2026届新高考生物三轮热点复习：基因工程

2026届新高考生物三轮热点复习基因工程

例1（2023山东节选）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。（1）与图甲中启动子结合的酶是

，除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有

。（答出2个结构即可）标记基因、复制原点、限制酶切割位点

等。RNA聚合酶任务一基因表达载体的结构和功能

例2

枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，在构建基因表达载体时，W基因上游启动子应选_______。

A.枯草芽孢杆菌启动子

B.乳酸杆菌启动子

C.农杆菌启动子B注意：

启动子具有物种特异性

例3

（2024河北节选）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为

，

启动子。注意：

启动子具有组织特异性和物种特异性在胚乳中特异表达的

eg

用乳腺生物反应器生产药用蛋白（选必3P90）

将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组。归纳一

基因表达载体的结构和功能(选必3P80)质粒标记基因复制原点启动子终止子限制酶切割位点本质：一段特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA用于筛选含有目的基因的受体细胞DNA复制的起始位点供目的基因插入载体中本质：一段特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录1．根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶任务二限制酶的选择原则2．根据质粒的特点选择限制酶（如图）3．农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取。（区分Ti质粒、T－DNA，农杆菌转化法的两次拼接，两次导入）4．已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，根据图示分析回答下列问题：（1）请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。（2）切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。（3）用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是_____________________________________________________________________________________________（4）DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？（5）实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件有什么？避免载体和目的基因的自我环化及载体和目的基因的反向拼接用酶I切割载体，用酶II切割目的基因具有侵染性、对细胞无害，对靶细胞具有较高的转化效率。例1（同尾酶）限制性内切核酸酶SalⅠ和XhoⅠ识别序列与切割位点如图1。用SalⅠ切割目的基因两侧，用XhoⅠ切割载体质粒，再用连接酶处理可形成重组质粒。实验者用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒，再将产物电泳分离，其结果如图2。下列叙述正确的是()

A．SalⅠ切割产生的黏性末端与XhoⅠ切割产生的黏性末端不同B．根据重组质粒的酶切结果可知有2个目的基因插入重组质粒中C．重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhoⅠ的识别序列D．2种酶切后产生的2kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞C任务二限制酶的选择原则笔记：同尾酶的酶切切位可以连接，但是连接后，不能再被这两种酶识别

例2（2023山西）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒切割连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示：下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（

）A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接

CC任务二限制酶的选择原则例3（2024重庆节选）大豆是重要的粮油作物......基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小）......并开展相关研究。(2)基因工程方法,将DN克隆“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。据图所示信息,判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是

;此外不宜同时选用酶

SpeⅠ和

XbaⅠ原因是

。

二者酶切后形成的黏性末端相同，目标序列与载体易发生自身环化和反向连接

EcoRⅠ(2025·黑吉辽蒙卷，25节选)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。（1）可从______________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。基因序列数据库XhoIXbaIDNA连接酶2、相同黏性末端原则

目的基因和载体用相同限制酶切割，保证末端相同，能互补配对。3、双酶切优先原则

选择两种不同限制酶，分别切割目的基因和载体。归纳二

限制酶的选择原则

4、同尾酶灵活应用

若目的基因与载体无相同酶切位点，可用同尾酶切割；例如

SpeⅠ和XbaⅠ

。

1、保留完整功能元件原则

保证载体上的启动子、终止子等结构完整，且不会破坏目的基因内部结构。

例1（2022福建节选）美西螈具有很强的再生能力......科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体......回答下列问题：(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图1所示。用

XhoI和

SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是

。任务三

基因表达载体构建中正确连接的检测方法1、利用提供的载体和含CD14基因的片段，进行正向连接和反向连接，进

正向和反向连接后的序列分别是什么？2、用相同的限制酶，能否再切割正向连接和反向连接后的序列？3、结合以上两个问题，写出例6的答案。4、若用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，实验思路及预期别

结果和结论分别是什么？任务三

基因表达载体构建中正确连接的检测方法正向连接反向连接CD14XhoI－C－GAGCTTCGAG－C－－G－CAGCTTCGAC－G－载体XhoI载体SalICD14SalICD14SalI－C－GAGCTTCGAC－

G－－G－CAGCTTCGAG－

C－载体XhoI载体SalICD14XhoI2、用相同的限制酶，能否再切割正向和反向连接后的序列？正向连接后的序列可被切割，反向连接的序列不可被切割。1、分析正向连接和反向连接的序列分别是什么？例1（2022福建节选）美西螈具有很强的再生能力......科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体......回答下列问题：

正向连接的重组DNA仍有这两种酶的识别序列，可被切割；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，不可再被这两种酶识别切割。(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图1所示。用

