CN114207129B 用于在半合成生物体中复制、转录和翻译的试剂和方法 （斯克利普斯研究所）

2022.02.09PCT/US2020/0374372020.06.12WO2020/252262EN2020.12.17WO2015021432A1,2015.02.12DenisA.Malyshev.asemi-syntheticChristelleMoreau.CD38StVivianT.Dien.ProgressTowardaSemi-SyntheticOrganisUnrestrictedExpandedGeneticAlphabet.页.AaronW.Feldman.InVivoStructure–ActivityRelationshipsandOptimizaofanUnnaturalBase本文公开了用于增加包含一种或多种非天然氨基酸的蛋白质或多肽的产生的组合物、方增加编码所述非天然氨基酸的非天然核酸在工2其中波浪线代表核碱基与核糖基、脱氧核糖基或二脱氧2.根据权利要求1所述的核碱基，所述核碱基与互补碱基配对核碱基结合以形成非天4.一种双链寡核苷酸，其包含第一寡核苷酸链，所述酸链在其互补碱基配对位点中包含互补碱基配对核5.根据权利要求4所述的双链寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸链在其互补碱基配对6.根据权利要求5所述的双链寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸链包含互补碱基配对37.根据权利要求5所述的双链寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸链包含互补碱基配对8.一种包含编码转移RNA(tRNA)的基因和/或基因包含根据权利要求1所述的至少一种核碱基以及根据权利要求3所述的至少一种互补识别元件，其中所述识别元件通过氨酰tRNA合成酶促进所述t14.根据权利要求11或12所述的tRNA，其中所述非天然氨基酸是选自以下的赖氨酸衍4或5N1是在Z的核糖基或脱氧核糖基的5'端处附接的一个或多个核苷酸或末端磷酸酯基N2是在Z的核糖基或脱氧核糖基的3'端附接的一个或多个核苷酸或末端羟基基团；并且6然碱基，并且其中所述至少三种不同的非天然碱基的第一非天然碱基包含权利要求1所述731.根据权利要求30所述的半合成生物体，其中所述异源核苷三磷酸转运蛋白是33.根据权利要求32所述的半合成生物体，其中所述异源tRNA合成酶是巴氏甲烷八叠39.根据权利要求38所述的半合成生物体，其中所述mRNA包含至少一种选自41.根据权利要求40所述的半合成生物体，其中所述tRNA包含至少一种选自的非天然碱基。842.根据权利要求1-3中任一项所述的核碱基，其中所述多核苷44.根据权利要求1-3中任一项所述的核碱基，其中所述9[0002]本申请要求于2019年6月14日提交的美国临时申请[0004]本申请含有已以ASCII格式电子提交并通过引用以其整体特此并入的序列表。2020年6月10日创建的所述ASCII副本命名为36271-808_601_SL.txt并且大小为18,162字[0006]本文公开的发明至少部分是在美国政府支持下在美国国立卫生研究院(NIH)的授权号5R35GM118178和GM128376和F31GM128376以及美国国家科学基金会(NSF)的授权号对用于氢负离子转移、氧化还原活性和亲电键形成等的辅因子的使用证明了这些局限性。[0008]大约20年前，通过使用琥珀终止密码子(UAG)对大肠杆菌中的ncAA进行编码来扩展遗传密码，创立了一种增加生物体可用的多样性的方法。这是使用来自詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的tRNA-氨基酸tRNA合成酶(aaRS)对实现的，其中tRNA被重意的是来自巴氏/马氏甲烷八叠球菌的PyltRNA-合成酶对)，扩大了可掺入蛋白质中的[0020]其中波浪线指示与核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物的键合包含在RNA或DNA中或者RNA类似物或DNA类似[0031]实施方案A10是实施方案A9的双链寡核苷酸双链体，其中所述第二链包含互补碱[0032]实施方案A11是实施方案A9的双链寡核苷酸双链体，其中所述第二链包含互补碱[0033]实施方案A12是包含编码转移RNA(tRNA)的基因和/或编码目的蛋白质的基因的质实施方案A7的至少一种互补碱基配对核碱基或其中所述互补碱基[0045]每个Z独立地是实施方案A1至A7中任一项的核碱基，其与核糖基或脱氧核糖基或[0046]N1是在Z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的5'端处附接的一个或多个核苷酸或[0047]N2是在Z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的3'端附接的一个或多个核苷酸或其并且其中每种多核苷酸包含实施方案A1至A5中任一项的至[0054]实施方案A24是实施方案A22或A23的核苷三磷酸，其中所述核苷包含核糖或脱氧[0055]实施方案A25是一种DNA，所述DNA包含具有结构的核碱基和具有结构[0056]实施方案A26是一种DNA，所述DNA包含具有结构的核碱基和具有结构的互补碱基配对核碱基。