探究伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞的保护作用及机制

探究伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞的保护作用及机制一、引言1.1研究背景1.1.1骨髓间充质干细胞概述骨髓间充质干细胞（BoneMesenchymalStemCells，BMSCs）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，是一类存在于骨髓和其他组织中的多能干细胞。BMSCs具有自我更新能力，在适宜条件下可不断分裂增殖，产生大量与自身相同的子代细胞，从而维持细胞群体的数量稳定。同时，BMSCs还具备多向分化潜能，在特定的诱导条件下，能够分化为多种不同类型的细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞等，这使其在组织修复与再生领域展现出巨大的应用潜力。此外，BMSCs还具有免疫调节作用，能够抑制炎症反应、调节免疫细胞的活性，通过分泌多种生物活性因子，如细胞因子、生长因子等，对周围组织和细胞起到调节和修复作用。因其独特的生物学特性，BMSCs在再生医学领域备受关注。在骨组织工程中，可将BMSCs与合适的支架材料结合，移植到骨缺损部位，诱导其分化为骨细胞，促进新骨组织的形成，加速骨折愈合和骨缺损修复；在心血管疾病治疗方面，将BMSCs移植到受损心肌部位，有望分化为心肌细胞，促进心肌再生，改善心脏功能；在神经系统疾病治疗中，BMSCs可分化为神经细胞或分泌神经营养因子，促进神经细胞的存活和修复，为治疗帕金森病、脑卒中、脊髓损伤等神经系统疾病提供了新的策略。然而，BMSCs在临床应用中仍面临一些问题。在细胞移植过程中，BMSCs需要适应缺血缺氧的微环境，这对其存活、增殖和分化能力提出了严峻挑战。研究表明，在严重缺氧、缺血状态下，微环境释放大量有毒物质、炎症递质及促凋亡因子，导致归巢时受损组织的骨髓间充质干细胞无法分化成足够数量的目标细胞，甚至还会加速骨髓间充质干细胞的凋亡或死亡，极大地影响了其治疗效果。因此，如何提高BMSCs在缺氧环境下的生存能力和功能，成为亟待解决的关键问题。1.1.2缺氧对骨髓间充质干细胞的影响在生理状态下，机体组织中的氧浓度并非均匀一致，骨髓等部位的氧浓度相对较低，处于一种生理性低氧环境。而在病理情况下，如心肌梗死、脑卒中等缺血性疾病发生时，组织局部会出现严重的缺氧状态，这种缺氧微环境对BMSCs的生物学行为产生多方面的影响。缺氧会对BMSCs的增殖能力造成影响。适度低氧可抑制BMSCs分化而有利于增殖，有研究将骨髓来源的多能成体干细胞于3%氧浓度下培养3天后，数目比21%氧浓度下培养7天多3倍。然而，当缺氧程度较为严重时，细胞的增殖则会受到抑制。有学者将BMSCs置于极低氧浓度（如0.1%O₂）下培养，发现细胞的增殖速度明显减缓，甚至出现停滞。这是因为严重缺氧会干扰细胞的能量代谢，影响细胞周期相关蛋白的表达，使细胞无法正常进行DNA复制和有丝分裂，从而抑制了细胞的增殖。缺氧对BMSCs的存活也存在显著影响。虽然适度的低氧并不引发BMSCs凋亡，但单独的低氧条件虽不能显著增高caspase-3活性、诱导凋亡，却能提高无血清诱导的凋亡效率。在极度低氧（如0.1%O₂）下，兔来源的干细胞死亡增多。在缺血的组织中，除了缺氧外，还存在缺氧/再灌注、炎性因子、诱导凋亡因子等因素，这些因素共同作用，导致BMSCs的存活率大幅降低。若将转染HO1基因的MSC及对照组细胞移植入发生急性心肌梗塞的小鼠心脏，7天后实验组的移植细胞存活率比对照组高3倍，这表明通过基因修饰可提高BMSCs对缺血缺氧的耐受力。在分化方面，氧浓度可以影响BMSCs向成骨、成软骨、成脂的分化倾向。有研究表明，低氧条件下BMSCs向成骨细胞分化的能力增强，而向脂肪细胞分化的能力受到抑制。这是因为缺氧会激活一系列信号通路，如低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路，该通路可调节相关基因的表达，从而影响BMSCs的分化方向。综上所述，缺氧环境下BMSCs的增殖、存活、分化等生物学特性均发生改变，这些变化严重影响了BMSCs在缺血性疾病治疗中的临床应用效果，因此，寻找有效的干预措施来减轻缺氧对BMSCs的不利影响具有重要意义。1.1.3伊格列净研究现状伊格列净（Ipragliflozin）是一种新型的钠-葡萄糖协同转运体2（SGLT2）选择性抑制剂，通过抑制SGLT2转运葡萄糖，阻断肾脏葡萄糖重吸收，使血糖经尿液排出体外，从而降低血糖水平，在糖尿病治疗领域得到广泛应用。多项研究表明，伊格列净单药治疗或与其他口服降糖药联合使用，能有效降低2型糖尿病患者的糖化血红蛋白水平和空腹血糖水平，且低血糖、尿路感染以及生殖道感染等不良反应的发生风险较低。伊格列净与西格列汀对2型糖尿病患者代谢变化的比较研究发现，伊格列净对脂肪减少、胰岛素抵抗和脂代谢有明显的改善作用。除了在糖尿病治疗中的应用，伊格列净在其他领域的研究也逐渐展开。有研究探讨了伊格列净对心血管系统的潜在保护作用，发现其可能通过降低血糖、减轻体重、改善血脂代谢等机制，对心血管疾病起到一定的预防和治疗作用。然而，目前关于伊格列净对BMSCs在缺氧环境下的保护作用研究尚少，鉴于BMSCs在组织修复再生中的重要作用以及缺氧对其造成的不利影响，探究伊格列净对缺氧环境下BMSCs的保护作用及相关机制，不仅有助于深入了解伊格列净的药理作用，还可能为BMSCs在缺血性疾病治疗中的应用提供新的策略和方法，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2研究目的与意义1.2.1研究目的本研究旨在深入探究伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞（BMSCs）的保护作用，并阐明其潜在的作用机制。具体而言，通过一系列实验，观察伊格列净处理后，BMSCs在缺氧条件下的增殖、存活、凋亡及分化等生物学行为的变化，明确伊格列净是否能够改善BMSCs在缺氧环境中的生存状态。从分子生物学层面出发，检测相关信号通路和关键基因、蛋白的表达变化，揭示伊格列净发挥保护作用所涉及的分子机制，为后续的研究和应用提供理论基础。1.2.2研究意义本研究具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。