高三一轮教案生物（人教版）第十单元 专项突破10 综合PCR的基因工程问题

专题突破10综合PCR的基因工程问题

阐明PCR的原理、反应条件、反应过程；用PCR扩增DNA片段并完成电泳

课标要求

鉴定。

引物的选择和设计、PCR

2024•湖南・T・山东・T32024•黑吉辽T7

考情分析扩增结果的电泳鉴定与分

2023•江苏•辽宁・T・江苏・T24

析、PCR的应用

类型一PCR引物碱基序列的设计

1.土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因。MNB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳

88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增。SMY856需要添加引物，应选用的引物组

合为（）

A.5,一CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'

B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'—TAAGTTGTCT—3'

C.5'-ATTCAACAGA-3/和5'-ATCATCCAAG-3Z

D.5'-ATTCAACAGA-3/和5'—GAACCTACTAT'

答案A

解析图中所示碱基序列磷酸端为5'端，-羟基端为3'端，在进行PCR操作时，引物应分

别与基因两条链的3'端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5'-CTTGGATGAT-

3,（上面越的引物）和5'-TCTGTTGAAT—3’（下而蛀的小物）作为引物对，A符合题意。

2.（2021・湖北，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物

与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条

带的产生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA的量

B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间

D.提高复性的温度

答案D

解析增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异条带的产生，A

不符合题意；延长热变性的时间不影响引物和模板配对，故不能有效减少反应非特异条带的

产生，B不符合题意：一般根据待扩增片段的长度适当延长延伸的时间，但延伸时间过长可

能会出现非特异性扩增，C不符合题意；复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，

故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生，D符合题意。

3.以下两组引物设计的均不合理的原因是_________________________________________

___________________________________________________________________________O

答案引物I和引物n局部发生碱基互补配对而失效，引物「自身折叠后会出现局皆碱基

互补配对而失效

引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣时PCR

反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括：

⑴引物长度一般为20〜30bp,可定位目的基因并为子链的延伸提供3'端。

（2）引物中CG含量要适宜，CG含量越高，复性（退火）温度越高，产物特异性越高。

⑶引物自身、引物之间不修有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影

响引物与模板的复性结合C

（4）引物的5'端可以修饰（添加酶切位点、引入突变序列），但3'端不可修饰（与模板DNA配

对）。

类型二利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物

4.（2024•黑古辽，7）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（）

A.琼脂糖凝胶浓度的选持需考虑待分离DNA片段的大小

B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置

C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快

D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来

答案A

解析在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，需根

据待分离DNA片段的大小配制琼脂糖溶液，故琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA

片段的大小，A正确：凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进

度的指示分子，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，且DNA在电场中从负极向

正极移动，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子可在波长为300nm的紫外灯（不是紫光灯）下

被检测，并且需染色，D错误。

1.DNA电泳鉴定中的“两液两剂”

两液：电泳缓冲液与凝胶或样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定，提供导

电介质；凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率，=要用于样品的稀释和保护，同时通

过指示剂指示样品在凝胶中的位置。

两剂：核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质，以便在

紫外灯下观察和检测核酸条带，最常用的核酸染料是澳化乙锭。最常用的指示剂是澳除蓝，

它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中，澳酚蓝通

常位于样品的前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有助亍实验者判断电泳是否完成，以及何

时停止电泳。

2.DNA迁移速率的影响因素

⑴凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移

受到的阻力越大，速率越慢。

(2)DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢。

(3)DNA分子的构象：三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条

镂都是完整的质粒)＞线形)开环(DNA双链断了一条成为徐池的环)。

类型三利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接

5.(2019・江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟

设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR

鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩

增出了400bp片段，原因是。

答案乙、丙目的基因反向连接

解析分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲

和丙这对引物，则无论日的基因是否正确插入，扩增的片段都是50+300+100=450(bp),不

符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙

和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的

外侧，此时若加入引物甲后乙，则可以扩增出300+l00=400(bp)的片段。

检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标

记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际

操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙

设计鉴定目的基因的连接方式。

类型四利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR

6.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水

蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)