XhoI和

SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是

用这两种酶切割重组DNA，进行PCR扩增后再做琼脂糖凝胶电泳鉴定。若电泳结果出现两个目标条带，说明重组DNA可被切割，则为正向连接；若结果只出现一个条带，说明重组DNA不可被切割，则为反向连接。(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图1所示。用

XhoI和

SalI分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA，可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是

方向进行鉴定，写出实验思路和预期结果和结论。若用这两种限制酶对CD14的连接例1（2022福建节选）美西螈具有很强的再生能力......科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体......回答下列问题：

例2（2023山东节选）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

。启V5终反向连接启V5终正向连接（1）选F2和R1（或F1和R2），J基因正向和反向连接结果不同，前者可以扩增

扩增J基因，后者无法扩增J基因，故可以区分。启V5终正向连接（2）选F1和R1，J基因正向和反向连接PCR的结果相同，故无法区分。反向连接启V5终

例2（2023山东节选）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

。F2和R1或F1与R2三、归纳

基因表达载体构建中目的基因正确连接的检测方法2、PCR电泳法

通过设计特异性引物，扩增重组质粒中的目的基因或连接区域，根据电泳条带判断,,判断基因是否插入及方向是否正确。

1、酶切电泳法

用原限制酶切割重组质粒，结合电泳条带大小与预期比对，判断连接是否成功。

变式训练变式1：为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置。（1）PCR鉴定时应选择的一对引物是

？

（2）某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是

？答案：乙丙

（甲、乙）目的基因反向连接变式训练变式2：GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用，研究人员构建了GDNF基因的表达载体（图1），并导入到大鼠神经干细胞中，用于细胞基因治疗的研究，请回答：（1）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________限制酶进行酶切。经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（图1）。为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示，图中第______泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。

XhoⅠ

②一、PCR加限制酶切序列尾巴（错题重做）人血清白蛋白（HSA）是由肝脏细胞合成的，具有重要的医用价值，原本只能从血清中提取，科研人员利用基因工程技术改造水稻，并从转基因水稻中获取人的血清白蛋白（HSA）。部分流程及相关限制酶的识别序列和切割位点如图，HSA基因的b链为转录的模板链。回答下列问题。任务四

PCR加限制酶切序列尾巴/目的基因的检测与鉴定一、PCR加限制酶切序列尾巴任务四

PCR加限制酶切序列尾巴/目的基因的检测与鉴定（3）为确保HSA基因与Ti质粒正向连接，同时便于对导入重组Ti质粒的农杆菌的筛选，应对质粒用

酶切。据图写出PCR扩增HSA基因时引物1的碱基序列为5'-

-3'（写出前10个碱基）。筛选含重组质粒的农杆菌时，应先将处理后的农杆菌接种至含

的培养基中，再利用无菌绒布影印接种转移至含

的培养基中。可以HindⅢ和BamHI酶切吗？AAGCTTATGC二、如何筛选出含有目的基因的受体细胞1.利用双标记基因与影印接种技术筛选（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。二、如何筛选出含有目的基因的受体细胞2.利用蓝白斑显色法筛选：浙科版教材中出现了LacZ标记基因。很多大肠杆菌的质粒上含有LacZ标记基因，其表达的产物是β－半乳糖苷酶。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18一般同时携带ampr（氨苄青霉素抗性基因）和LacZ两个标记基因（如图）。如何筛选呢？例1（2023湖北卷）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落D例2（2025安徽卷）质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（

）A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌C四、归纳

PCR加限制酶序列尾巴/目的基因的检测与鉴定2、目的基因的检测与鉴定①筛选含有目的基因的受体细胞：普通筛选、双标记基因影印接种、蓝白斑显色法②PCR与核酸分子杂交技术鉴定基因是否导入和转录，抗原抗体杂交法鉴定目的基因是否表达出相应蛋白质，个体生物学检测法。

1、PCR加限制酶序列尾巴

根据目的基因转录模板链确定目的基因的转录方向→确定目的基因插入载体的正确方向→确定目的基因两侧需添加的限制酶切序列（注意同尾酶的应用）高考热点

CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。

其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。CRISPR/Cas9基因编辑2．Cre/LoxP重组酶系统这个系统主要由两部分组成：Cre重组酶和LoxP位点。（1）Cre重组酶：最早是从P1噬菌体中发现的，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。（2）LoxP序列：来源于P1噬菌体的DNA序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。

（3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。

课堂小结1、

基因表达载体的结构和功能

启动子、终止子、限制酶切割位点、标记基因和复制原点；启动子的物种

特异,特异性和组织特异性。2、

限制酶的选择原则