[0057]实施方案A27是一种将DNA转录到tRNA或编码蛋白质的mRNA的方法，所述方法包[0058]使包含编码所述tRNA或蛋白质的基因的DNA与核糖核苷三磷其中所述编码tRNA或蛋白质的基因包含与第二非天然碱基配对并与所述第二非天然碱基与所述核糖核苷三磷酸和RNA聚合酶接触之前，通过使所述DNA与脱氧核糖核苷三磷酸和[0068]实施方案A37是实施方案A27-A34中任一项的方法，其中所述生物体包括大肠杆碱基、所述第三非天然碱基或所述第四非天然碱基中的至少一者选自：[0097]实施方案A52是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是并且所述第二非天然碱基是或所述第一非天然碱基是并且所[0098]实施方案A53是实施方案A27-A40和A52中任一项的方法，其中所述第三非天然碱[0104]实施方案A59是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第[0105]实施方案A60是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第[0106]实施方案A61是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是[0107]实施方案A62是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第三非天然碱基是[0108]实施方案A63是实施方案A27-A51中任一项的方法，其中所述第四非天然碱基是[0109]实施方案A64是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是[0114]实施方案A69是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述DNA包含至少一种选[0118]实施方案A70是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0119]实施方案A71是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0120]实施方案A72是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0121]实施方案A73是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dPTMO-[0122]实施方案A74是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0123]实施方案A75是实施方案A69的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0124]实施方案A76是实施方案A27-A40中任一项的方法，其中所述DNA包含至少一种选[0130]实施方案A78是实施方案A76的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0131]实施方案A79是实施方案A76的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0132]实施方案A80是实施方案A76的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dPTMO-[0133]实施方案A81是实施方案A76的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0134]实施方案A82是实施方案A76的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-选自[0136]实施方案A84是实施方案A83的方法，其中所述mRNA和所述tRNA包含选自[0140]实施方案A88是实施方案A76-A87中任一项的方法，其中所述tRNA包含选自[0143]实施方案A91是实施方案A76-A87中任一项的方法，其中所述tRNA包含为的非天然碱基。述第二非天然碱基由DNA聚合酶识别。述第四非天然碱基由RNA聚合酶识别。[0152]实施方案A100是实施方案A27-A98中任一项的方法，其中所述蛋白质包含至少三基酸包括N6-叠氮基乙氧基-羰基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-羰基-L-赖氨酸括N6-叠氮基乙氧基-羰基-L-赖氨酸(AzK)或N6-炔丙基乙氧基[0162]实施方案A105是实施方案A104的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括N6-[0163]实施方案A106是实施方案A104的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括N6-应于包含所述第三非天然碱基的mRNA密码子的位置处包含[0173]实施方案A114是实施方案A112的半合成生物体，其中所述DNA包含至少一种为的非天然核碱基。