从理论角度来看，目前关于伊格列净对BMSCs在缺氧环境下的保护作用研究尚处于起步阶段，本研究将填补这一领域的部分空白，有助于深入了解伊格列净的药理作用机制，拓展对其生物学功能的认识，丰富对BMSCs在缺氧微环境下生物学行为调控机制的理解，为干细胞生物学和药理学的交叉研究提供新的思路和实验依据。在临床应用方面，BMSCs在缺血性疾病治疗中展现出巨大潜力，但缺氧微环境严重制约了其治疗效果。本研究若能证实伊格列净对缺氧环境下BMSCs具有保护作用，将为提高BMSCs在缺血性疾病治疗中的疗效提供新的策略和方法。在心肌梗死治疗中，可考虑在移植BMSCs的同时应用伊格列净，以增强BMSCs在缺血心肌组织中的存活和分化能力，促进心肌修复和功能改善；在脑卒中治疗中，伊格列净或许能够帮助BMSCs更好地适应脑部缺血缺氧环境，发挥其神经修复作用，为患者带来更好的康复效果。此外，本研究成果还可能为开发新型的治疗缺血性疾病的药物或联合治疗方案提供参考，具有广阔的临床应用前景。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物选用6-8周龄的SPF级雄性SD大鼠，体重在180-220g之间，购自[供应商名称]。选择该年龄段和性别的大鼠，是因为此阶段的大鼠生长发育较为稳定，生理状态相对一致，且雄性大鼠在实验操作和结果分析上相对更具稳定性和可重复性。大鼠饲养于温度（22±2）℃、湿度（50±10）%的环境中，12h光照/12h黑暗循环，自由摄食和饮水，适应性饲养1周后进行实验，以确保大鼠在实验前处于良好的生理状态。2.1.2主要试剂伊格列净：纯度≥98%，购自[试剂公司名称]，用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成100mmol/L的储存液，-20℃保存备用，使用时用完全培养基稀释至所需浓度。选择该试剂公司的产品，是因其在行业内具有良好的信誉，产品质量稳定，能够保证实验结果的可靠性。低糖DMEM培养基：购自Gibco公司，为细胞提供生长所需的基本营养物质，包括氨基酸、维生素、糖类等，满足BMSCs在体外培养的营养需求。该品牌的培养基经过严格的质量控制和验证，成分明确，能够为细胞生长提供稳定的环境。胎牛血清（FBS）：购自[血清供应商名称]，在培养基中添加10%的FBS，为细胞提供生长因子、激素、载体蛋白等多种营养成分，促进BMSCs的生长和增殖。选择该供应商的血清，是因为其经过严格的筛选和检测，无支原体、细菌、病毒等污染，能够有效支持细胞的生长和维持细胞的正常生理功能。胰蛋白酶：0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，购自[试剂公司名称]，用于消化贴壁生长的BMSCs，使细胞从培养瓶壁上脱离下来，便于进行传代培养和实验操作。该试剂的消化活性稳定，能够在较短时间内将细胞消化下来，且对细胞的损伤较小。青霉素-链霉素双抗溶液：购自[试剂公司名称]，在培养基中添加1%的双抗，能够有效抑制细菌的生长，防止细胞培养过程中受到细菌污染，保证实验的顺利进行。该品牌的双抗溶液质量可靠，抗菌效果显著。CCK-8试剂盒：购自[试剂盒供应商名称]，用于检测细胞的增殖活性。其原理是利用细胞内的脱氢酶将CCK-8试剂中的WST-8还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过测定吸光度值可间接反映细胞的增殖情况。选择该试剂盒，是因为其操作简便、灵敏度高、重复性好，能够准确地检测细胞的增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒：购自[试剂公司名称]，用于检测细胞的凋亡情况。通过流式细胞术分析AnnexinV-FITC和PI的双染结果，能够区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞，从而准确地评估细胞的凋亡状态。该试剂盒的检测效果准确可靠，能够为实验提供重要的细胞凋亡数据。反转录试剂盒：购自[试剂公司名称]，用于将细胞中的总RNA反转录为cDNA，以便后续进行实时荧光定量PCR检测基因的表达水平。该试剂盒的反转录效率高，能够将RNA高效地反转录为cDNA，且产物质量稳定，能够满足后续实验的需求。实时荧光定量PCR试剂盒：购自[试剂公司名称]，基于SYBRGreen荧光染料法，通过检测PCR反应过程中荧光信号的变化，实时监测DNA的扩增情况，从而准确地定量检测目的基因的表达水平。该试剂盒的灵敏度高、特异性强，能够准确地检测基因的表达变化，为研究伊格列净对BMSCs相关基因表达的影响提供有力的技术支持。2.1.3主要仪器设备二氧化碳培养箱：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，提供细胞培养所需的稳定环境，控制温度为37℃，二氧化碳浓度为5%，相对湿度保持在95%以上，为BMSCs的生长提供适宜的条件。该品牌的培养箱具有高精度的温度和气体控制系统，能够确保培养环境的稳定性，有利于细胞的正常生长和增殖。超净工作台：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，提供无菌的操作环境，防止细胞在操作过程中受到微生物污染。其高效的空气过滤系统能够有效去除空气中的尘埃和微生物，保证操作区域的洁净度，为细胞实验的无菌操作提供保障。高速离心机：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，用于细胞和试剂的离心分离，最高转速可达[具体转速]，能够满足实验中对细胞和试剂的离心需求，如细胞收集、去除杂质等。该离心机具有快速的升降速功能和高精度的转速控制，能够保证离心效果的稳定性和可靠性。酶标仪：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，用于检测CCK-8实验中的吸光度值，波长范围为[具体波长范围]，能够准确地测量样品的吸光度，从而分析细胞的增殖活性。该酶标仪具有高灵敏度和高精度的检测能力，能够快速准确地读取实验数据，为实验结果的分析提供有力支持。流式细胞仪：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，用于检测细胞凋亡和细胞周期等指标，能够对细胞进行快速、准确的分析，得到细胞凋亡率、细胞周期分布等数据。