新生儿耳聋基因检测筛查及结果分析

新生儿耳聋基因检测筛查及结果分析目录TOC\o"1-4"\h\u27162摘要 页第1章前言1.1课题背景基因芯片（也称为DNA芯片、生物芯片）是人类基因组计划发展起来的科学产品，这项技术指的是将大量且高密度的探针分子固定于支持物上后与被标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号强度进行样品数量以及序列分析。广泛应用于基因表达检测、杂交测序、基因突变、多肽性分析等方面［1］。微阵列芯片（Microaiiaychip）是指将生物大分子（核酸片段、多肽、蛋白、细胞、组织、等）生物样品生物样品固定在载体支持物上（如载玻片，硅片，尼龙膜等），通常是密集地二维分子排列［2］。通过杂交技术来对样品中的不同生物分子进行高通量检测的技术，阵列中的每个探针都有不同的坐标，通过探针坐标实现对大量探针的特异性标识，从而实现对探针杂交对象的特异性标识，实现对样品中大量不同的生物分子进行高通量检测［3］。微阵列它虽然是一类体型较小的分析装置，但在实验中通过一次实验就能够分析出整个人的全部基因组。从狭义上讲，它分为cDNA微阵列，寡核苷酸微阵列，蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。广义上是指能对生物成分进行快速分析的厘米大小的固体薄器件，微阵列上含有大量已知序列的DNA探针［4］,微阵列技术利用分子杂交原理将同时检测到的样品（用同位素或荧光素标记）与微阵列杂交,通过检测杂交信号强度和数据处理,将他们转化为不同标本中特异基因的丰度，并对不同样品的基因表达水平差异进行了深入比较。且cDNAchip是将大量的cDNA探针固定在进行杂交后再进行检测信号强弱从而判定样品含量多少，本发明解决了传统核酸印迹杂交技术复杂，检测分子数少的缺陷。微阵列技术在研究生物的基因组信息方面能够达到快速性和精准性，是一种探索基因组功能的有力手段［5］。微阵列技术还能够用于检测基因序列发生的变化，因而它能够为遗传的筛选、测试、诊断领域打造出更为新颖的研究方法。1.2耳聋基因耳聋基因在正常人中也是存在的，携带耳聋基因也不一定是耳聋患者，有时还会出现父母正常但孩子患有耳聋的情况，在我国听力残疾居残疾之首［6］，其中有60%由于遗传因素造成，25%由于环境因素造成（细菌感染、病毒感染、耳毒性药物等）、15%由不明因素造成。其遗传因素中又分为综合症型30%（ALport、Pendered等四百余种综合症）和非综合症型70%（常染色体隐性80%GJB2、GJB3及SLC26A4常染色体显性15%GJB3）［7］。根据研究报道表明50%重度耳聋患者在3个月时具有正常听觉行为，至少20%在6个月仍具有听觉行为，所以对于检测出耳聋基因携带者应该尽早实施干预，通过治疗避免耳聋残疾。1.3晶芯耳聋基因芯片使用人基因组DNA作为模板，使用具有标签标签序列的位点特异性引物，并扩增相关基因的片段并生物素标记，再经过磁分离以及碱变形后能识别相应的标签序列并通过基因芯片杂交，通过扫描和判读得知检测结果。

第2章实验材料2.1实验细胞北京市北京博奥晶典生物技术有限公司的实验室提供，300例新生儿血斑样品。2.2主要试剂表2-1试剂试剂生产厂家BufferGA（缓冲液）TIANGENBufferGB（缓冲液）TIANGENBufferGD（缓冲液）TIANGENRNaseATIANGENProteinaseKTIANGENBufferPW（漂洗液）TIANGENBufferTE（洗脱缓冲液）TIANGEN红细胞裂解液TIANGEN无水乙醇北京益利精细异丙醇北京益利精细芯片及盖片CapitalBioPCR扩增引物CapitalBioUNG酶、Taq酶、dNTPCapitalBio磁珠悬液CapitalBioNaOHCapitalBioTris-HCL、EDTA、NaCl（结合缓冲液）CapitalBio纯化水CapitalBioDenhardt'sCapitalBioSDS、SSCCapitalBio正常人基因组DNACapitalBio2.3主要仪器表2-2仪器仪器型号/生产厂家超净工作台CJT-16磁力架CapitalBio冷冻离心机5810R微量台式离心机5415D涡旋混合器TDX-1冰香（-80）Haier冰箱（4度）BCD-223N水浴锅HHSY11-NI移液器P-2,P-20,P-200,P-1000紫外分光光度计NaNoDrop8000浓缩仪5301PCR仪PTC-225晶芯芯片清洗仪CapitalBio芯片杂交仪CapitalBio芯片洗干仪CapitalBio芯片扫描仪CapitalBio耳聋基因检测分析系统CapitalBio第3章实验方法3.1实验细胞北京市北京博奥晶典生物技术有限公司的实验室提供，300例新生儿血斑样品。