基因工程的基本操作程序+2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

基因工程的基本操作程序【本节聚焦】1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？复习提问1．基因工程又叫什么？其原理是什么？用于育种时有何优点？2．不同生物的DNA能拼接的原因是什么？转基因能在受体细胞中表达是因为什么？3．“分子手术刀”是指什么？在基因工程中的作用是什么？4.限制酶识别的序列长度是多少？作用部位是哪里？切割的结果是什么？5.限制酶主要从哪儿获得？限制酶对于该生物的主要作用是什么？为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？6.在选择限制酶的时候有什么依据？为何通常用两种限制酶同时切割目的基因和运载体？7．“分子缝合针”是指什么？作用是什么？作用部位是哪里？可以分为哪两类？作用有何特点？8.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？9．“分子运输车”是指什么？常用的有哪些？什么是质粒？质粒需具备什么条件才能充当“分子运输车”？天然的质粒能直接做运载体吗？10.标记基因的作用是什么？常见的标记基因有哪些？作为标记基因的一定是抗性基因吗？11．DNA粗提取的基本思路是什么？什么样的实验材料适合提取DNA？常用的材料有哪些？哺乳动物的成熟红细胞适合吗？让DNA从滤液中析出为何要用冷却的95%酒精？DNA如何鉴定？苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）从社会中来植物组培知识拓展：基因的结构基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？基因编码区知识拓展：基因的结构与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录本质：位置：作用：启动子终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游原核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构编码区非编码区非编码区启动子终止子真核细胞的基因结构内含子外显子启动子终止子外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉真核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构知识拓展：基因的结构不能编码蛋白质的序列=

非编码区原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列真核生物的基因：=非编码区+内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成连续不连续编码区非编码真核细胞的基因结构原核细胞的基因结构◆第二步：基因表达载体的构建◆第一步：目的基因的筛选与获取◆第三步：将目的基因导入受体细胞◆第四步：目的基因的检测与鉴定◆DNA片段的扩增及电泳鉴定（一）目的基因1、概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。2、类型：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。一、目的基因的筛选与获取如：Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因Bt抗虫蛋白使棉花抗虫

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。相关信息（一）目的基因如：Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因Bt抗虫蛋白使棉花抗虫当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。相关信息一、目的基因的筛选与获取（二）筛选合适的目的基因1、从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。一、目的基因的筛选与获取（二）筛选合适的目的基因测序技术序列数据库序列比对工具DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对2、其它方法：一、目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因从基因文库中获取人工合成

前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成（常用）一、目的基因的筛选与获取（三）获取目的基因的方法（三）获取目的基因的方法人工合成从基因文库中获取利用PCR获取和扩增目的基因一、目的基因的筛选与获取DNA合成仪获取一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？

PCR是

的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在

提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对

的技术。1.PCR：中文全称原理操作环境目的PCR扩增仪聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列进行大量复制PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。离心管一、目的基因的筛选与获取（三）获取目的基因的方法回顾：体内DNA复制子链的延伸方向：5'端→3'端（DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链）模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶条件ATP特点:边解旋边复制、半保留复制

、多起点双向复制3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母链13’5’DNA母链2拓展：引物DNA聚合酶的特点：无法从头合成DNA链引物结合在模板链的3’端,需要2种引物的概念：P77相关信息引物的本质：细胞内DNA复制----单链RNA（后续被酶切除）

细胞外（PCR）——单链DNA（不切除）DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸子链参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸体内DNA复制所需的基本条件解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物2、PCR条件体外用高温代替一段已知目的基因的核苷酸序列dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）也需要在缓冲液中加Mg2＋用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链需要2种当温度超过______以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

(1)变性：氢键单链DNA变性90℃待扩增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。变性

复性延伸3、PCR反应的过程3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’思考：为什么需要引物？

引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。（延伸到模板链末端）变性

复性延伸当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

(2)复性：碱基互补配对50℃两便于引物与互补DNA链结合3、PCR反应的过程当温度上升到______左右时，溶液中的4种_____________在耐高温的________________________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：为什么温度要上升至72℃？72℃是Taq酶的最适温度变性

复性延伸碱基互补配对思考1：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？Taq酶结合在引物的3’端3、PCR反应的过程DNA解链为单链高温(95℃)变性低温(50℃)复性中温(72℃)延伸引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。PCR的过程：反应结果：以指数形式扩增即2n（n为扩增循环的次数）3、PCR反应的过程作图3、PCR反应的过程（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？【问题探究】5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’（3）设计的引物应含有什么样的序列？引物含有能与目的基因两端（3’端）配对的核苷酸序列。

3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2【问题探究】引物的5′端还要添加上限制酶的识别序列。

（2）两种引物都结合在DNA模板链的

端；

脱氧核苷酸连接在引物的

端进行延伸。3’3’（4）如果循环n次，DNA分子数为_______,共需消耗

个引物，产物中含有引物A的DNA有_____个，含有两种引物(A和B)的DNA有

个，目的基因有________个2n－12n+1－2【问题探究】2n－22n－2n2n（5）用PCR可以扩增mRNA吗？【问题探究】不能。mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA（逆转录来的单链DNA）再进行PCR。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交双链；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。DNA聚合酶不能识别RNA序列体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分

反应还需要其它条件：解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA）如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备PCR的进行需要的条件：dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打开DNA双链，破坏氢键提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量复习提问2、PCR扩增过程中

需要源源不断的加入。1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的

。经过______次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？模板引物、原料复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含引物1的DNA分子数同时含引物1和2的DNA分子数消耗引物数量2n2n2n-12n-22n+1-22482481370262614复习提问3第三次扩增中长链-短链DNA____个4长链-中长链DNA____个含有引物A的DNA____个含有引物B的DNA____个277短链-短链DNA______个2蓝-引物A红-引物B第三次复制后开始出现含脱氧核苷酸链等长的DNA分子即目的基因该循环中，DNA有几种长度？有几种类型（碱基序列）？问题1：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？①引物与DNA模板结合②解开的两条模板链重新结合③引物与引物结合思考

