DB21-T 3648-2022 鹿冷冻精液生产技术规程

ICS65.020.30CCSB4421IDB21/T3648—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：桓仁强风鹿业科研繁育基地、辽宁省农业发展服务中心、辽宁省参茸产品质量监督检验中心、桓仁满族自治县重点产业发展服务中心。本文件主要起草人：关春梁、邓福金、赵刚、李宁、关伟国、许传友、刘映雪、罗剑通、陈庆利、杜岳纯、樊琳琳、田景鑫、丁国伟、杜学海、宫婷、范雪、周金丹。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区本文件起草单位通讯地址:桓仁强风鹿业科研繁育基地（本溪市桓仁县铧来镇），联系电话DB21/T3648—20221鹿冷冻精液生产技术规程本文件规定了鹿冷冻精液生产的采精前准备、采精、精液品质评定、精液稀释、精液分装、精液冷冻、冻精活力检查、冻精包装储存和记录等技术内容。本文件适用于梅花鹿、马鹿的冷冻精液生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/TGB/TGB/T69356936液氮生物容器中国梅花鹿种鹿东北马鹿种鹿NY1181输精细管3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4采精前准备4.1采精场所应保持安静、宽敞、明亮，地面清洁卫生。4.2采精员应剪短指甲，更换好工作服和鞋帽，戴上工作手套。4.3种公鹿4.3.1种公鹿应符合GB/T6935和GB/T6936的规定，综合评定等级一级或特级，三代系谱资料完整，体质健康，无规定疫病。4.3.2种公鹿采精前24h应停止饮水和饲喂。4.4器具和药品电子天平（0.01mg）、磁力搅拌器（20mL～1000mL）、三角烧杯（250mL）、量筒（50mL）、移液枪（0.5mL～5mL）、胶头滴管、无菌箱、水浴锅（32℃~35℃),电刺激采精器（0V～30V）、电极棒(Φ40mm）、双目生物显微镜（200倍～400倍）、恒温加热板（37℃~38℃)、简易冷冻箱2DB21/T3648—2022（50mm×80mm×40mm）、自动冷冻仪、自动细管灌装机、精子密度测定仪、托架（100支）、冷藏柜（3℃~5℃)、冰箱（0℃~5℃)、塑料盒（150mm×15mm）、液氮罐（30L）、一次性长臂塑料手套、灭菌纱布、毛巾、医用不锈钢手术剪、细管夹（23cm）、集精杯（20mL）、液体石蜡、包装袋（170mm×45mm）、拇指管(Φ13mm）、细管（0.25mL）、封口粉（聚乙烯醇粉）、载玻片（76mm×26mm×1mm）、盖玻片（18mm×18mm）、麻绳、木棒、滤纸、胶塞；生理盐水、双重蒸馏水、酒精（75%）、陆眠宁（盐酸塞拉嗪）、鹿醒宁（盐酸苯噁唑）、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、柠檬酸、果糖、甘油、青霉素、链霉素等。4.5器具清洗和消毒使用后或新购置的玻璃器皿、金属制品、橡胶制品，如集精杯、烧杯、量筒、滴管、剪子、镊子、胶塞、电极棒等，先在加有洗涤剂的温水中洗刷，之后用清水冲洗干净，晾干后用75%酒精消毒，待酒精自然挥发后放无菌箱中保存备用。4.6稀释液4.6.1稀释液配方Tris2.42g、柠檬酸1.38g、果糖1.0g、甘油7.0mL、卵黄20mL、双重蒸馏水73mL、青4.6.2稀释液配制方法准确称取Tris2.42g、柠檬酸1.38g、果糖1g，倒入三角烧瓶中，加入73mL双重蒸馏水轻摇混匀，用滤纸过滤于另一三角烧瓶中，盖上胶塞，置62℃~65℃水浴锅中30min，冷却后加入甘油7mL、卵黄20mL、青霉素、链霉素各10万IU，用磁力搅拌器搅拌30min，盖紧胶塞，放入3℃~5℃冰箱中待用，放置时间不得超过24h。4.7细管4.7.1质量应符合NY1181的规定。4.7.2标记应符合附录A的规定。4.8包装袋包装冻精前，包装袋上依次标记品种、鹿号、生产数量、冻精活力、生产日期和鹿场名称等信息。5采精5.1采精频率繁殖期内，青年公鹿（2.5岁～3岁）每2w采精1次；成年公鹿（4岁～10岁）每7d～10d采精1次。5.2采精方法5.2.1保定用陆眠宁2mL将鹿麻倒，头部稍垫起，拉出舌头，四肢用木棒和麻绳固定。DB21/T3648—202235.2.2处置戴好一次性长臂塑料手套，涂上液体石蜡伸入直肠掏出宿粪，再用生理盐水清洗直肠。用医用不锈钢手术剪剪去尿道口周围长毛，用清水冲洗尿道口周围污垢，用灭菌纱布擦干后再用生理盐水清洁尿道口。用手导出阴茎并用灭菌纱布将龟头下端阴茎缠绕住，使龟头露出，用生理盐水冲洗，再用灭菌纱布擦干阴茎及龟头。