3.2质检3.2.1DNA的提取使用TIANampGenomicDNAKit进行血液DNA提取抽取新生儿抗凝血样品200µl于EP管中（若样品体积不足200µl，可加入适量缓冲液GA）在EP管中加入400µl红细胞裂解液，上下混合，瞬时离心后加入20µl蛋白酶K（ProteinaseK）涡旋混匀。放置一段时间后，加入RNaseA2µl。（3）加入200µl缓冲液GB，颠倒混匀，70℃孵育10min，离心去除管盖和内壁上的水滴。（4）加入200µl无水乙醇，涡旋震荡15sec，观察是否产生絮状沉淀后瞬时离心。（5）将上清液和絮状沉淀都转移到CB3吸附柱当中（并放置于收集管当中）12000rpm、3min后弃掉收集管里的废液。（6）在向CB3中加入500µl已加醇缓冲液GD后12000rpm，3min弃掉废液。（7）向吸附柱中加600µl已加醇漂洗液PW后12000rpm，3min弃掉废液。并重新加入PW在洗一次。（8）将吸附柱12000rpm离心2min，弃去废液，然后打开盖子10min，晾干漂洗液和乙醇。（9）将吸附柱置于干净的EP管当中，向吸附膜上加65µl洗脱缓冲液TE，在室温放置3min，12000rpm离心2min。即EP管中就是提取的DNA样品。3.2.2质量控制紫外定量用紫外分光光度计测定DNA的浓度、OD260/280值。OD260/280比值应为1.7-1.9（OD260值为1等于双链DNA50µg/ml，单链DNA40µg/ml）要求被检组DNA浓度满足3-25ng/µl。3.3晶芯十五项耳聋基因芯片检测准备3.3.1PCR扩增（1）分别加入PCR所需试剂（按照所检数目三倍准备200µl离心管，分别按下表加入所需试剂，涡旋震荡充分混匀，并短暂离心至管底）表3-1PCR反应体系管号A反应物体积（µl）12PCR扩增试剂A20.0基因组DNA5.0共计25.0管号B反应物体积（µl）12PCR扩增试剂B20.0基因组DNA5.0共计25.0管号C反应物体积（µl）12PCR扩增试剂C20.0基因组DNA5.0共计25.0（2）进行扩增，置于PCR机中，根据循环程序进行扩增反应。表3-2反转录MasterMix温度（℃）379595RAMP57RAMP706012时间（S）600900300.4℃/s300.2℃/s45600-循环数113511备注本PCR程序应用了PCR仪的RAMP功能设定生降温速速率，总反应时间约为3小时20分钟3.3.2产物纯化实验前准备实验前试剂的准备如表3-3表3-3试剂的准备试剂名称操作变性液用纯化水将NaOH稀释100倍后混匀杂交缓冲液50℃温浴使其完全融化后纯化水—磁珠的准备（1）分析样品时，涡旋震荡数次混匀磁珠，用200µl离心管中，加入30µl的结合缓冲液，再抽取9µl磁珠试剂加于离心管中，涡旋震荡混匀后将离心管放置于磁力架上。（2）吸附时间大约1min，吸附结束后去除溶液，将EP管加入30µl结合缓冲液，关闭管盖并从磁性框架上取下EP管，然后涡旋并混合。（样品可以集中处理）磁珠纯化（1）取与检测人数相同的离心管，均加入A体系中PCR的产物20µl、B体系中PCR的产物20µl和C体系中PCR的产物20µl，混匀。（2）再向离心管中加入30µl已制备好的磁珠悬液（以充分混匀的悬液），充分混匀后室温下静置10min，10min后将离心管放置于磁力架上，并吸附1min。（3）吸附完成后，用移液枪弃掉溶液，从磁力架上取下离心管，向离心管内加入新配好的0.1MNaOH120µl，涡旋震荡充分混匀，瞬时离心。（4）在室温下静静放置10min后，将EP管置于磁力架上并吸附1min，用移液枪弃掉溶液。杂交反应混合物的准备（1）向离心管加入杂交缓冲液（温浴且充分混匀）40µl，将其从磁力架上撤下，涡旋充分混匀后放于磁力架上吸附1min，弃去溶液。（2）加入20µl杂交缓冲液，涡旋充分混匀后准备杂交。3.4芯片杂交3.4.1实验前准备表3-4试剂的准备试剂成分洗涤液ISSC最终浓度为0.3×、SDS为0.1%洗涤液IISSC最终浓度为0.06×纯化水—注：若10%SDS产生白色絮状沉淀，请与50%水浴温浴至澄清并混匀后配制洗涤液3.4.2芯片的准备（1）将50µl的纯化水加入杂交盒双侧凹槽中，并将芯片的正面向上的方向放置于杂交盒中。（2）芯片放置后将盖子盖于芯片上方（注意：盖片有凸台向下），盖片的末端与芯片末端标签对其。图3-1芯片的准备操作3.4.3加样开始杂交反应（1）将得到的杂交反应混合物用移液枪吹吸混匀，然后由盖片上加样孔垂直而缓慢的加到芯片上，盖上杂交盒盖子密封并记录编号（2）将杂交仪预热到50℃。（3）将杂交盒放入杂交仪中1h。图3-2杂交加样操作（4）注意：加样的整个过程中应避免产生气泡，整个实验过程中应避免芯片上的液体暴露在空气中时间过长。3.5芯片洗涤、干燥于杂交结束之前10min配置好漂洗液I、漂洗液II。表3-7芯片洗液配制和洗程序洗液配制纯化水（ml）20×SSC（ml）10×SDS（ml）清洗程序洗涤次数时间（s）温度（℃）上液力度清洗力度是否加热洗涤液I（2L）19503020洗涤液I11503712是洗涤液II（2L）19946——洗涤液II11203751否3.6芯片扫描开启芯片扫描仪进行信号读取（芯片扫描仪使用的是晶芯®LuxScan™

