中国海洋大学生物化学实验报告

PAGEPAGE4实验一蛋白质含量测定本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液，用—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升2.器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1.标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管号12345678910标准蛋白质ml（1.0mg/ml）00.010.020.040.060.080.10未知蛋白质ml（约1.0mg/ml）0.020.040.06蒸馏水ml0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考马斯亮蓝G－250试剂ml5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白质量（g）光吸收值（A595）（3）用标准蛋白质量（g）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2.微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100g/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。实验二SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl2.实验试剂⑴2mol/LTris-HCl(pH8.8):取24.2gTris,加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。⑵1mol/LTris-HCl(pH8.8):取12.1gTris,加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。⑶10%(w/v)SDS:取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。⑷50%(v/v)甘油:取50ml100%甘油，加入50ml蒸馏水。⑸1%(w/v)溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。⑹A液--丙烯酰胺储备液（配制含30%(w/v)丙烯酰胺和0.8%(w/v)甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃⑺B液--4×分离胶缓冲液：取75ml2mol/LTris-HCl(pH8.8)，加入4ml10%SDS,加21ml蒸馏水，混匀，可在4℃⑻C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml1mol/LTris-HCl(pH6.8)，加入4ml10%SDS,加46ml蒸馏水，混匀，可在4℃⑼10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃⑽电泳缓冲液：取3gTris，14.4g甘氨酸，1gSDS，加蒸馏水至1L,pH约为8.3,也可配制成10×的储备液，在室温下长期保存。⑾5×样品缓冲液：取0.6ml1mol/LTris-HCl(pH6.8)，加入2ml10%SDS,5ml50%的甘油，0.5ml2-巯基乙醇，1ml1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20⑿考马斯亮蓝染液：1.0g考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。⒀考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。（14）标准蛋白：牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）溶菌酶：Mw=14,300（15）未知蛋白质样品：由实验室准备【实验操作】1.灌制分离胶⑴组装凝胶模具:可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。⑵将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必须戴手套。加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合，操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。⑶当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm～5mm的水层，这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面。2.灌制浓缩胶⑴吸尽覆盖在分离胶上的水后将A液、C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合。加入过硫酸铵和TEMED，并轻轻搅拌使其混匀。⑵将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生。⑶凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。将凝胶放入电泳槽内，如果使用Bio-Rad的微型凝胶系统，可预先接好电极。将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。3.制备样品和上样⑴将蛋白质样品与5x样品缓冲液(20μl+5μl)在一个Eppendorf管中混合。100℃加热2min～10min。离心1s⑵用微量注射器将标准蛋白混合样品和未知蛋白样品分别加入2个样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部，并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。4.电泳⑴将电极插头与适当的电极相接。电流流向阳极。将电压调至200V（保持恒压；对于两块0.75mm的胶来说，电流开始时为100mA，在电泳结束时应为60mA；对于两块1.5mm的胶来说，开始时应为110mA，结束时应为80mA。）。⑵对于两块0.75mm的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需30～40分钟(1.5mm的凝胶则需40min～50min)。关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。5.考马斯亮蓝染色这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1μg的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。⑴戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝(20ml已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。⑵对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟~l0分钟，对于1.5mm的凝胶，则需10分钟～20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。⑶加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。6.