2026届高三二轮复习生物：基因工程的基本工具和基本操作程序

知识构建第3课时1.DNA体外扩增的原理PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，实现体外扩增。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。四、DNA片段的扩增及电泳鉴定P84-85循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，10min缓冲液、脱氧核苷酸、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。移液离心扩增3.PCR实验操作步骤注意：预变性和最后一次循环时加热变性时间更长程序变性复性延伸预变性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，10minPCR仪的循环程序使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。思考：预变性的目的是什么？思考：为什么最后1次变性时间延长？TaqDNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。4.PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。

(2024·山东青岛模拟)DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(

)A．琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物B．双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大C．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测D．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来B(1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。目的基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段，紧挨转录起始位点）人们所需要的基因位置：功能：基因的下游3’端（一段特殊的DNA片断）终止mRNA的转录如抗性基因，筛选重组DNA分子第二步基因表达载体的构建(3)基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图第二步基因表达载体的构建单酶切缺点?A.目的基因自身环化B.质粒重新环化C.质粒与目的基因反向连接通过双酶切法解决这些问题将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创,培育出了抗虫棉第三步将目的基因导入受体细胞(1)花粉管通道法②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；第三步将目的基因导入受体细胞(植物)(2)农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞目的基因插入植物染色体DNA中植物细胞表现出新性状的植株植物组织培养转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。b.农杆菌的优势与缺点:农杆菌细胞内的Ti质粒上的

可携带目的基因整合到受体细胞的

上;但存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。c.农杆菌转化法的两次拼接和两次导入:第一次拼接:

;第二次拼接(非人工操作):指

;第一次导入:

;第二次导入(非人工操作):指

。T-DNA染色体DNA将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞d.转化方法:可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞,并再生成植株;受体细胞是

；也可以将花序直接浸没在含农杆菌的溶液中一段时间,然后培养植株并获得种子,再进行筛选、鉴定等;受体细胞是

。

体细胞受精卵操作程序：取受精卵显微注射胚胎移植为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。第三步将目的基因导入受体细胞(动物)——显微注射法方法——使用Ca2+处理：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。P82过程Ca2+处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子大肠杆菌细胞注意：原核生物没有内质网、高尔基体，它作为受体细胞产生出的真核生物蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。第3步将目的基因导入受体细胞(微生物)微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作类型步骤检测内容方法分子检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR等技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR等技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度

抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较

功能活性。第四步目的基因的检测与鉴定加入相应的抗体[提醒]启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

据图分析抗虫棉的培育过程。(1)该过程中的目的基因是

，载体是

。(2)基因工程中，往往使用两种限制酶切割目的基因，这样做的原因是什么？Bt基因Ti质粒为了避免目的基因和载体的自身环化和反向连接。(3)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？目的基因应插入启动子与终止子之间。(4)该实例中，导入目的基因的方法是

。为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入T－DNA，农杆菌转化法(5)将目的基因导入受体细胞时，能否仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上？为什么？一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。(6)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪些？

抗原—抗体杂交、用棉叶饲喂棉铃虫。1.

[2023·浙江6月选考]某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(

)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子B2、[2023·山东卷]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是

。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有

(答出2个结构即可)。

限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物

。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与