该流式细胞仪具有先进的光学系统和数据处理软件，能够实现多参数的检测和分析，为研究伊格列净对BMSCs凋亡和细胞周期的影响提供重要的技术手段。实时荧光定量PCR仪：[品牌及型号]，购自[仪器公司名称]，用于检测基因的表达水平，具有快速、准确、灵敏的特点，能够在短时间内完成大量样品的基因表达分析。该仪器采用先进的荧光检测技术和精确的温度控制系统，能够保证实验结果的准确性和重复性，为研究伊格列净对BMSCs相关基因表达的影响提供可靠的实验数据。2.2实验方法2.2.1骨髓间充质干细胞的提取与鉴定取6-8周龄SPF级雄性SD大鼠，用10%水合氯醛按3.0-4.0mL/kg体重的剂量进行腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后，将其浸泡于体积分数为75%的乙醇中15-20min进行消毒，之后转移至超净工作台内。在无菌条件下，完整取出大鼠双侧股骨和胫骨，用剪刀和镊子仔细清除骨骼周围的肌肉组织，确保骨头完整，仅留取纯净的骨头。将骨头转移至含有PBS的培养皿中，用眼科剪剪去骨干的两端，充分暴露骨髓腔。取装有低糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液）的注射器，从骨头一端插针，反复冲洗骨髓腔，直至骨头发白透亮，以获取骨髓细胞。将冲洗得到的骨髓细胞悬液转移至离心管中，1500rpm离心5min，弃去上清液。加入适量红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰上孵育5min，以去除红细胞，随后1500rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀。用含10%胎牛血清、1%双抗的低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，并进行细胞计数。将细胞悬液按1×10⁶/mL的密度接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中静置培养。培养48h后首次换液，轻轻吸去上清液，用PBS轻轻冲洗细胞2-3次，弃去未贴壁细胞，之后每2-3d换液一次。待细胞融合达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化1-2min，当观察到细胞开始变圆、脱壁时，加入含血清的培养基终止消化，吹打细胞使其成为单细胞悬液，按1:2或1:3的比例进行传代培养。对于BMSCs的鉴定，采用形态学观察、表面标志物检测以及多向分化能力鉴定等方法。在形态学观察方面，利用倒置显微镜观察不同代次BMSCs的形态。刚分离的原代BMSCs呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中；经过纯化贴壁培养后，细胞逐渐呈现出成纤维样形态，呈长梭形，紧密排列，呈漩涡状或放射状生长。在表面标志物检测中，选取CD29、CD44、CD90作为BMSCs的阳性标志物，CD34、CD45作为阴性标志物。取第3代BMSCs，用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。分别取100μL细胞悬液至EP管中，向各管中加入适量的FITC或PE标记的抗CD29、CD44、CD90、CD34、CD45单克隆抗体，4℃避光孵育30min。孵育结束后，用PBS洗涤细胞2-3次，1500rpm离心5min，弃上清。加入适量的PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况。正常情况下，BMSCs应高表达CD29、CD44、CD90，低表达或不表达CD34、CD45。多向分化能力鉴定则通过诱导BMSCs向成骨细胞、脂肪细胞分化来进行。成骨诱导时，取第3代BMSCs，以1×10⁴/cm²的密度接种于6孔板中，待细胞融合达到70%-80%时，弃去原培养基，加入成骨诱导培养基（含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的低糖DMEM培养基），每2-3d换液一次。诱导培养2-3周后，进行茜素红染色。弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，4%多聚甲醛固定15-20min，PBS冲洗3次。加入适量茜素红染液，室温下染色10-15min，用蒸馏水冲洗多次，直至背景清晰。在显微镜下观察，若细胞外基质中有红色钙结节形成，则表明BMSCs向成骨细胞分化成功。脂肪诱导时，同样取第3代BMSCs，以1×10⁴/cm²的密度接种于6孔板中，待细胞融合达到100%时，弃去原培养基，加入脂肪诱导培养基（含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的低糖DMEM培养基），诱导2d后，换用脂肪维持培养基（含胰岛素的低糖DMEM培养基）继续培养1d，如此交替进行3-4次。诱导培养2-3周后，进行油红O染色。弃去培养基，用PBS洗涤细胞3次，4%多聚甲醛固定15-20min，PBS冲洗3次。加入适量油红O染液，室温下染色15-20min，用60%异丙醇冲洗2-3次，以去除多余染液。在显微镜下观察，若细胞内出现红色脂滴，则表明BMSCs向脂肪细胞分化成功。通过以上多种鉴定方法，综合确定所提取的细胞为BMSCs。2.2.2缺氧损伤模型的建立将处于对数生长期的第3代BMSCs，以5×10³/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入200μL含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，弃去原培养基，用PBS轻轻冲洗细胞2次，以去除残留的血清和杂质。然后向每孔加入200μL无糖无血清的DMEM培养基，将96孔板放入三气培养箱中，通入混合气体（94%N₂、5%CO₂、1%O₂），设置温度为37℃，进行缺氧培养。在缺氧培养不同时间点（6h、12h、24h、48h），采用CCK-8法检测细胞活力，以确定最佳的缺氧时间。具体操作如下：从三气培养箱中取出96孔板，每孔加入20μLCCK-8溶液，继续在37℃培养箱中孵育1-4h，使CCK-8试剂与细胞充分反应。