[0174]实施方案A115是实施方案A110-A115中任一项的半合成生物体，其中所述生物体[0176]实施方案A117是实施方案A110-A116中任一项的半合成生物体，其中所述生物体[0178]实施方案A119是实施方案A110-A118中任一项的半合成生物体，其中所述生物体[0179]实施方案A120是实施方案A119的半合成生物体，其中所述异源RNA聚合酶是T7[0180]实施方案A121是实施方案A110-A120中任一项的半合成生物体，其中所述生物体[0182]实施方案A123是实施方案A110-A122中任一项的半合成生物体，所述半合成生物选自[0184]实施方案A125是实施方案A110-A125中任一项的半合成生物体，所述半合成生物选自码蛋白质的基因的模板链包含第一非天然碱基以及(2)编码tRNA的基因，其中所述编码tRNA的基因的模板链包含能够与所述第一非天然碱基形成碱基对的第二链包含第一非天然碱基以及(2)编码tRNA的基因，其中所述编码tRNA的基因的模板链包含或碱基能够与所述第二非天然碱基和/或所述第二替代非天然碱基形成第二非天然碱基对，其中所述第一非天然碱基对和所述第二非天然碱基对不因以将第三非天然碱基掺入mRNA中，所述第三非天然碱基能够与所述第一非天然碱基和/碱基和/或所述第二替代非天然碱基形成第二非天然碱基对，其中所述第一非天然碱基对[0199]实施方案A132是实施方案A127-A131中任一项的方法，其中所述方法包括使用半[0217]实施方案A146是实施方案A138的方法，其中所述第一非天然碱基是[0225]实施方案A154是实施方案A138中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非是[0227]实施方案A是实施方案A138的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且[0230]实施方案A159是实施方案A138的方法，其中所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并[0231]实施方案A160是实施方案A127-A159中任一项的方法，其中所述第三非天然碱基[0232]实施方案A161是实施方案A127-A159中任一项的方法，其中所述第三非天然碱基[0233]实施方案A162是实施方案A127-A161中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基[0234]实施方案A163是实施方案A127-A159中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基[0237]实施方案A165是实施方案A164的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0238]实施方案A166是实施方案A164的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0239]实施方案A167是实施方案A164的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0240]实施方案A168是实施方案A164的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0241]实施方案A169是实施方案A164的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0247]实施方案A171是根据实施方案A170的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为[0248]实施方案A172是实施方案A170的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0249]实施方案A173是实施方案A170的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0250]实施方案A174是实施方案A170的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dNaM-[0251]实施方案A175是实施方案A170的方法，其中所述DNA模板包含至少一种为dCNMO-[0252]实施方案A176是实施方案A127-A175中任一项的方法，其中所述mRNA和所述tRNA[0253]实施方案A177是实施方案A176的方法，其中所述mRNA和所述tRNA包含选自[0257]实施方案A181是实施方案A176的方法，其中所述tRNA包含选自[0261]实施方案A185是实施方案A127-A137中任一项的方法，其中所述第一非天然碱基[0262]实施方案A186是实施方案A127-A137中任一项的方法，其中所述第三非天然碱基[0263]实施方案A187是实施方案A127-A186中任一项的方法，其中所述蛋白质包含至少[0264]实施方案A188是实施方案A127-A186中任一项的方法，其中所述蛋白质包含至少[0265]实施方案A189是实施方案A127-A186中任一项的方法，其中所述蛋白质包含至少[0266]实施方案A190是实施方案A127-A186中任一项的方法，其中所述蛋白质包含至少[0267]实施方案A191是实施方案A127-A190中任一项的方法，其中所述至少一个非天然[0273]实施方案A192是实施方案A127-A191中任一项的方法，其中所述至少一个非天然括N6-叠氮基乙氧基-羰基-L-赖氨酸(AzK)或N6-炔丙基乙氧基[0275]实施方案A194是实施方案A193的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括N6-[0276]实施方案A195是实施方案A193的方法，其中所述至少一个非天然氨基酸包括N6-[0278]图1A展示了使用非天然碱基对(UBP)以使用非天然X-Y碱基对将非规范氨基酸(ncAA)位点特异性掺入蛋白质中的工作流程。