5.2.3采精方法将涂抹液体石蜡的电极棒由肛门慢慢插入直肠内，深度15cm～20cm，使电极紧贴直肠底壁精囊腺。先将电刺激采精器电压调至“0”位，打开电源开关，刺激电压从2V开始由低向高，但不应超过6V。每次增加1个档位，在每档通、断交替刺激2次～3次，每次通电3s、间断2s，直至射精。从开始射精后，每隔通断电1次更换1个集精杯，直至射精结束。电压刺激的同时，采精员手握阴茎配合按摩。采精时，采精员蹲于公鹿腹侧，一手把握阴茎，一手持集精杯略向上倾斜包住龟头接取精液。采精结束后将电刺激采精器旋钮归“0”，然后拔出电极棒，公鹿注射鹿醒宁4mL～6mL使其苏醒。6精液品质评定6.1质量要求新鲜精液应符合下列条件：a)色泽乳白色或灰白色；b)精子活力≥65%；c)精子密度≥6×108个/mL；d)精子畸形率≤15%。6.2评定方法6.2.1外观检查主要观察精液的色泽、气味及是否有脓性分泌物、血液等异物。正常情况下，精液为乳白色或灰白色，略有腥味。6.2.2采精量采用目测法，用肉眼直接观看量筒上刻度读取数量值（精确到0.1mL），单位为mL。6.2.3精子活力取精液5µL～10µL于载玻片上，加盖盖玻片后在37℃恒温装置的显微镜上进行评定，观察视野中前向运动的精子所占比例，确定活力，用百分率或相应数值表示。评定时每个样片至少观察3个视野，取其平均值，精子活力应大于等于65%。6.2.4精子畸形率取精液5µL～10µL于载玻片上，加盖盖玻片后在37℃恒温装置的显微镜上进行评定，观察视野中畸形精子所占比例，确定畸形率，用百分率或相应数值表示。评定时每个样片至少观察3个视野，取其平均值，精子畸形率应小于等于15%。DB21/T3648—202246.2.5精子密度使用精子密度测定仪器进行测定，精子密度应大于等于6亿/mL。7精液稀释7.1稀释液量的确定根据精液的活力、密度、采精量等确定应加稀释液量。稀释液量按公式（1）进行计算。V——应加稀释液量，单位为毫升（mL）；L——采精量，单位为毫升（mL）；P——精液密度，单位为亿个/mL；M——解冻后预估的精子活力；1000——每支细管冻精所含有效精子数，单位为万个；0.23——每支细管精液容量，单位为毫升（mL）。7.2稀释方法在22℃~25℃环境条件下，用经32℃水浴加温的稀释液加入精液中至最终稀释量。稀释时，把稀释液沿着精液容器的壁缓缓加入精液中，轻摇混匀。7.3活力检查精液稀释后，按照6.2.3规定的方法评定活力。8精液分装8.1精液分装8.1.1人工分装精液稀释10min后，在22℃~25℃环境条件下，用移液枪或胶头滴管把精液吸入细管，要求细管上部精液充溢，底部有8mm～10mm空隙，并用封口粉把细管底蘸封。8.1.2机械分装精液稀释10min后，在22℃~25℃环境条件下，用自动细管灌装机进行精液的分装、标识和封8.2精液平衡分装后的细管精液放在塑料盒中或用毛巾包裹，放入3℃~5℃冷藏柜中平衡3h～4h。DB21/T3648—202259精液冷冻9.1上架在4℃~6℃低温条件下，把细管精液码放在托架上。码放时把棉塞端靠近操作者，封口端远离操作者，放进冷冻箱时也应如此摆放。如同一个托架上有不同鹿的细管精液，应分开码放。9.2冷冻9.2.1简易冷冻箱冷冻箱要有良好的隔热性能，深度应在50cm以上。使用前加入液氮预冷，液氮面的高低应根据冷冻细管精液的数量多少确定。托架下沿与液氮面之间的距离应保持在2.5cm～3cm，调整好液氮面后，把已放置细管精液的托架迅速放入箱内，盖严盖子，8min～10min完成冷冻过程。9.2.2自动冷冻仪自动冷冻仪是由电脑控制的全自动冷冻设备，根据需要已设定多条降温、冷冻温度曲线，使用时可选择设置好的最佳冷冻温度曲线，也可以按照自己设定的程序冷冻。自动冷冻仪的使用应按照冷冻仪的操作程序冷冻。10冻精活力检查用细管夹随机取1支冻精迅速浸入37℃水中，待冻精溶解10s～15s后取出，擦干细管表面水珠，剪掉细管两端，取一滴精液于载玻片上，按照6.1.3规定的方法评定活力，活力大于0.3为合格。11冻精包装与储存11.1.1冻精包装应在-140℃以下的环境中进行，包装后的细管冻精其棉塞端应朝向拇指管底部，不应倒置。拇指管底部应朝向包装袋底部装入包装中，系好封口绳。11.1.2每个拇指管包装冻精数量不应超过25支，每个包装袋包装拇指管数量不应超过4个。11.2.1冻精应浸没于液氮罐的液氮中，并定期添加液氮，液氮罐应符合GB/T5458的要求。11.2.2冻精由一个液氮罐转移到另一个液氮罐时，在液氮罐外停留时间不应超过3s。鹿冷冻精液生产记录见附录B，鹿冷冻精液生产记录应保存2年。DB21/T3648—20221鹿细管冷冻精液标识方法鹿细管冷冻精液标记由四部分组成，排列顺序如下：a)第一部分：公鹿所在鹿场名称前四个汉字的汉语拼音的第一个大写字母组合；b)第二