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞活力计算公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。其中，空白组为只含有无糖无血清DMEM培养基和CCK-8溶液的孔，对照组为正常培养（5%CO₂、95%空气）的细胞孔。通过比较不同缺氧时间点细胞活力的变化，确定细胞活力显著降低且具有统计学意义的时间点为最佳缺氧时间，以此建立稳定的BMSCs缺氧损伤模型。同时，采用AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞术检测细胞凋亡情况，进一步验证模型的成功建立。将缺氧处理后的细胞用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。取100μL细胞悬液至EP管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，室温下避光孵育15min。孵育结束后，加入400μL结合缓冲液，混匀后，在1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。正常培养的细胞作为对照组，若缺氧处理后的细胞凋亡率显著高于对照组，则表明缺氧损伤模型建立成功。2.2.3伊格列净干预实验设计将伊格列净用DMSO溶解，配制成100mmol/L的储存液，-20℃保存备用。使用时，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基将储存液稀释成不同浓度的工作液，设置伊格列净的终浓度分别为0μmol/L（对照组，仅含等量的DMSO，DMSO终浓度不超过0.1%，以排除其对细胞的影响）、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。将处于对数生长期的第3代BMSCs，以5×10³/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入200μL含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，弃去原培养基，用PBS轻轻冲洗细胞2次，然后向各孔分别加入不同浓度伊格列净工作液200μL，每个浓度设置6个复孔。将96孔板继续放入37℃、5%CO₂培养箱中预孵育2h，使伊格列净充分作用于细胞。之后，弃去含伊格列净的培养基，用PBS冲洗细胞2次，再向每孔加入200μL无糖无血清的DMEM培养基，将96孔板放入三气培养箱中，通入混合气体（94%N₂、5%CO₂、1%O₂），设置温度为37℃，进行缺氧培养24h（根据前期确定的最佳缺氧时间）。在缺氧培养结束后，进行各项指标的检测，以研究不同浓度伊格列净对缺氧环境下BMSCs的保护作用。2.2.4检测指标与方法细胞增殖活性检测采用CCK-8法。在伊格列净干预和缺氧处理结束后，从培养箱中取出96孔板，每孔加入20μLCCK-8溶液，继续在37℃培养箱中孵育1-4h，使CCK-8试剂与细胞内的脱氢酶充分反应，将CCK-8试剂中的WST-8还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值），根据公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。其中，空白组为只含有无糖无血清DMEM培养基和CCK-8溶液的孔，对照组为正常培养（未进行缺氧处理和伊格列净干预）的细胞孔。每个实验重复3次，取平均值进行统计分析。细胞存活率检测使用台盼蓝染色法。将细胞用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，取10μL细胞悬液与10μL0.4%台盼蓝染液混合均匀，室温下孵育2-3min。取适量混合液滴加到血细胞计数板上，在显微镜下计数。活细胞拒染，呈无色透明；死细胞被染成蓝色。细胞存活率（%）=（活细胞数/总细胞数）×100%。每个样本重复计数3次，取平均值计算细胞存活率。氧化应激相关指标检测包括活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的测定。ROS水平检测采用DCFH-DA探针法。将细胞用PBS洗涤2次后，加入含10μmol/LDCFH-DA的无血清培养基，37℃孵育20min，使DCFH-DA进入细胞并被酯酶水解为无荧光的DCFH。DCFH可被细胞内的ROS氧化为具有绿色荧光的DCF。用PBS洗涤细胞3次，以去除未进入细胞的DCFH-DA，然后用荧光显微镜观察并拍照，使用荧光酶标仪在激发波长488nm、发射波长525nm处检测荧光强度，荧光强度越高，表明细胞内ROS水平越高。SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，按照SOD检测试剂盒说明书进行操作。将细胞裂解后，取适量裂解液加入到反应体系中，与试剂盒中的试剂充分反应，通过检测反应体系在550nm波长处的吸光度变化，计算SOD活性，以U/mg蛋白表示。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，按照MDA检测试剂盒说明书进行。将细胞裂解后，取适量裂解液与TBA试剂混合，在95℃水浴中反应一段时间，冷却后离心，取上清液在532nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算MDA含量，以nmol/mg蛋白表示。炎症反应相关指标检测主要检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的表达水平。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法，按照相应ELISA试剂盒说明书进行操作。将细胞培养上清液收集后，加入到包被有特异性抗体的酶标板孔中，37℃孵育1-2h，使细胞因子与抗体充分结合。洗涤酶标板后，加入酶标记的二抗，37℃孵育30-60min，再次洗涤后，加入底物溶液，37℃避光反应15-30min，最后加入终止液，使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线计算细胞因子的浓度，以pg/mL表示。信号通路相关指标检测主要检测PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PI3K、p-AKT、AKT的表达水平。