三种ncAA向蛋白质中的掺入仅作为示例显[0281]图3A展示了在sfGFP基因中的UBP保留(％)图，以优化使用各种dXTP的情况下AzK[0282]图3B展示了在tRNAPyl基因中的UBP保留(％)图，以优化使用各种dXTP的情况下[0283]图3C展示了在存在或不存在AzK的情况下观察到的相对sfGFP荧光(归一化为细胞生长(相对荧光单位(RFU)/OD600))图，以优化使用各种dXTP的情况下AzK向sfGFP中的掺[0287]图5A展示了使用各种非天然核糖核苷酸(以将AzK掺入sfGFP中)的翻译的SAR分析[0288]图5B展示了使用各种非天然核糖核苷酸(以将AzK掺入sfGFP中)的翻译的SAR分析[0289]图5C展示了使用各种非天然核糖核苷酸(以将AzK掺入sfGFP中)的翻译的SAR分析[0290]图5D展示了使用各种非天然核糖核苷酸(以将AzK掺入sfGFP中)的翻译的SAR分析[0291]图6A展示了非天然核糖核苷酸三磷酸浓度关于随NaMTP和TAT1TP浓度(μM)变化的[0292]图6B展示了非天然核糖核苷酸三磷酸浓度关于随5FMTP和TAT1TP(μM)浓度变化的[0293]图6C展示了非天然核糖核苷酸三磷酸浓度关于随NaMTP和TAT1TP浓度(μM)变化的[0294]图6D展示了非天然核糖核苷酸三磷酸浓度关于随5FMTP和TAT1TP浓度(μM)变化的[0296]图7B是在存在AzK的情况下观察到的各种非天然碱基对、密码子位置和蛋白质移[0297]图7C描绘了使用dCNMOdTPT3/NaMTP,TAT1TP产生的三重标记蛋白质的定量HRMS分20aminoacids:expandingthegeneticlexicon,”J.ofBiologicalChemistry285[0306]“化学上可行的”是指不违反一般理解的有机结构规则的键合排列或化合物；例氧核糖变体)的至少核碱基部分，所述核苷或核苷酸在一些情形中可以含有对核苷或核苷苷酸包括而不限于腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸磷酸(AMP)、尿苷一磷酸(UMP)、胞苷一磷酸(CMP)和鸟苷一磷酸(GMP)、脱氧腺苷三磷酸方式附接至另一个分子(包括但不限于RNA和肽)。RNA包括编码RNA，例如信使RNA(mRNA)。小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小[0314]肽核酸(PNA)是合成的DNA/RNA类似物，其中肽样骨架替代了DNA或RNA的糖-磷酸碱基错配与DNA/DNA双链体中的相似错配相比导致更不稳定化。这种结合强度和特异性也适用于PNA/RNA双链体。PNA不容易被核酸酶或蛋白酶识别，使得它们对酶降解具有抗性。12月).“Sequence-selectiverecognitionofDNAbystranddisplacementwithathymine-substitutedpolyamide”,Science254(5037):1497-500.doi:10.1126/science.1962210.PMID1962210；以及EgholmMFreierSM,DriverDA,BergRH,KimSK,NordénB,和NielsenPE(1993),“PNAHybridizestoComplementaryOligonucleotidesObeyingtheWatson-CrickHydrogenBondingRules”.Nature365(6446):566-8.doi:10.1038/365566a0.PMID[0315]锁核酸(LNA)是修饰的RNA核苷酸，其中LNA核且是可商购的。锁核糖构象增强了碱基堆积和骨架预组织。参见例如Kaur,H；Arora,A；theIncorporationofLockedNucleicAcidNucleotidesintoDNADuplexes”,YouY.,GrothC.L.,Tataurovbi200904e.PMC3201676.PMID21928795；AlexeiA.Koshkin；SanjayK.Singh,PoulNielsen,VivekK.Rajwanshi,RavindraKumar,MichaelMeldgaard,CarlErikOlsen,JesperWengel(1998),“LNA(LockedNucleicAcids):Synthesisoftheadenine,cytosine,guanine,5-methylcytosine,thymineanduracilbicyclonucleosidemonomers,oligomerisation,andunprecedentednucleicacidrecognition”,Tetrahedron54(14):3607-30.doi:10.1016/S0040-4020(98)00094-5；以及SatoshiObika；DaishuNanbu,YoshiyukiHari,Ken-ichiroMorio,YasukoIn,ToshimasaIshida,TakeshiImanishi(1997),“Synthesisof2/-O,4/-C-methyleneuridineand-所述荧光团的荧光会恢复。