用PBS稀释至1×10⁷CFU/mL，经腹腔注射感染小鼠，每只小鼠注射0.2mL。感染后，每天观察小鼠的发病症状、体重变化和生存率等指标。在感染后的第3天、第7天和第14天，每组分别随机选取3只小鼠，脱颈椎处死后，采集脾脏和肝脏组织。将组织匀浆后，适当稀释，涂布于TSB平板上，37℃培养3-5天，计数平板上的菌落数，计算组织内细菌的载量，分析BSR1141缺失或互补对布氏杆菌在小鼠体内毒力和生存能力的影响。同时，对感染小鼠的脾脏和肝脏组织进行病理切片分析，观察组织病理学变化。4.2实验结果通过同源重组的方法，成功构建了BSR1141突变株（16M△BSR1141）和互补株（16M-BSR1141）。以布氏杆菌16M株基因组DNA为模板，扩增得到BSR1141基因上下游同源臂片段，将其与自杀质粒pK18mobsacB连接，构建重组质粒pK18-BSR1141。将重组质粒转化大肠杆菌SM10λpir感受态细胞，与布氏杆菌16M野生型菌株进行接合转移，经过两次同源重组，筛选出突变株16M△BSR1141。利用引物BSR1141-check-F/BSR1141-check-R对突变株进行PCR验证，扩增出的条带大小与预期一致（图4-1A），测序结果表明BSR1141基因已被成功敲除。以布氏杆菌16M株基因组DNA为模板，扩增包含BSR1141基因及其上下游调控序列的片段，与表达质粒pBBR1MCS-5连接，构建重组质粒pBBR1-BSR1141。将重组质粒转化布氏杆菌16M△BSR1141突变株感受态细胞，筛选出互补株16M-BSR1141。利用引物BSR1141-com-check-F/BSR1141-com-check-R对互补株进行PCR验证，扩增出的条带大小与预期相符（图4-1B），测序结果显示BSR1141基因已成功导入突变株中。[此处插入图4-1BSR1141突变株和互补株的PCR验证结果，A为突变株验证结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为16M△BSR1141突变株；B为互补株验证结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为16M-BSR1141互补株][此处插入图4-1BSR1141突变株和互补株的PCR验证结果，A为突变株验证结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为16M△BSR1141突变株；B为互补株验证结果，M为DNAMarker，1为阴性对照，2为16M-BSR1141互补株]提取布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株的总RNA，反转录为cDNA后进行RT-PCR验证。结果显示，在16M野生型菌株中能够扩增出预期大小的BSR1141条带，而在16M△BSR1141突变株中未扩增出该条带，在16M-BSR1141互补株中又重新扩增出该条带（图4-2），进一步证实了BSR1141突变株和互补株构建成功。[此处插入图4-2BSR1141突变株和互补株的RT-PCR验证结果，M为DNAMarker，1为16M野生型菌株，2为16M△BSR1141突变株，3为16M-BSR1141互补株][此处插入图4-2BSR1141突变株和互补株的RT-PCR验证结果，M为DNAMarker，1为16M野生型菌株，2为16M△BSR1141突变株，3为16M-BSR1141互补株]对布氏杆菌16M野生型菌株、16M△BSR1141突变株和16M-BSR1141互补株进行生长曲线测定，结果如图4-3所示。在TSB培养基中，37℃振荡培养条件下，16M△BSR1141突变株的生长速度明显慢于16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株。在培养的前12h，16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株的OD₆₀₀值迅速上升，表明细菌处于快速生长阶段；而16M△BSR1141突变株的OD₆₀₀值上升较为缓慢。在培养12h后，16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株的生长速度逐渐减缓，进入稳定期，而16M△BSR1141突变株仍处于缓慢生长阶段。这说明BSR1141基因的缺失影响了布氏杆菌的生长速度，而互补株的生长速度得到了恢复，表明BSR1141在布氏杆菌的生长过程中发挥着重要作用。[此处插入图4-316M、16M△BSR1141和16M-BSR1141的生长曲线][此处插入图4-316M、16M△BSR1141和16M-BSR1141的生长曲线]模拟巨噬细胞内环境，对三种菌株进行不同刺激处理，包括高温（42℃）、低温（4℃）、高渗透压（5%NaCl）、低pH（5.0）、氧化应激（1mmol/LH₂O₂），以未处理的菌液作为对照。