干胶⑴用一张l0cm×l2cm的Whatman3MM滤纸覆盖凝胶，用一张玻璃纸或塑料保鲜膜覆盖在凝胶的另一个表面，小心不要将气泡裹进去，这样会导致凝胶的破裂。可用一个试管作为卷轴推赶，可以有效的除去气泡。⑵将滤纸置于干胶器上，开启加热和抽真空开关，并盖上带有密封圈的盖子。待凝胶烘干后小心取出即可。【实验结果】根据凝胶中标准品与待测样品的相对迁移率判断待测样品的大致分子量。【思考题】⒈利用SDS—聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白质的分子量与利用凝胶层析测定蛋白质的分子量有何不同？⒉SDS在该电泳方法中的作用是什么？实验三环境压力对酶活性的影响目的和要求掌握酶活性的表征方法和SOD的测定方法。锻炼学生设计实验的能力，考察典型污染物（环境压力）对植物超氧化物歧化酶活性的影响。根据实验时间安排，本学期进行Cu2+对萝卜幼苗中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。实验设计环境压力对植物超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响设计一组实验，考察环境压力对植物超氧化物歧化酶活性的影响。材料：植物材料为萝卜，在正式实验前2周以沙培方式种植。每个实验小组种植15盆。环境压力：可选择重金属污染（铜、铅、锌）、温度、干旱、高盐等环境压力，任选1种。每种环境压力至少设置3个梯度，若选择重金属污染则需要5个浓度梯度。实验方法1、植物种植：采用沙培法，营养液为完全培养液。每个小组种植15盆，每盆内种植10粒饱满的种子。植物种植应在正式实验前2周完成。2、施加环境压力：每个小组选择一种环境压力。重金属和高盐压力采用直接染毒法。温度压力采用培养箱控温。干旱压力采用人工控水法。环境压力的施加应在SOD测定前一天进行。若选择Cu2+作为环境压力，建议采用0，0.1，1，10，100mg/L的浓度梯度进行试验。每个压力梯度3个重复。3、SOD活性测定。环境压力施加后24h进行酶活性测定，测定方法如下：（1）药品配制提取介质：即0.1M的磷酸缓冲液（pH7.0）[配制方法见后]。反应介质：0.1M（pH7.8）磷酸缓冲液（42.5ml0.2MNaH2PO4溶液与457.5ml0.2MNa2HPO4溶液混合定容至1000ml），内含0.1mmol/L的EDTA、77.12mol/L的硝基四唑蓝，13.27mol/L的蛋氨酸（即甲硫氨酸，或称氨基-γ-甲硫基十酸）。核黄素溶液，浓度为80.2mol/L，用含0.1mmol/LEDTA的0.1mol/L（pH7.8）的磷酸缓冲液配制。（2）酶液制备用3ml提取介质将植物材料转入匀浆器中，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，再用2ml提取介质洗液匀浆器后合并之。于4000rpm下离心20min，上清液为酶液。（3）酶活力测定取1支试管，加入2.9ml反应液，0.1ml核黄素溶液，再加1ml酶液，立即开始计时，于560nm处测定光密度，每分钟记录一次，记录后将比色杯中混合液倒回试管，振荡10秒后再测下一个值。以不加酶液者做对照。（4）酶活力计算酶活力=A：为一定时间t内光密度变化5：酶液为5ml60：计算1小时内的酶活力W：植物材料鲜重(g)t：测定时间1：以1ml酶液测定酶活力附：恒温水浴（槽）使用方法和注意事项：1.使用方法：（1）关闭水浴底部外侧的放水阀门，将水浴内注入蒸馏水至适当的深度。加蒸馏水是为了防止水浴槽体(铝板或铜板)被侵蚀。（2）将电源插头接在插座上，合上电闸。插座的粗孔必须安装地线。（3）将调温旋钮沿顺时针方向旋转至适当温度位置。（4）打开电源开关，接通电源，红灯亮表示电热丝通电，开始加热。（5）在恒温过程中，当温度计的指数上升到距离需要的温度约2℃时，沿逆时针方向旋转调温旋钮至红灯熄灭为止。此后，红灯就不断熄亮，表示恒温控制发生作用，这时再略微调节调温旋钮即可达到需要的恒定温度。（6）调温旋钮刻度盘的数字并不表示恒温水浴内水的温度。随时记录调温旋钮在刻度盘上的位置与恒温水浴内温度计指示的温度的关系，在多次使用的基础上，可以比较迅速地调节，得到需要控制的温度。注意：水温超过所需温度时，不可强力转动旋钮以图降温，否则损坏测温装置。（7）使用完毕，关闭电源开关，拉下电闸，拔下插头。（8）若较长时间不使用，应将调温旋钮退回零位，并打开放水阀门，放尽水浴槽内的全部存水。2.注意事项：（1）水浴槽内的水位绝对不能低于电热管，否则电热管将被烧坏。（2）控制箱部分切勿受潮，以防漏电损坏。（3）使用时应随时注意水浴槽是否有渗漏现象。实验四酵母核糖核酸（RNA）的提取及组份鉴定目的要求了解并掌握稀释碱法提取RNA及地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。试剂和器材

一、试剂0.04MNaOH溶液；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银;酸性乙醇溶液，30ml乙醇加0.3mlHCl;三氯化铁浓盐溶液，将2ml10％三氯化铁（FeCl3·6H2O）溶液加入400ml浓HCl;苔黑酚乙醇溶液，称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100ml;定磷试剂：17％硫酸：将17ml浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83ml水中；2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100ml水中；10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）

二、材料干酵母粉。

三、器材乳钵；容量瓶（10ml），移液管（2.0ml,5.0ml），量筒（10,50ml），沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸，滴管等。

操作方法

一、酵母RNA提取称5g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%NaOH溶液，沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），3000r/min离心15min。取上清液，加入10ml酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣先用乙醇洗两次，每次用10ml。再用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：

二、RNA组份鉴定取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10ml,沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。1．嘌呤碱：取水解液1ml加入过量浓氨水。然后加入1ml0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。2．核糖：取水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。3．磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。思考题：1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?实验五环境压力对植物组织中可溶性糖含量的影响（蒽酮比色法）原理植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。仪器药品721型分光光度计分析天平研钵恒温水浴锅烧杯容量瓶三角烧瓶