参见例如TyagiS,KramerFR(1996),“Molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization”,NatBiotechnol.14(3):303-8.PMID9630890；TippI,Malmbescoringofsingle-nucleotidepolymorphisms:comparisonofthe5'-nucleaseTaqManassayandMolecularBeaconprobes”,Biotechniques28(4):732-8.PMID10769752；以及AkimitsuOkamoto(2011),“ECHOprobes:aconceptoffluorescence文献的每一个的披露内容通过引用以其整体例如至少部分自杂交的分子或部分或完全杂交的分子对)的相对链上的两个碱基，其中这[0323]本文在某些实施方案中公开了用于产生具有扩展的遗传字母的核酸的体外和体物体。在一些情况下，所述方法包括将至少一种非天然碱基对(UBP)掺入一种或多种核酸非天然氨基酸进行位点特异性掺入。本文还描述了包含扩展的遗传字母的半合成生物体，基之间的互补配对(第二碱基对)允许通过使包含非天然核酸的tRNA与mRNA匹配进行翻译。[0326]转录包含第一非天然碱基和第二非天然碱基的DNA模板以将第三非天然碱基掺入成碱基对和/或被配置为与所述第一非天然碱基形成碱基对，所述第三非天然碱基与所述第一非天然碱基互补、能够与所述第一非天然碱基形成碱基对和/或被配置为与所述第一[0327]转录所述DNA模板以将第四非天然碱基掺入tRNA中，其中所述第四非天然碱基与所述第二非天然碱基互补、能够与所述第二非天然碱基形成碱基对和/或被配置为与所述基包括除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶以外的碱基(在修饰的DNA中)或除了腺嘌涵盖具有环外取代基的嘌呤和嘧啶)以外的环或环系的碱基，或包含含有一种或多种非氮腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生基)-H-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)，咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-等人,(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813；TheConciseEncyclopediaofPolymerScienceandEngineering,Kroschwitz,J.I.,编辑,JohnWiley&Sons,1990,858-859；15章,AntisenseResearchandApplications,Cr288中的那些。另外的碱基修饰可发现于例如美国专利号3,687,808；Englisch等人,[0335]包含各种杂环碱基和各种糖部分(和糖类似物)的非天然核酸是本领域中可获得糖部分。[0340]在一些实施方案中，所述非天然碱基(如本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋[0346]在一些实施方案中，所述非天然碱基(如本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋氨基酸的蛋白质的方法的第一非天然碱基或第二非天然[0348]在一些实施方案中，所述第一非天然碱基是并且所述第二非[0349]在一些实施方案中，所述非天然碱基(如本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋三非天然碱基是在一些实施方案中，所述第四非天然碱基是在一些实施方案中，所述非天然碱基(如本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋白质的方法的第三第三非天然碱基是在一些实施方案中，所述第四非天然碱[0350]在一些实施方案中，所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是在一些实施方案中，所述第三非天然碱基是些实施方案中，所述第一非天然碱基是所述第二非天然碱基是所述第三非天然碱基是并且所述第四非天然碱基是[0352]在本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋白质的方法的一些实施方案中，所述其中每个糖部分独立地是本文所述的任何实施方案或变型。在一些实施方案中，[0354]在本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋白质的方法的一些实施方案中，所述在一些实施方案中，所述DNA包含至少一种为dNaM-基对(UBP)。在一些实施方案中，所述DNA包含至少一种为dNaM-dTAT1的非天然碱基对[0356]在本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋白质的方法的一些实施方案中，所述所述tRNA包含至少一种选自以下的非天为dNaM-dTPT3的非天然碱基对(UBP)。在一些实施方案中，所述DNA包含至少一种为dNaM-[0359]在本文所述的产生包含非天然氨基酸的蛋白质的方法的一些实施方案中，所述并且其中所述mRNA和所述tRNA包含至少一种选自以在一些实施方种为dNaM-dTAT1的非天然碱基对(UBP)。在一些实施方案中，所述DNA包含至少一种为[0362]在一些实施方案中，所述mRNA和所述tRNA包含选自的非天然碱基。