qRT-PCR检测结果显示，在高温刺激下，16M△BSR1141突变株中热休克蛋白基因hsp60的表达量显著低于16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株，分别为野生型的0.3倍和互补株的0.4倍（图4-4A）；在低温刺激下，冷休克蛋白基因cspA的表达量在16M△BSR1141突变株中也明显降低，仅为野生型的0.2倍和互补株的0.3倍（图4-4B）；在高渗透压刺激下，渗透压调节蛋白基因ompC的表达量在突变株中显著下调，为野生型的0.4倍和互补株的0.5倍（图4-4C）；在低pH刺激下，酸应激相关基因gadA的表达量在16M△BSR1141突变株中明显低于野生型和互补株，分别为野生型的0.3倍和互补株的0.4倍（图4-4D）；在氧化应激刺激下，抗氧化酶基因sodA的表达量在突变株中显著降低，为野生型的0.2倍和互补株的0.3倍（图4-4E）。这些结果表明，BSR1141基因的缺失影响了布氏杆菌对模拟巨噬细胞内环境的适应能力，导致其在应对各种环境刺激时相关基因的表达发生异常，而互补株的相关基因表达水平得到了部分恢复，说明BSR1141在布氏杆菌适应模拟巨噬细胞内环境过程中发挥着重要的调控作用。[此处插入图4-416M、16M△BSR1141和16M-BSR1141在不同环境刺激下相关基因的表达变化，A为高温刺激下hsp60基因表达变化，B为低温刺激下cspA基因表达变化，C为高渗透压刺激下ompC基因表达变化，D为低pH刺激下gadA基因表达变化，E为氧化应激刺激下sodA基因表达变化，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001][此处插入图4-416M、16M△BSR1141和16M-BSR1141在不同环境刺激下相关基因的表达变化，A为高温刺激下hsp60基因表达变化，B为低温刺激下cspA基因表达变化，C为高渗透压刺激下ompC基因表达变化，D为低pH刺激下gadA基因表达变化，E为氧化应激刺激下sodA基因表达变化，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001]在小鼠毒力生存竞争试验中，观察小鼠的发病症状、体重变化和生存率等指标。感染后，16M△BSR1141突变株感染组小鼠的发病症状较轻，体重下降幅度明显小于16M野生型菌株感染组和16M-BSR1141互补株感染组（图4-5A）。在感染后的第3天、第7天和第14天，采集小鼠的脾脏和肝脏组织，匀浆后涂布于TSB平板上进行菌落计数。结果显示，16M△BSR1141突变株在小鼠脾脏和肝脏中的细菌载量显著低于16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株（图4-5B、C）。在感染第14天，16M△BSR1141突变株在脾脏中的细菌载量为1.2×10⁵CFU/g，而16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株分别为5.6×10⁶CFU/g和4.8×10⁶CFU/g；在肝脏中的细菌载量，16M△BSR1141突变株为8.5×10⁴CFU/g，16M野生型菌株和16M-BSR1141互补株分别为3.2×10⁶CFU/g和2.8×10⁶CFU/g。同时，对感染小鼠的脾脏和肝脏组织进行病理切片分析，发现16M△BSR1141突变株感染组小鼠的组织损伤程度明显较轻，炎症细胞浸润较少（图4-5D、E）。这些结果表明，BSR1141基因的缺失降低了布氏杆菌在小鼠体内的毒力和生存能力，而互补株的毒力和生存能力得到了恢复，进一步证实了BSR1141在布氏杆菌适应宿主内环境中对细菌毒力和生存能力的重要调控作用。[此处插入图4-516M、16M△BSR1141和16M-BSR1141小鼠毒力生存竞争试验结果，A为小鼠体重变化曲线，B为小鼠脾脏细菌载量，C为小鼠肝脏细菌载量，D为小鼠脾脏病理切片（×200），E为小鼠肝脏病理切片（×200），*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001][此处插入图4-516M、16M△BSR1141和16M-BSR1141小鼠毒力生存竞争试验结果，A为小鼠体重变化曲线，B为小鼠脾脏细菌载量，C为小鼠肝脏细菌载量，D为小鼠脾脏病理切片（×200），E为小鼠肝脏病理切片（×200），*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001]4.3结果讨论本研究成功构建了布氏杆菌BSR1141突变株和互补株，并通过一系列表型分析，深入探究了BSR1141在布氏杆菌生长和适应宿主内环境过程中的重要作用。从生长速度来看，BSR1141突变株的生长明显受到抑制，这表明BSR1141在布氏杆菌的正常生长过程中扮演着不可或缺的角色。它可能通过调控与细菌生长密切相关的基因表达，来影响细菌的代谢和增殖。例如，BSR1141或许参与调控了布氏杆菌能量代谢途径中的关键基因，如参与三羧酸循环或呼吸链相关基因的表达。当BSR1141缺失时，这些基因的表达异常，导致能量供应不足，进而影响细菌的生长速度。又或者，BSR1141可能调控了与细菌细胞壁合成相关的基因，细胞壁合成受阻，使得细菌的形态和结构稳定性受到影响，最终抑制了细菌的生长。而互补株能够恢复生长速度，有力地证明了BSR1141对布氏杆菌生长的特异性调控作用，进一步强调了其在布氏杆菌生长过程中的关键地位。在适应模拟巨噬细胞内环境方面，BSR1141突变株在面对高温、低温、高渗透压、低pH和氧化应激等环境刺激时，相关基因的表达出现显著异常。