·

讨论加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。在设计引物时，避免引物之间的碱基序列互补问题2：怎样提高复性时引物与模板配对结合率，

而不是模板链之间配对结合呢？问题3：如何避免引物与引物结合？问题4：用PCR可以扩增mRNA吗？（p79）不能。mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA（逆转录来的单链DNA）再进行PCR。要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。5’-ATG……ATCGAGACCGGT……TAA-3’3’-TAC……TAGCTCTGGCCA……ATT-5’①②③④3’…ATT-5’5’-ATG…3’问题5：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。1、PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________22、设计引物的要求：2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_______________________________。防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合DNA的两条链是反向平行的（序列不同）（一）目的1、让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；2、使目的基因能够表达和发挥作用。目的基因二、基因表达载体的构建与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：作用：一段有特殊序列结构的DNA片段；一段有特殊序列结构的DNA片段；终止转录本质：作用：基因的结构启动子终止子非编码区非编码区编码区能编码特定的蛋白质编码区上游编码区下游（二）基因表达载体的构成①启动子②终止子：基因的下游，能终止转录基因的上游，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA目的基因氨苄青霉素抗性基因复制原点二、基因表达载体的构建目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入

，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。启动子和终止子之间的部位（二）基因表达载体的构成诱导型启动子诱导物作用激活或抑制目的基因表达诱导型启动子：二、基因表达载体的构建（三）基因表达载体的构建过程两个黏性末端（/平末端）质粒（载体）DNA分子（含目的基因）获得目的基因，带有两个黏性末端（/平末端）DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种限制酶（或产生相同末端的限制酶）二、基因表达载体的构建载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1用同一种限制酶切割目的基因和质粒，用DNA连接酶连接后得到哪些分子？1.载体、目的基因的自身环化2.目的基因和载体反向连接弊端分析1：限制酶的选择（1）不破坏目的基因；（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点；（3）确保表达载体和目的基因出现相同黏性末端；（4）避免目的基因和质粒自身环化和反向连接可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶分别切割目的基因和质粒。方法：利用2种标记基因筛选分析2：如何筛选出含目的基因的质粒（空质粒/含目的基因的质粒）①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌、含空质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落；②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上，不生长的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。方法：利用2种标记基因筛选分析2：如何筛选出含目的基因的质粒（空质粒/含目的基因的质粒）受体细胞类型植物细胞动物细胞微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法（我国科学家独创）（常用）显微注射法Ca2+处理法1.导入方法三、将目的基因导入受体细胞1.为什么常选用动物受精卵作为受体细胞呢？2.Ca2+处理的原核细胞目的是？①.体积大，易操作。②.全能性高，易培养成完整个体。可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态）。植物细胞花粉管通道法方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液（我国科学家独创）三、将目的基因导入受体细胞（我国科学家独创）植物细胞花粉管通道法方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。三、将目的基因导入受体细胞植物细胞农杆菌转化法转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。农杆菌农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。Ti质粒T—DNA农杆菌细胞内含有______，当它侵染植物细胞后，能将_______上的_______（______________）转移到被侵染的细胞，并且将其________________________________Ti质粒Ti质粒T-DNA可转移的DNA整合到该细胞的染色体DNA上三、将目的基因导入受体细胞表现出新性状的植株植物组织培养第一次导入第二次导入第一次拼接第二次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA导入受体细胞。将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。Ti质粒T—DNA目的基因构建基因表达载体重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞农杆菌转化法：（如：叶片、花序等）三、将目的基因导入受体细胞方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。农杆菌转化的具体方法：体细胞受精卵受体细胞为？受体细胞为？三、将目的基因导入受体细胞思考：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。你认为可以从哪些方面/水平进行检测？即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。四、目的基因的检测与鉴定Bt基因mRNABt蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原-抗体杂交技术分子水平的检测抗虫接种实验个体生物学水平的鉴定以检测

Bt

基因是否导入棉花体内并表达为例：四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测提取DNA转基因棉花PCR是否扩增出目的基因利用

Bt基因的核苷酸序列设计引物（1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——PCR技术＋电泳四、目的基因的检测与鉴定提取DNA，进行PCR反应——检测染色体DNA上是否插入了目的基因

PCR等技术只含目的基因片段琼脂糖凝胶电泳1.分子水平的检测提取DNA转基因棉花PCR是否扩增出目的基因利用

Bt基因的核苷酸序列设计引物M：marker1-6：转基因棉花7：

非转基因棉花8：

阴性对照电泳（1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——PCR技术＋电泳四、目的基因的检测与鉴定(2)检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术＋电泳琼脂糖凝胶电泳1.分子水平的检测苏云金杆菌Bt蛋白注射到小鼠体内抗体标记抗体抗原杂交脱分化（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质———抗原—抗体杂交1.分子水平的检测2.个体生物学水平鉴定方法：抗虫或抗病接种实验采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况——检测目的基因是否表现出相应的性状四、目的基因的检测与鉴定拓展：分子水平的检测基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。变性变性杂交DNA分子（可检测）探针受体细胞的DNADNA分子杂交技术：碱基互补配对原则原理？检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因/是否转录出mRNA——DNA分子杂交技术基本思路：步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。四、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增人工合成2.构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、

感受态细胞转化法(微生物);4.目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。小结：五、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合；PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。（1）PCR的原理①电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。五、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验原理（2）电泳的原理②鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。1.实验原理（2）电泳的原理五、DNA片段的扩增及电泳