在一些实施方案中，所述mRNA和所述tRNA包含选自US2002/006460)、5’-取代的DNA和RNA衍生物(PCT/US2011/033961；Saha等人,J.OrgNucleicAcids,2004,23(1&2),317-337)；将这些文献的每一个的披露内容通过引US94/02993)，如5’-CH2-取代的2’-O-保护的核苷(Wu等人,HelveticaChimicaActa,3和5核酸可以包括5’-亚甲基膦酸酯DNA和RNA单体、和二聚体(Bohringer等人,Tet.Lett.,1993,34,2723-2726；Collingwood等人,Synlett,1995,7,703-705；和Hutter等人,括在5’和/或6’位置处包含羟基的5’或6’-膦酸酯核糖核苷的类似物(Chen等人,1987,30,888-894；Hampton等人,J.Med.Chem.,1976,19,1371-1377；Geze等人,中糖基团已被修饰的一种或多种核苷。此类糖修饰的核苷可以赋予增强的核酸酶稳定性、饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的例子包括而不限于添加取代基(包括5’氧原子(R＝H、C1-C12烷基或保护基团)；及其组合。经化学修饰的糖的例子可发现于WO)nOCH32)nNH22)nCH333332CH3222结构的制备，并且详述并描述了一系列的碱基修饰，所述美国专利是例如美国专利号4,3和21(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地是H或者取代或未取代的C1-C10烷154401)。还参见例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,97,5633-5638；Kumar等人,WO1994/14226、WO2005/021570、WO2007/090071和WO2007/134181；美国专利公开号些文献的每一个的披露内容通过引用以其整体特此酸酯(P＝S)。代表性的不含磷的核酸间连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚氨基(-CH2-N或非桥接)、磷酸三酯、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、二硫代磷酸酯代磷酸酯核苷酸间连接)可以赋予经修饰的核酸免疫调节活性和/等人,1996,NucleicAcidsRes.24:1841-1848；Chaturvedi等人,1996,NucleicAcidsRes.24:2318-2323；和Schultz等人,(1996)NucleicAcidsRes.24:2966-2973；Matteucci,1997,“OligonucleotideAnalogs:anOverview”inOligonucleotidesasTherapeuticAgents,(Chadwick和Cardew,编辑)JohnWileyandSons,纽约,纽约州；andAnalogs,SynthesisandProperties,HumanaPress,第165-190页；Miller等人,1971,JACS93:6657-6665聚物；肽核酸(PNA)；以及带正电荷的脱氧核糖核酸胍(DNG)寡聚物(Micklefield,2001,和使用PNA分子，将这些文献的每一个通过引用并入本文。还参见Ni如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.KY.Acad.Sci.,1992,660,306-309；(Saison-Behmoaras等人,EM5OJ,1991,10,1111-1118；rac-甘油或l-二-O-十六烷基-rac-甘油-S-H-膦酸三乙铵(Manoharan等人,Tetrahedron乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人,[0386]其中波浪线指示与核糖基、脱氧核糖基或二脱氧核糖基部分或其类似物的键合[0388]在本文所述的核碱基的一些实施方案中，核碱基具有结构：在一些RNA或DNA中或者RNA类似物或DN2是叠氮基。的核碱基，并且第二互补寡核苷酸链在其互补碱基配对位点中包含互补碱基配对核碱基。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸链包含并且所述第二链在其互补碱基配方案中，氨酰tRNA合成酶源自甲烷球菌属(Methanococcus/Methanocaldococcus)或其变[0413]N1是在Z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的5'端处附接的一个或多个核苷酸或[0414]N2是在Z的核糖基或脱氧核糖基或其类似物的3'端附接的一个或多个核苷酸或其的一个或多个核苷酸或其类似物。可以通过磷酸二酯附接至核糖基或脱氧核糖基部分的5’在一些实施方案中，核碱基是 合的非天然核酸是可以与另一非天然核酸形成碱基对(非天然核酸碱基对(UBP))的非天然间和之后进行碱基配对的一对非天然核苷三磷酸包括(d)5SICS的三磷酸酯((d)5SICSTP)和(d)NaM的三磷酸酯((d)NaMTP)。其他例子包括但不限于：(d)CNMO的三磷酸酯((d)CNMOTP)和(d)TPT3的三磷酸酯((d)TPT3TP)。