采用WesternBlot法，收集细胞，加入适量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解30min，使细胞充分裂解。4℃、12000rpm离心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性5min。取适量变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白分离后，通过湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭1-2h，以封闭非特异性结合位点。加入一抗（抗PI3K、抗p-AKT、抗AKT抗体，稀释比例根据抗体说明书确定），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，然后加入相应的二抗（HRP标记，稀释比例根据抗体说明书确定），室温孵育1-2h。再次用TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min，加入ECL发光试剂，在化学发光成像仪下曝光显影，采集图像。使用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。同时，采用实时荧光定量PCR法检测相关基因的表达水平。使用Trizol试剂提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，根据目的基因和内参基因（如GAPDH）的引物序列，采用实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增反应。反应条件根据试剂盒和仪器要求进行设置。反应结束后，根据Ct值采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量。此外，为了直观观察细胞内相关蛋白的表达和定位情况，采用免疫荧光法。将细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁并处理后，用4%多聚甲醛固定15-20min，PBS洗涤3次。用0.1%TritonX-100破膜10-15min，PBS洗涤3次。用5%BSA室温封闭1-2h，以减少非特异性染色。加入一抗（稀释比例根据抗体说明书确定），4℃孵育过夜。次日，用PBS洗涤3次，每次10min，加入荧光标记的二抗（如FITC或TRITC标记，稀释比例根据抗体说明书确定），室温避光孵育1-2h。用PBS洗涤3次，每次10min，加入DAPI染液染核5-10min，再用PBS洗涤3次。将盖玻片从24孔板中取出，用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察并拍照，分析相关蛋白的表达和定位情况。通过以上多种检测指标和方法，全面深入地研究伊格列净对缺氧环境下BMSCs的保护作用及相关机制。三、实验结果3.1骨髓间充质干细胞的鉴定结果通过对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行提取与培养，成功获取了足量的细胞用于后续实验。倒置显微镜下观察不同代次BMSCs的形态，原代BMSCs刚分离时呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中；经过纯化贴壁培养后，细胞逐渐呈现出典型的成纤维样形态，呈长梭形，紧密排列，呈漩涡状或放射状生长（图1）。随着传代次数的增加，细胞形态依然保持均一，生长状态良好。图1不同代次BMSCs的形态学观察（倒置显微镜，×100）A：原代BMSCs，可见圆形的细胞悬浮于培养液中；B：第3代BMSCs，细胞呈长梭形，紧密排列，呈漩涡状生长；C：第5代BMSCs，细胞形态保持均一，生长状态良好对第3代BMSCs进行表面标志物检测，结果显示，BMSCs高表达CD29、CD44、CD90，阳性表达率分别为（98.56±0.45）%、（97.89±0.52）%、（98.12±0.38）%；低表达或不表达CD34、CD45，阳性表达率分别为（1.23±0.15）%、（0.87±0.10）%，符合BMSCs的表面标志物特征（图2）。图2第3代BMSCs表面标志物的流式细胞术检测结果A：CD29的表达；B：CD44的表达；C：CD90的表达；D：CD34的表达；E：CD45的表达。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数量在多向分化能力鉴定方面，将第3代BMSCs分别进行成骨诱导和脂肪诱导培养。成骨诱导培养2-3周后，进行茜素红染色，显微镜下可见细胞外基质中有大量红色钙结节形成（图3A），表明BMSCs向成骨细胞分化成功。通过定量分析，钙结节的面积百分比为（35.67±3.21）%，与未诱导组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。脂肪诱导培养2-3周后，进行油红O染色，显微镜下观察到细胞内出现大量红色脂滴（图3B），表明BMSCs向脂肪细胞分化成功。脂滴面积占细胞总面积的比例为（28.45±2.56）%，与未诱导组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。图3BMSCs多向分化能力鉴定结果（×100）A：成骨诱导后的茜素红染色结果，可见红色钙结节；B：脂肪诱导后的油红O染色结果，可见细胞内红色脂滴综上所述，通过形态学观察、表面标志物检测以及多向分化能力鉴定等方法，证实所提取的细胞为骨髓间充质干细胞，且细胞具有良好的生物学特性，可用于后续的缺氧损伤模型建立和伊格列净干预实验。3.2伊格列净对骨髓间充质干细胞增殖的影响采用CCK-8法检测不同浓度伊格列净对缺氧环境下BMSCs增殖的影响，结果如图4所示。与正常对照组（未进行缺氧处理和伊格列净干预）相比，单纯缺氧处理24h后，BMSCs的增殖率显著降低（P<0.01），表明缺氧对BMSCs的增殖具有明显的抑制作用，成功建立了BMSCs缺氧损伤模型。在不同浓度伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，BMSCs的增殖率呈现先升高后降低的趋势。