10K-B）。3.7芯片数据分析结果判读样品检测结果由晶芯®耳聋基因检测分析系统判读，当探针检测信号值等于或者大于其本身的cutoff时，判断其探针为阳性，当探针检测信号值小于其cutoff时，则该探针为阴性。3.7.1参考检测结果图3-3微阵列芯片探针排布表3-8微阵列探针排布说明1-34-67-91QCBCPC235W538W1975W335M538M1975M4176W2168W2027W5176M2168M2027M6MCICMC7235WIVS7-2W1226W8235MIVS7-2M1226M9299W1174W1229W10299M1174M1229M111494WIVS15+5W1555W121494MIVS15+5M1555M13PCNCQC3.7.2检测结果的解释通过：样本在四个基因（GJB2、GJB3、12SrRNA、SLC26A4）上的15个位点未检测出突变各点均为野生型。未通过：样本在四个基因上的15个位点中至少有检测出一个突变。 第4章实验结果4.1数据处理编号结果编号结果编号结果1野生101野生201野生2野生102野生202野生3野生103野生203野生4野生104野生204野生5野生105野生205野生6野生106野生206野生7野生107野生207野生8野生108野生208野生9野生109野生209野生10野生110野生210野生11野生111野生211野生12野生112野生212野生13野生113野生213野生14野生114野生214野生15野生115野生215野生16野生116野生216野生17野生117野生217野生18野生118野生218野生19野生119野生219野生20野生120野生220野生21野生121野生221野生22野生122野生222野生23野生123野生223野生24野生124野生224野生25野生125野生225野生26野生126野生226野生27野生127野生227野生28野生128野生228野生29野生129野生229野生30野生130野生230野生31野生131野生231野生32野生132野生232野生33野生133野生233野生34野生134野生234野生35野生135野生235野生36野生136野生236野生37野生137野生237野生38野生138野生238野生39野生139野生239野生40野生140野生240野生41野生141野生241野生42野生142野生242野生43野生143野生243野生44野生144野生244c.538C>T(杂合)45野生145野生245c.235delC(杂合)46野生146野生246c.235delC(杂合)47野生147野生247c.2168A>G(杂合)48野生148野生248IVS7-2A>G(杂合)49野生149野生249IVS7-2A>G(杂合)50野生150野生250IVS7-2A>G(杂合)51野生151野生251c.235delC(杂合)52野生152野生252c.235delC(杂合)53野生153野生253c.235delC(杂合)54野生154野生254IVS7-2A>G(杂合)55野生155野生255IVS7-2A>G(杂合)56野生156野生256c.235delC(杂合)57野生157野生257c.235delC(杂合)58野生158野生258c.1174A>T(杂合)59野生159野生259c.2168A>G(杂合)60野生160野生260野生61野生161野生261野生62野生162野生262野生63野生163野生263野生64野生164野生264野生65野生165野生265野生66野生166野生266野生67野生167野生267野生68野生168野生268野生69野生169野生269299杂合突变70野生170野生270c.235delC(杂合)71野生171野生271野生72野生172野生272野生73野生173野生273野生74野生174野生274野生75野生175野生275野生76野生176野生276野生77野生177