此类非天然核苷酸可以具有核糖或脱氧核糖行碱基配对的一对非天然核苷三磷酸包括dCNMO的三磷酸酯(dCNMOTP)和TAT1的三磷酸酯[0425]能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的示例性非天然核苷酸包括中，能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的非天然核苷酸包括但不限于些实施方案中，能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的非天然核苷酸包括在一些实施方案中，能够在体内条件下形成非天然DNA或RNA碱基对(UBP)的非天然核苷酸其中所述糖部分是本文所述的任何实施方案或变型。在一些实在任何[0429]在一些情况下，将使用的细胞用编码异源蛋白质的表达盒以及任选的CRISPR/Cas9系统(以消除已经失去非天然核苷酸的DNA)进行遗传转化，所述异源蛋白质例如能够将非天然核苷三磷酸转运到细胞中的核苷三磷酸转运蛋白([0431]在一些情况下，将编码Cas9和sgRNA的第一质粒和编码包含非天然核苷酸的核酸[0432]在一些实施方案中，产生在其DNA(质粒或基因组)内掺入至少一种非天然核苷酸苷酸三磷酸转运蛋白的作用将所述非天然互相碱基配对的核苷酸作为其相应三磷酸酯吸酯的非天然互相碱基配对的核苷酸对可以是dTPT3的三磷酸酯(dTP3TP)和dNaM(dNaMTP)或[0434]在一些情形中，本文所述的方法还包括在磷酸钾和/或磷酸酶或核苷酸酶的抑制于适合于细胞的生长和复制的生命支持培养基内。可以将细胞维持在生命支持培养基中，复制周期。作为相应三磷酸酯的非天然互相碱基配对的核苷酸对可以包含dTPT3的三磷酸且可以通过转运蛋白PtNTT2将dTPT3TP和dNaMTP输入大肠杆菌中，其中大肠杆菌聚合酶如等核糖核苷酸在一些情况下通过转运蛋白PtNTT2输入大脱氧核糖核苷酸和第二非天然脱氧核糖核苷酸的双链DNA质粒或其他核酸电穿孔到细胞然脱氧核糖核苷酸和第四非天然脱氧核糖核苷酸的核糖核苷酸变体添加至细胞培养基中。至少一个核酸内具有至少一种非天然核苷酸和/或至少一种非天然碱基对(UBP)的活增殖和复制的生命支持培养基中与一种或多种非天然核苷酸接触(例如，在其存在下生长)时，所述细胞表达适于提供一种或多种非天然核苷酸的三磷酸酯形式的细胞摄取的核苷酸三对的核苷酸掺入细胞内的核酸中(ChenT,RomesbergFE,FEBSLe献的每一个的披露内容通过引用以其整体特此并入)。可以将非天然核苷酸掺入细胞核酸T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook(1982)MolecularCloning:aLaboratoryManual；Cold[0441]在一些情形中，细胞包含掺入细胞内的一种或多种核酸中的非天然核苷三磷例如，细胞可以是能够将至少一种非天然核苷酸掺入维持在细胞内的DNA或RNA内的活细相应三磷酸酯)通过核苷三磷酸转运蛋白的作用被吸收到所述细胞中，所述核苷三磷酸转体的DNA复制机构稳定增殖，例如，当在包含dTPT3TP和dCNMOTP的生命支持培养基中生长两个互相碱基配对的核苷酸)的相应三磷酸酯形式，并且在至少一种非天然核苷酸(例如，能够形成非天然碱基对(UBP)的两个互相碱基配对的核苷酸)的相应三磷酸酯形式存在下，述方法还可以包括在适合于细胞的生长和复制的生命支持培养基中使遗传转化的细胞接两个互相碱基配对的核苷酸)的相应三磷酸酯形式，并且在至少一种非天然核苷酸(例如，被配置为形成非天然碱基对(UBP)的两个互相碱基配对的核苷酸)的相应三磷酸酯形式存扩展的遗传字母的细胞包含非天然核酸，所述非天然核酸含有具有核碱基的非天然核苷酸，所述核碱基通过疏水和/或堆积相互作用与所述核碱基或另一非天然核苷酸进行碱基基配对的非天然核酸(非天然核酸碱基对(UBP))[0445]在一些实施方案中，细胞在体内条件下从输入的非天然核苷酸形成非天然DNA碱于磷酸钾和/或磷酸酶和核苷酸酶的抑制剂的存在下。非天然核苷三磷酸可以通过细胞的在一些实施方案中，UBP可以在基本上一致地暴露于非天然三磷酸酯时被掺入细胞或细胞或多种非天然三磷酸酯的摄取相比，在细胞中诱导异源基因(例如，核苷三磷酸转运蛋白达可以导致增加的细胞生长和增加的非天然或更多次倍增后稳定掺年生长后稳定掺入细胞或物体的DNA形成非天然碱基对(UBP)。在一些实施方案中，非天然碱基对(UBP)是dCNMO-在一些实施方案中，所述DNA包含至少一种选自以下的非天然核碱基：[0454]在一些实施方案中，细胞进一步利用RNA聚合酶产生含有一个或多个非天然核苷三磷酸转运蛋白PtNTT2，并且还表达tRNA合成酶巴氏甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰-tRNA合成异源tRNA包含至少一种选自的非天然碱基。在一中，所述异源tRNA包含至少一种为的非天然碱基。在一些实施方案中，所述异源[0464]“天然存在的氨基酸”可以指一般在自然界中合成的肽中发现的二十种氨基酸中[0468]“氨基酸类似物”可以是结构上与氨基酸类似并且可以在拟肽大环的形成中取代合成的肽中常见的并且以单字母缩写(2-甲基苯基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(S)-3-氨基-4-(2-代环己-1-亚基)乙基)-L-α,β-二氨基丙酸；(N-β-4-甲基三苯甲基)-L-α,β-二氨3)-OHL-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(N6-叠氮基乙氧基-羰基-L-赖氨酸，(Staudingerligation)、反电子需求的迪尔斯-阿尔德(inverse-electron-demand基酸是硒代丝氨酸(2-氨基-3-氢硒代丙酸)。