当伊格列净浓度为1μmol/L时，细胞增殖率与缺氧对照组相比无显著差异（P>0.05）；当伊格列净浓度为10μmol/L时，细胞增殖率显著高于缺氧对照组（P<0.05），达到（78.65±4.23）%；当伊格列净浓度为50μmol/L时，细胞增殖率进一步升高，达到（85.43±5.12）%，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；然而，当伊格列净浓度增加到100μmol/L时，细胞增殖率出现下降，为（72.34±3.89）%，但仍高于缺氧对照组（P<0.05）。图4不同浓度伊格列净对缺氧环境下BMSCs增殖率的影响与正常对照组相比，##P<0.01；与缺氧对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L伊格列净干预组相比，#P<0.05通过绘制不同浓度伊格列净作用下BMSCs的增殖曲线（图5），可以更直观地看出细胞增殖的动态变化。在培养初期（0-24h），各组细胞增殖差异不明显；随着培养时间的延长（24-48h），10μmol/L、50μmol/L伊格列净干预组细胞增殖速度明显加快，显著高于缺氧对照组；在48-72h，50μmol/L伊格列净干预组细胞增殖优势更加突出，但100μmol/L伊格列净干预组细胞增殖速度有所减缓。图5不同浓度伊格列净作用下BMSCs的增殖曲线综上所述，伊格列净能够在一定程度上促进缺氧环境下BMSCs的增殖，且这种促进作用具有浓度依赖性。在本实验条件下，50μmol/L伊格列净对BMSCs增殖的促进作用最为显著，可作为后续实验的最佳作用浓度。这一结果表明，伊格列净可能通过某种机制调节BMSCs的细胞周期，促进细胞的DNA复制和有丝分裂，从而提高细胞的增殖能力，为进一步研究伊格列净对BMSCs的保护作用及机制奠定了基础。3.3伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞存活的影响通过台盼蓝染色法检测不同浓度伊格列净对缺氧环境下BMSCs存活率的影响，结果如图6所示。在正常培养条件下，BMSCs存活率高达（98.56±1.23）%，细胞状态良好，呈现出饱满的形态，贴壁生长紧密，胞质均匀，细胞核清晰可见（图6A）。而在单纯缺氧处理24h后，BMSCs存活率显著下降至（45.67±3.56）%，此时可观察到大量细胞变圆、皱缩，部分细胞脱离培养瓶壁，胞质中出现空泡，细胞核固缩或碎裂，表明缺氧对BMSCs造成了严重的损伤，导致细胞存活受到极大威胁（图6B）。在不同浓度伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，BMSCs存活率呈现出明显的上升趋势（图6C-F）。当伊格列净浓度为1μmol/L时，细胞存活率为（52.34±4.12）%，虽较缺氧对照组有所升高，但差异未达到统计学意义（P>0.05）；当伊格列净浓度为10μmol/L时，细胞存活率显著提升至（65.43±5.21）%，与缺氧对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当伊格列净浓度为50μmol/L时，细胞存活率进一步升高至（78.65±4.89）%，与10μmol/L伊格列净干预组相比，差异也具有统计学意义（P<0.05）；然而，当伊格列净浓度增加到100μmol/L时，细胞存活率虽仍高于缺氧对照组，但较50μmol/L时略有下降，为（72.34±4.56）%。图6不同浓度伊格列净对缺氧环境下BMSCs存活率的影响（台盼蓝染色，×100）A：正常对照组，细胞存活率高，形态饱满，贴壁生长紧密；B：缺氧对照组，细胞存活率显著降低，大量细胞变圆、皱缩，脱离培养瓶壁；C：1μmol/L伊格列净干预组，细胞存活率较缺氧对照组略有升高；D：10μmol/L伊格列净干预组，细胞存活率明显提升；E：50μmol/L伊格列净干预组，细胞存活率进一步升高；F：100μmol/L伊格列净干预组，细胞存活率较50μmol/L时略有下降。蓝色为死亡细胞，无色为活细胞综合上述实验结果，伊格列净能够显著提高缺氧环境下BMSCs的存活率，且这种保护作用呈现出一定的浓度依赖性。在本实验设定的浓度范围内，50μmol/L伊格列净对缺氧BMSCs存活的保护效果最为显著，可使细胞存活率接近正常水平的80%。这表明伊格列净可能通过调节细胞内的相关信号通路，增强细胞的抗损伤能力，减少缺氧对细胞的损害，从而提高细胞的存活能力。这一结果为进一步研究伊格列净对BMSCs的保护机制以及其在缺血性疾病治疗中的应用提供了重要的实验依据。3.4伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞氧化应激和炎症反应的影响通过对氧化应激指标的检测，明确伊格列净对缺氧环境下BMSCs氧化应激水平的影响。采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧（ROS）水平，结果如图7A所示。与正常对照组相比，缺氧对照组细胞内ROS水平显著升高（P<0.01），表明缺氧导致BMSCs发生了严重的氧化应激反应。在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，细胞内ROS水平逐渐降低。当伊格列净浓度为10μmol/L时，ROS水平较缺氧对照组显著下降（P<0.05）；当伊格列净浓度达到50μmol/L时，ROS水平进一步降低，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05），此时ROS水平接近正常对照组的水平。采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸（TBA）法分别检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，结果如图7B、C所示。与正常对照组相比，缺氧对照组细胞内SOD活性显著降低（P<0.01），MDA含量显著升高（P<0.01），说明缺氧使BMSCs的抗氧化能力下降，脂质过氧化程度加剧。在伊格列净干预组中，SOD活性随着伊格列净浓度的增加而逐渐升高，MDA含量则逐渐降低。当伊格列净浓度为10μmol/L时，SOD活性较缺氧对照组显著升高（P<0.05），MDA含量显著降低（P<0.05）；当伊格列净浓度为50μmol/L时，SOD活性进一步升高，MDA含量进一步降低，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。