野生277野生78野生178野生278野生79野生179野生279野生80野生180野生280野生81野生181野生281野生82野生182野生282野生83野生183野生283野生841229杂合突变184野生284野生85野生185野生285野生86野生186野生286野生87野生187野生287野生88野生188野生288野生89野生189野生289野生90野生190野生290野生91野生191野生291野生92野生192野生292野生93野生193野生293野生94野生194野生294176杂合突变95野生195野生295野生96野生196野生296野生97野生197176杂合突变297野生98野生198野生298野生99野生199野生299野生100野生200野生300野生在检测的300例样品中，野生型279个，占比93%；突变型共21个占比7%，其中176杂合突变2个占比0.67%；1229杂合突变1个占比0.33%；299杂合突变1个占0.33%，c.235delC(杂合)8个占比2.67%，IVS7-2A>G(杂合)5个占比1.67%，c.2168A>G(杂合)2个占比0.67%，c.538C>T(杂合)1个占比0.33%，c.1174A>T(杂合)1个占比0.33%。4.2实验结果图4.2.1野生型芯片图图3-4野生型4.2.2突变型型芯片图（538杂合突变）图3-5538杂合突变4.2.3突变型型芯片图（1147杂合突变）图3-61174杂合突变4.2.4突变型型芯片图（2168杂合突变）图3-72168杂合突变4.2.5突变型型芯片图（235杂合突变）图3-8235杂合突变4.2.6突变型型芯片图（ivs7-2杂合突变）图3-9ivs7-2杂合突变第5章讨论5.1TIANampGenomicDNAKit本实验采用使用用TIANampGenomicDNAKit进行血液DNA提取血液中的DNA，此方法价格便宜并且可以快速提取DNA，所提取的DNA片段大、纯度高方便后续实验。通常提取完DNA后要进行定量分析。用紫外分光光度计测定DNA的浓度、OD260/280值。OD260/280比值应为1.7-1.9（OD260值为1等于双链DNA50µg/ml，单链DNA40µg/ml）要求被检组DNA浓度满足3-25ng/µl。如果洗脱时不用洗脱液而是采用去离子水则吸光度比值会下降。（因为PH值以及离子存在会影响吸光度）［8］。样品提取时的注意事项：首次使用之前要先在GD（缓冲液）、PW(漂洗液)中添加无水乙醇。（2）反复冻融会导致样品DNA提取片段变小且含量低，应避免此行为。（3）如果在GA（缓冲液）或GB(缓冲液）中若有沉淀，可将其在37℃水浴中溶解，混匀后使用。5.2晶芯耳聋基因芯片PCR仪在使用之前需要确定其温度不能太高，不然会影响反应。。磁珠纯化过程中：（1）磁珠使用前要充分混匀，离心管的壁上没有磁珠残留。（2）弃掉废液时要尽可能处理干净。（3）实验过程要连贯，否则磁珠干燥会影响实验结果［9］。杂交过程中：（1）10%SDS如果产生絮状白色沉淀，可在50℃水浴变澄清后混匀使用。（2）加样全过程中避免有气泡产生。芯片判读过程：（1）操作过程中避免灰尘落在芯片上干扰结果判读。（2）实验过程中应避免芯片上液体暴露在空气中的时间过长，干扰结果的判读。5.3小结由于在北京博奥公司实习期间的时间有限，我所在的博奥晶典生物技术有限公司质检组学实验室目前只能完成芯片的杂交与结果数据的初步提取与判读，而本实验后续的分析尚未完成。虽然本实验得出完整的相关数据和结果，但样本量有限，结果具有局限性不能以偏概全。而且在实验方面也有很多的不足，但是，通过这次的实习经历让我收获很多，不仅养成了良好的实验操作习惯，见识学习到很多新的实验方法和实验操作技能也同时获得了许多宝贵的人生体验。希望能够在今后的学习过中，能够有机会继续对本课题继续进行研究学习，完善实验结果。

结论1.使用TIANampGenomicDNAKit进行血液DNA提取，DNA片段完整且纯度高，证明采用次方法有效并能够为后续芯片实验提供质量较好的DNA样品。2.晶芯十五项耳聋基因芯片检测，芯片扫描结果完好，可以为数据分析提供良好有效的实验数据和结果分析。可以为预防耳聋提供良好和数据支持。

参考文献杨晶群,余红.5755例新生儿GJB2、12SrRNA耳聋基因检测结果分析[J].中国优生与遗传杂志,2016(2):86-87.胡华梅,胡华,董艳玲,等.新生儿中常见的9个耳聋基因突变位点筛查分析[J].第三军医大学学报,2012,34(2):96-98.李振安,梁淑贞,余凤慈,等.佛山市10238例新生儿听力与耳聋易感基因联合筛查分析[J].听力学及言语疾病杂志,2014(6)