替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。

注：图中的引物2和3的突起处代表与模板镂不能互补的突变位点。

(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。

(2)若拟突变位点的碱基对为A-T,则需要让其突变为才能达到目的。引物2

的突变位点(突起处)应设计为(假设引物为单链DNA)o

(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物I、引物2组成的反应系统和引

物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生一种DNA分子。该阶段必须将引

物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为

(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术

把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物Mi、M2,基因N的引物Ni、N2o在设计这

4种引物时，特别要注意的问题是___________________________________________________

答案（1）改造基因（或基因定点突变）（2）T-A或C-GA或G（3）3引物2和3中存在

互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用（4）Mi、M2中的一种引物与Ni、N2

中的一种引物必须具有互补配对的片段

解析（2）若拟突变位点的城基对为A-T,则需要让其突变为T-A或C-G,对应的密码子

由AAU变成AAA或由AAC变成AAG,可使天冬酰朕替换为赖氨酸。（3）若两个反应系统

均进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子差一样

的。（4）重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，需要找

到两种基因的重叠部分，即MHM2中的一种引物与Ni、N2中的一种引物必须具有互补配对

的片段。

重叠延伸PCR技术：采用具有互补配对片段的引物，分别进行PCR,获得有重叠链的两种

DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因或将不同来源的任

意DNA片段连接起来。

类型五利用PCR技术扩增未知基因序列——反向PCR

7.（2020•江苏，33节选）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出

已知序列两侧的序列，具体流程如图（以EcoRI酶切为例）：

请据图回答问题：

（1）步骤I用的Ec〃RI是一种酶，它通过识别特定的切

割特定位点。

⑵步骤II用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3'—羟基与5'一磷酸间形成

;PCR循环中，升温到95℃是为了获得；ZqDNA聚合前

的作用是催化。

（3）若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤IH选用的PCR引物必须是

（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序歹U（虚线处省略了部分核甘酸序列）

已知序列

®5'-AACTATGCGCTCATGA一T

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3"

PCR弓1物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3z

答案⑴限制性内切核酸（或限制）核甘酸序列（2）磷酸二酯键DNA单链以DNA为模

板的DNA链的延伸（3）②④

解析（3）PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板锥和引物的方向是

相反的，引物的核昔酸序列要能够和相应模板的核甘酸序列发生碱基互补配对，环状DNA

图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知

DNA序列的第一条链的左端互补结合延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA

序列的第二条链的右端互补结合延伸形成子链，该引物是②。

反向PCR是反向互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列内部没有切

点的限制性内切诲对此段DNA进行晦切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，

然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增，

得到已知序列的旁侧DNA片段。

类型六利用PCR技术快速检测病原体——荧光定量PCR

8.猴痘是由猴痘病毒（•种RNA病毒）感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发

热、皮疹、淋巴结肿大等c猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。

（1）首先，从样本中提取病毒RNA,经酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行

实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。

（2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA,可与目的

基因中部分序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结

合的探针被ThqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图1）。

TTT111111T

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

图】

①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原川而特

异性结合。

②在PCR循环的延伸阶段，DNA聚合前催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度

与反应体系中DNA分子数呈__________侬“正相关”或“负相关”）.

（3）通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。

①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有

②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经

历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就O

③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，CtW37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图