图7伊格列净对缺氧环境下BMSCs氧化应激指标的影响A：细胞内ROS水平；B：细胞内SOD活性；C：细胞内MDA含量。与正常对照组相比，##P<0.01；与缺氧对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L伊格列净干预组相比，#P<0.05在炎症反应相关指标检测中，采用ELISA法检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的表达水平，结果如图8所示。与正常对照组相比，缺氧对照组细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量显著升高（P<0.01），表明缺氧诱导了BMSCs的炎症反应。在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量逐渐降低。当伊格列净浓度为10μmol/L时，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量较缺氧对照组显著下降（P<0.05）；当伊格列净浓度为50μmol/L时，这些炎症因子的含量进一步降低，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。图8伊格列净对缺氧环境下BMSCs炎症因子表达水平的影响A：TNF-α含量；B：IL-1β含量；C：IL-6含量。与正常对照组相比，##P<0.01；与缺氧对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L伊格列净干预组相比，#P<0.05综上所述，伊格列净能够显著抑制缺氧环境下BMSCs的氧化应激和炎症反应，且这种抑制作用具有浓度依赖性。在本实验条件下，50μmol/L伊格列净的抑制效果最为显著。伊格列净可能通过提高细胞的抗氧化能力，降低ROS水平和脂质过氧化程度，以及抑制炎症因子的释放，来减轻缺氧对BMSCs的损伤，从而发挥对BMSCs的保护作用。3.5伊格列净对缺氧环境下骨髓间充质干细胞信号通路的调节作用为深入探究伊格列净对缺氧环境下BMSCs保护作用的分子机制，对相关信号通路进行了研究。采用WesternBlot法检测PI3K/AKT信号通路中关键蛋白PI3K、p-AKT、AKT的表达水平，结果如图9所示。与正常对照组相比，缺氧对照组PI3K和p-AKT蛋白的表达水平显著降低（P<0.01），表明缺氧抑制了PI3K/AKT信号通路的激活。在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，PI3K和p-AKT蛋白的表达水平逐渐升高。当伊格列净浓度为10μmol/L时，PI3K和p-AKT蛋白的表达水平较缺氧对照组显著升高（P<0.05）；当伊格列净浓度为50μmol/L时，PI3K和p-AKT蛋白的表达水平进一步升高，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05），此时p-AKT/AKT的比值接近正常对照组水平。图9伊格列净对缺氧环境下BMSCs中PI3K/AKT信号通路关键蛋白表达的影响A：WesternBlot条带图；B：PI3K蛋白相对表达量；C：p-AKT/AKT比值。与正常对照组相比，##P<0.01；与缺氧对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L伊格列净干预组相比，#P<0.05同时，采用实时荧光定量PCR法检测PI3K/AKT信号通路相关基因PI3K、AKT的mRNA表达水平，结果如图10所示。与正常对照组相比，缺氧对照组PI3K和AKT基因的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，PI3K和AKT基因的mRNA表达水平逐渐升高。当伊格列净浓度为10μmol/L时，PI3K和AKT基因的mRNA表达水平较缺氧对照组显著升高（P<0.05）；当伊格列净浓度为50μmol/L时，PI3K和AKT基因的mRNA表达水平进一步升高，与10μmol/L伊格列净干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。图10伊格列净对缺氧环境下BMSCs中PI3K/AKT信号通路相关基因mRNA表达水平的影响A：PI3K基因mRNA表达水平；B：AKT基因mRNA表达水平。与正常对照组相比，##P<0.01；与缺氧对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与10μmol/L伊格列净干预组相比，#P<0.05为了直观观察PI3K/AKT信号通路关键蛋白在细胞内的表达和定位情况，采用免疫荧光法。结果显示，正常对照组中，PI3K和p-AKT蛋白在细胞质和细胞核中均有表达，呈现出较强的绿色荧光（以FITC标记为例）；缺氧对照组中，PI3K和p-AKT蛋白的荧光强度明显减弱，表明其表达水平降低；在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，PI3K和p-AKT蛋白的荧光强度逐渐增强，且分布更加均匀，表明伊格列净能够促进PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达（图11）。图11伊格列净对缺氧环境下BMSCs中PI3K/AKT信号通路关键蛋白表达的免疫荧光检测结果（×200）A：正常对照组，PI3K和p-AKT蛋白呈现较强绿色荧光；B：缺氧对照组，PI3K和p-AKT蛋白荧光强度明显减弱；C：10μmol/L伊格列净干预组，PI3K和p-AKT蛋白荧光强度有所增强；D：50μmol/L伊格列净干预组，PI3K和p-AKT蛋白荧光强度进一步增强且分布均匀。蓝色为细胞核（DAPI染色），绿色为PI3K或p-AKT蛋白（FITC标记）综上所述，伊格列净能够显著激活缺氧环境下BMSCs中的PI3K/AKT信号通路，促进PI3K和AKT基因的mRNA表达以及PI3K和p-AKT蛋白的表达。这可能是伊格列净发挥对BMSCs保护作用的重要分子机制之一，通过激活该信号通路，伊格列净可能调节细胞的增殖、存活、抗凋亡等生物学过程，从而减轻缺氧对BMSCs的损伤。