DB36-T 1903-2023 实验动物 小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法

CCSB44DB36江西省市场监督管理局发布 2规范性引用文件 4缩略语 附录A（规范性附录）溶液配制方法 附录B（规范性附录）荧光定量PCR的引物与探针 附录C（规范性附录）荧光定量PCR检测方法 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：贾菠、周银平、张陆兵、谢金明、万筱荣、熊莉娟、肖芳平、罗勇兵、刘欢、周剑、李银才。实验动物小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测方法本文件规定了实验动物小鼠肝炎病毒荧光定量PCR检测的术语和定义、缩略语、设备和材料、试剂、检测流程和结果判定等内容。本文件适用于小鼠肝炎病毒的检测，饲养环境中小鼠肝炎病毒的检测参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14922实验动物微生物、寄生虫学等级及监测GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T39760实验动物安乐死指南3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。小鼠肝炎病毒mousehepatitisvirus直径为80nm~160nm的球形RNA病毒，属于冠状病毒科的冠状病毒属，是影响小鼠健康最为重要的病毒之一，小鼠肝炎为小鼠肝炎病毒感染所致。荧光定量聚合酶链式反应real-timequantitativepolymerasechainreaction;real-timePCR在常规PCR的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。Ct值cyclethresholdvalue2荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementaryDNA)PBS：磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)DEPC：焦炭酸二乙酯(diethylpyroca5设备和材料设备包括但不限于：高压灭菌锅、荧光定量PCR仪、PCR仪、高速冷冻离心机、普通离心机、恒温孵育器、漩涡振荡器、组织匀浆器、生物安全柜、超净工作台、冰箱（4℃、-80℃)、微量移液器（0.25.2材料无RNA酶离心管（0.2mL、1.5mL、5mL、15mL）、灭菌PCR扩增反应管、无RNA酶吸头、无菌剪刀、无菌镊子、灭菌棉拭子等。6.1本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合GB/T6682的要求。6.2灭菌PBS溶液（配制方法见附录A中的A.1）。6.3DEPC水（配制方法见附录A中的A.2）。6.4Trizol裂解液：或其他等效裂解液。6.5三氯甲烷。6.6异丙醇：-20℃预冷。6.775%乙醇（配制方法见附录A中的A.3）。6.8RNA逆转录试剂盒：商品化逆转录试剂盒。6.9荧光定量PCR试剂盒：商品化荧光定量PCR试剂盒。6.10引物和探针（见附录B中的B.1）。6.11阳性对照：小鼠肝炎病毒阳性cDNA片段。6.12阴性对照：小鼠肝炎病毒阴性cDNA片段。7检测流程7.1生物安全要求实验操作及处理按照GB19489的规定执行。检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中7.2样本采集7.2.1脏器组织按照GB/T39760的规定，动物安乐处死，剖检，无菌采集动物的肝脏，剪取待检样本2.0g于15mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.2.2粪便/盲肠内容物无菌采集动物盲肠内容物或粪便，取待检样本2.0g于15mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.2.3实验动物垫料取实验动物垫料1.0g于15mL无RNA酶离心管中，密封、编号，待检。7.3样本处理7.3.1脏器组织在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入4mL灭菌PBS溶液，使用电动匀浆器充分匀浆2min，反复冻融3次，然后将组织悬液在4℃,3000e离心10min，取上清液转入另一5mL无RNA酶离心管中，编号备用。7.3.2粪便/盲肠内容物在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入4mL灭菌PBS溶液，使用电动匀浆器充分匀浆2min，12000e离心10min，取上清液转入另一5mL无RNA酶离心管中，编号备用。7.3.3实验动物垫料在生物安全柜内向装有样品的离心管中加入4mL灭菌PBS溶液（可适量增加灭菌PBS溶液的量，饲料和垫料需全部浸泡于液体中），静置30min，取上清液转入另一5mL无RNA酶离心管中，编号7.4样本存放采集或处理的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置于-80℃冰箱保存，避免反复冻融。7.5.1样本RNA在实验室中提取步骤如下：a)为防止RNA降解，所用试验用具及溶液应无RNA酶，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶b)取200μL已处理好的样品加入到无RNA酶的1.5mL离心管中，加入600μLTrizol裂解液，用旋涡振荡器剧烈振荡15s后，室温放置5min；d)吸取上清液转移至一个新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，上下颠倒混4e)4℃,12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除；f)加入1000μL预冷的75％乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀；g)4℃,12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀10min；h)加入20μLDEPC水，溶解沉淀后，室温孵育10min。提取的RNA应在2h内使用或-80℃冰箱保存备用。7.5.2样本RNA也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6样本RNA逆转录为cDNA反应体系的配制应在冰上操作。5×逆转录反应缓冲液4μL、MgCl2(25mM)4μL、OligoPrimer(500反转录酶1μL、RNA1μg~2μg，用无RNA酶水补足反应体积至20μL，置于PCR仪中进行逆转录反应，以40℃15min、70℃15min的程序进行一个循环。制备好的cDNA模板若暂时不进行PCR反应，应保存于-80℃冰箱。也可选用其它等效逆转录试剂盒进行逆转录反应。7.7荧光定量PCR检测荧光定量PCR检测应符合附录C。8结果判定8.1质控标准阳性对照Ct值≤35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无Ct值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2检测结果判定符合8.1条件下，被检样本Ct值≤35，且出现对数扩增曲线，判定为阳性；被检样本无Ct值且无对数扩增曲线，判定为阴性。被检样本35＜Ct值≤40时，重复一次，如果Ct值仍然≤40，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。溶液配制方法A.1灭菌PBS溶液准确称取氯化钠（NaCl）8.00g，氯化钾（KCl）0.20g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min，冷却备用。A.2DEPC水（无RNA酶超纯水）取超纯水100mL，加入焦炭酸二乙酯（DEPC）50mL，室温过夜后，在103.4kPa（121℃)条件下A.375%乙醇取无水乙醇75mL，加入25mL无RNA酶超纯水，现配现用。6正向引物5,-GGAACTTCTCGTTGGGCATTATACT-3,反向引物5,-ACCACAAGATTATCATTTTCACAACATA-3,探针FAM-ACATGCTACGGCTCGTGTAACCGAACTGT-BHQ-1荧光定量PCR检测方法C.1荧光定量PCR反应体系表C.1每个荧光定量PCR反应体系---C.2荧光定量PCR反应条件表C.2荧光定量PCR反应条件-1-