2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为。

（4）阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有（多选）。

a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值

b.样本被污染，RNA能将病毒RNA降解

c.病毒发生变异

答案⑴逆转录（2）①碱基互补配对②正相关⑶①预DNA聚合酶活性下降、引物浓度

下降、原料dNTP浓度下降②越小③阳性（4）abc

解析（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。（2）②在PCR循

环的延伸阶段，Th^DNA聚合酶催化子链的合成井水解探针。根据题干信息可知，荧光信号

的累积与PCR产物数量完全同步，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关。

⑶②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的犷增循环数就越少，Cl值就越

小。③CIW37判定为阳性，040或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大1%是25,猴痘

病毒核酸检测结果应判定为阳性。（4）阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的

因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA

酶将病毒RNA降解，从后导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而由现假

阴性，故选a、b、Co

荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反应进程的荧光探针，当耐高温的DNA聚合

酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就

有一个荧光分子生成，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。Q值是荧光信号达到荧

光阈值时PCR循环数，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始

模板量浓度越高，Q值越小；起始模板量浓度越低，Q值越大。

课时精练

选择题1〜2题，每小题7分，3〜8题，每小题8分，共62分。

一、选择题

1.（2024・武汉期末）基因工程中，通过PCR可以特异性地快速扩增目的基因，PCR产物常采

用琼脂糖凝胶电泳实验进行鉴定。下列有关该实验的叙述，正确的是（）

A.在同一电场作用卜，DNA片段越长迁移速率越快

B.DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度无关

C.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在红外灯下被检测出来

D.如果引物特异性不强，扩增出来的条带可能不止•条

答案D

解析在同一电场作用下，DNA片段越长迁移速率越慢，A错误；凝胶的浓度会影响DNA

分子在凝胶中的迂移速率，B错误：琼脂糖凝胶中的DNA分子经过核酸染料染色后可在波

长为300nm的紫外灯下被检测出来，C错误；如果引物特异性不强，引物可能会与目的基因

以外的其他的DNA片段结合，扩增出来的条带可能不止一条，D正确。

2.（2025・武汉一模）油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对

发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA

进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是（）

A.需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物

B.应在PCR扩增体系中添加M/+,以激活DNA聚合前

C.可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生

D.用限制酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子

答案B

解析引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，A错误；PCR

过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg?*用于激活DNA聚合酶，B正确：复性温度

过低会导致引物与模板链的结合不牢固，会增加PCR中非特异性条带，C错误；与绿l基因

相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切住点，用限制酶

B作用后进行电泳，若有3条电泳条带可判断为杂合子，D错误。

3.（2024•厦门质检）如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况④表示相关物质，

L、R表示方向。下列叙述正确的是（）

A.②链从L到R的方向为3'-5',①②链均可作为子链合成的模板

B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制

C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③

D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物

答案D

解析根据DNA分子中两条链的反向平行关系及图示可判断，②链从L到R的方向为

5'—3',A错误；PCR过程是通过高温将双链DNA之间的氢键断开，并且是全部解旋之

后才进行复制，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23=8,需

消耗7个引物③，C错误。

4.（2024.重庆模拟）不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方

法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的

被称为非限制性引物，两者的比例通常为1：100。PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产

物主要是双链DNA（dsDNA）,但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关

说法错误的是（）

A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列

B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致

D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离

答案C

解析不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物与乙

链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。

5.反向PCR是•种通过已知序列设计引物对未知序列（图中L、R）进行扩增的技术，其过程如

图所示。下列相关叙述不正确的是（）

A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割

B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键

C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合前和解旋海

D.该技术可检测T-DNA整合到植物染色体DNA的位置

答案C

解析过程③即PCR犷增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，

C错误。

6.（2024・无锡模拟）重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示（凸起处代表突

变位点）。下列说法正确的是（）

A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率

B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物

C.过程②的产物都可以完成延伸过程

D.若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2

答案D

解析两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至

少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延

伸过程，因为子链只能从引物的3'端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由

于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16X2—2=30（个）通用引物，而

需要通用引物RP2的数量为3（H2=15（个），D正确。

7.（2024.安顺调研）荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理

是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA

聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次,

就有一个荧光分子生成（如图）。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（荧光信号达到设定阈

值时所经历的循环次数）。下列相关叙述错误的是（）

A.PCR每个循环包括变性、复性（引物和模板结合）、延伸3个阶段

B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键和水解磷酸二酯键

C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关

D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高

答案D

解析Ct值越小，说明所需循环的次数越少，被检测样本中病毒数目越多，D错误。

8.（2025•成都期末）某科研小组采用PCR技术构建了红色荧光蛋白基因（力/42）和a淀粉两基

因（a〃?.y）的dsred2-amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序歹U（灰色

区域）可互补配对。下列说法错误的是（）

A.利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA双链

B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增

C.dsred2基因和a，〃.v基因混合后只能得到一种类型的杂交链

D.杂交链延伸得到dsredl-amy融合基因的过程不需要加引物

答案C

解析利用PCR技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酹来打开DNA

双链，A正确；引物②和引物③中部分序列可互补配对，引物之间的结合会干扰引物和模板

链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行小742基因和卬”基因

的扩增，B正确；/上422因和即,），基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交蛀

延伸得到町，融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母挂的起始位置的碱基序

列即为引物，可以作为子姓合成的引物，D正确。

二、非选择题

9.（12分）（2025・长沙模拟冰稻穗粒数可影响水稻产量。衣杆菌Ti质粒的T—DNA可以转移

并随机插入野生型水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致

被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常

突变体，为确定T—DNA插入植物细胞的染色体位置，可根据T-DNA序列，扩增其两侧

未知序列比对，从而确定插入的染色体。

（I）图1所示序列使用限制晦陋切后，将所得DNA使用酶连成环状（如图2）,再设

计引物进行PCR扩增，其中复性过程的作用是。

（2）请根据图1的T-DNA的一条链的碱基序列，选出PCR中使用的引物序列是和

（填序号）。

T-DNA序列引物序列

①5'—GCGCATAGTT—3'