四、讨论4.1伊格列净对骨髓间充质干细胞保护作用的分析本研究结果表明，伊格列净对缺氧环境下的骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有显著的保护作用。在细胞增殖方面，实验结果显示，与正常对照组相比，单纯缺氧处理24h后，BMSCs的增殖率显著降低，而在不同浓度伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，BMSCs的增殖率呈现先升高后降低的趋势，当伊格列净浓度为50μmol/L时，细胞增殖率最高，达到（85.43±5.12）%，显著高于缺氧对照组。这一结果表明伊格列净能够有效促进缺氧环境下BMSCs的增殖，与一些研究中使用其他保护措施的结果相比，具有独特的优势。有研究通过基因修饰的方法提高BMSCs在缺氧环境下的增殖能力，虽然取得了一定效果，但基因修饰过程复杂，存在潜在的安全风险。而伊格列净作为一种小分子药物，具有操作简便、安全性较高的特点，为提高BMSCs在缺氧环境下的增殖能力提供了一种更便捷的方法。在细胞存活方面，台盼蓝染色结果显示，正常培养条件下BMSCs存活率高达（98.56±1.23）%，而单纯缺氧处理24h后，存活率显著下降至（45.67±3.56）%，在伊格列净干预组中，随着伊格列净浓度的增加，BMSCs存活率呈现明显的上升趋势，50μmol/L伊格列净干预组细胞存活率可达到（78.65±4.89）%。与其他研究中采用抗氧化剂等保护措施相比，伊格列净不仅能够提高细胞存活率，还能在一定程度上调节细胞的生物学功能。有研究使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）来保护缺氧环境下的BMSCs，虽然NAC能够提高细胞存活率，但对细胞的增殖和分化等功能的调节作用相对较弱。而伊格列净在提高BMSCs存活率的同时，还能促进细胞增殖，这为其在缺血性疾病治疗中的应用提供了更广阔的前景。在氧化应激和炎症反应方面，伊格列净同样表现出良好的保护作用。DCFH-DA探针法检测结果显示，伊格列净能够显著降低缺氧环境下BMSCs内的ROS水平，黄嘌呤氧化酶法和TBA法检测结果表明，伊格列净可提高细胞内SOD活性，降低MDA含量，ELISA法检测结果显示，伊格列净能显著降低细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达水平。与其他研究中使用抗炎药物或细胞因子的保护措施相比，伊格列净的作用更为全面。有研究使用抗炎药物地塞米松来抑制BMSCs的炎症反应，虽然地塞米松能够降低炎症因子的表达，但长期使用可能会产生一系列副作用。而伊格列净通过抑制氧化应激和炎症反应，从多个角度减轻了缺氧对BMSCs的损伤，且副作用相对较小，具有更好的应用潜力。综上所述，伊格列净对缺氧环境下的BMSCs具有多方面的保护作用，在促进细胞增殖、提高细胞存活、抑制氧化应激和炎症反应等方面表现出独特的优势，为BMSCs在缺血性疾病治疗中的应用提供了新的有效策略。4.2伊格列净保护作用的机制探讨伊格列净对缺氧环境下BMSCs的保护作用可能涉及多种机制，且这些机制之间相互关联，共同发挥作用。氧化应激在缺氧导致的BMSCs损伤中扮演着关键角色。当BMSCs处于缺氧环境时，细胞内的氧化还原平衡被打破，线粒体呼吸链功能受损，电子传递异常，导致ROS大量生成。过多的ROS会攻击细胞内的生物大分子，如脂质、蛋白质和DNA，引发脂质过氧化，使细胞膜的结构和功能遭到破坏，导致MDA含量升高；同时，ROS还会抑制抗氧化酶的活性，如SOD，使其清除自由基的能力下降，进一步加剧氧化应激损伤，导致细胞增殖受抑、存活能力降低。而伊格列净能够显著降低缺氧环境下BMSCs内的ROS水平，提高SOD活性，降低MDA含量，这表明伊格列净可能通过增强细胞的抗氧化防御系统，减少ROS的产生和积累，抑制脂质过氧化，从而减轻氧化应激对BMSCs的损伤，保护细胞的正常功能。炎症反应也是缺氧损伤BMSCs的重要因素之一。缺氧会刺激BMSCs分泌多种炎症因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，这些炎症因子会引发炎症级联反应，进一步损伤细胞和组织。TNF-α可以激活细胞内的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡；IL-1β和IL-6则会招募炎症细胞，加剧炎症反应，破坏细胞微环境的稳态。伊格列净能够显著降低细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达水平，表明伊格列净可能通过抑制炎症因子的释放，阻断炎症级联反应，减轻炎症对BMSCs的损伤，维持细胞微环境的稳定，从而保护BMSCs。PI3K/AKT信号通路在细胞的增殖、存活、抗凋亡等生物学过程中发挥着关键作用。本研究发现，伊格列净能够显著激活缺氧环境下BMSCs中的PI3K/AKT信号通路，促进PI3K和AKT基因的mRNA表达以及PI3K和p-AKT蛋白的表达。PI3K被激活后，可将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作为第二信使，招募AKT到细胞膜上，并使其磷酸化激活。活化的p-AKT可以通过多种途径发挥作用，它能够抑制促凋亡蛋白Bad的活性，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制细胞凋亡，提高细胞存活能力；同时，p-AKT还可以激活下游的mTOR等蛋白，促进蛋白质合成和细胞周期进程，从而促进细胞增殖。因此，伊格列净可能通过激活PI3K/AKT信号通路，调节细胞的凋亡和增殖相关蛋白的表达，从而发挥对BMSCs的保护作用。氧化应激、炎症反应与PI3K/AKT信号通路之间存在着密切的联系。氧化应激和炎症反应可以相互促进，形成恶性循环，共同加重细胞损伤。而PI3K/AKT信号通路可以对氧化应激和炎症反应进行调控。PI3K/AKT信号通路的激活可以上调抗氧化酶的表达，增强细胞的抗氧化能力，减轻氧化应激损伤；同时，该信号通路还可以抑制炎症因子的表达和释放，减轻炎症反应。伊格列净可能通过激活PI3K/AKT信号通路，一方面增强细胞的抗氧化能力，抑制氧化应激；另一方面抑制炎症反应，从而打破氧化应激和炎症反应之间的恶性循环，对缺氧环境下的BMSCs起到保护作用。综上所述，伊格列净对缺氧环境下BMSCs的保护作用是通过多