②5'-ATAGGCTACG-3Z

5'-AACTATGCGC.......CGTAGCCTATT

③5，一CGTAGCCTATT

④5'—AACTATGCGC-3'

（3）由图2中环状DNA至少经过______轮循环才能得到图示链状PCR产物（如图3）o

⑷经过与野生型水稻基因组序列比*j,确定T-DNA插入2号染色体上的B基因中。研究

发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测B基因可(填“促进”或“抑制”)水

稻穗粒的形成，从而控制高产性状。

答案(l)DNA连接使弓物通过碱基互补配对结合到模板链上(2)①③(3)3(4)促进

解析⑵

T-DNA序列引物序列

5'—AACTATGCGCCGTAGCCTAT—3'5'—GCGCATAGTT—3;

3'—TTGATACGCGGCATCGGATA—5'5'-CGTAGCCTAT-3'

据上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。(4)该突变体产量明显低于野生型，而突变体

内B基因由于插入了T—DNA功能丧失，据此推测B基因促进水稻穗粒的形成。

10.(14分)(2025.安庆模拟)巢式PCR是一种特殊的聚合幽链式反应，使用两组不同的引物实

现对目标DNA片段的扩增。第一组外引物大小为25bp,复性温度较高(68℃),扩增后得到

中间产物：第二组内引物天小为17bp,复性温度较低(46℃),内引物的结合部位在中间产物

内部。具体过程如图一所示，回答卜.列问题；

(I)巢式PCR反应体系中除模板、引物、Mg?'外，还应加入(答

出两点即可)等。

(2)巢式PCR时，复性温度与引物长度呈________(填“正相关”或“负相关”)。若使用外引

物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，则使用内引物进行第二次PCR扩增时，完成配

对并扩增的概率会。由此可知，巢式PCR相较于常规PCR具有的优点是

(3)家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。科研人员利用多重巢式PCR技

术同时扩增奶牛Y染色体上的雄性决定基因(SRK)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN/S/),进

行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植，获得高产奶牛。

实验目的方法步骤要点

囊胚样品DNA提取选取滋养层细胞提取DNA

PCR引物的设计和合成根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计并合成a._____对引物

PCR扩增预变性f变性f复性一延伸

鉴定分析采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，确定胚胎性别

b._______________对受体奶牛注射前列腺素

胚胎移植将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内

①请将表格内容补充完整：a是；b是o

②巢式PCR产物鉴定结果如图二所示，1〜5号为取自不同胚胎的DNA样品，其中符合要求

的胚胎是。

答案⑴缓冲液、耐高温的DNA聚合酶（或血/DNA聚合酶）、4种脱氧核甘酸（或dNTP）

（2）正相关下降特异性强、灵敏度高（3）①4同期发情②1、2、4

解析（2）PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸，巢式PCR时，复性温度与引物长

度呈正相关。巢式PCR时，若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段，声使用

内引物扩增，在错误片段上进行引物配对并扩增的概率会下降，因此，相比于常规PCR而言，

巢式PCR特异性强、灵敏度高。（3）①本实脸用巢式PCR技术，用的是两轮PCR,因此扩增

一种基因片段则需要设计2对引物，而扩增2种基因片段则需要设计4对引物。在胚胎移植

前需要对受体奶牛进行同期发情处理，便于移植。②题中利用多重巢式PCR技术同时犷增Y

染色体上的雄性决定基因（5KF）和常染色体上的酪蛋白基因（CSN/S/）并进行电泳，雌性个体没

有SRY,只有一条带，雄性有两条带，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚

胎是1、2、4o

11.（12分）（2023・江苏，22节选）为了将某纳米抗体和绿色