在一些情况下，非天然氨基酸是2-氨基-3-基乙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，非天然氨基酸是2-氨基-6-{[(2-硝基苄氧基)羰氨基酸是N6-((丁-3-炔-1-基氧基)羰基)-赖氨酸。在一些情况下，非天然氨基酸是N6-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)乙氧基)羰基)赖氨酸。在一些情况下，非天然氨基酸是施方案中，所述至少一个非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-羰基-L-赖氨酸(AzK)或N6-中，正交tRNA是修饰的甲硫氨酸tRNA。在一些实施方案中，正交tRNA是修饰的苯丙氨酸蛋白质中。示例性aaRS-tRNA对包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)可以通过Mj-TyrRS/tRNA对掺入的示例性非天然氨基酸(UAA)包括但不限于对位取代的苯中。可以通过Ec-Tyr/tRNACUA或Ec-Leu/tRNACUA对掺入的示例性UAA包括但不限于含有苯甲甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)。可以通过吡咯赖氨酰-tRNA对掺入的示例酶掺入本文所述的蛋白质中，将所述文献的每一个的披露内容通过引用以其整体特此并[0498]在一些情况下，将非天然氨基酸通过天然存在的合成酶掺入本文所述的蛋白质在一些情况下，非天然氨基酸是Wan等人,“Pyrrolysyl-tRNAsynthetase:anordinaryenzymebutanoutstandinggeneticcodeexpansiontool,”BiocheimBiophys[0501]在一些实施方案中，非天然氨基酸包括图8D-图8G所展示的非天然氨基酸(从[0502]在一些实施方案中，本文所述的掺入蛋白质中的非天然氨基酸披露于US9,840,每一个的披露内容通过引用以其整体特此并入。可以通过此类合成酶掺入的示例性UAA包孢酵母属(Rhodosporidium)酵母(例如，圆红冬孢酵母(R.toruloides))、酵母属酵母属(Trichosporon)酵母(例如，茁芽丝孢酵母(T.pullans)、皮状丝孢酵母生菌属(Blastomyces)、假丝酵母属、金孢子菌属(Chrysosporium)、德巴利酵母属母属(Kluyveromyces)、油脂酵母属、Lssatchenkia、小孢子菌属(Microsporum)、Myxotrichum、Myxozyma、树粉孢属(Oidiodendron)、管囊酵母属(Pachysolen)、青霉属黄曲霉菌(Aspergillusflavus)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、黑曲霉菌(Aspergillusniger)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)、Auxarthron母(Candidaglabrata)、吉利蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、乳酒假丝酵母(Candidakefyr)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei)、郎比可假丝酵母(Candidalambica)、解脂假丝酵母、Candidalustitaniae、近平滑假丝酵母(Candida假丝酵母、产蛋白假丝酵母、维斯假丝酵母、Candidaxestobii、嗜角质金孢子菌扩散型变种(Cryptococcusalbidusvar.diffluens)、罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)、新型隐球酵母(Cryptococcusneofomans)、汉氏德巴利酵母(Debaryomyces子菌(Microsporumgypseum)、Myxotrichumdeflexum、棘刺树粉孢(Oidiodendronechinulatum)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilis)、点青霉(Penicilliumnotatum)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母(Pichiakluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、顶孢帚霉(Scopulariopsis菌株的非限制性例子包括但不限于sAA001(ATCC20336)、sAA002(ATCC20913)、sAA003(ATCC20962)、sAA496(US2012/0077252)、sAA106(US2012/0077252)、SU-2(ura3-/一些热带假丝酵母和维斯假丝酵母菌株可以被视为是等同的并且同样适合于本文所述的[0508]可以选择任何合适的真菌作为宿主微生物、工程化微生物或异源多核苷酸的来(Schizochytrium)真菌和根霉属(Rhizopus)真菌(例如，无根根霉(R.arrhizus)、米根霉限于菌株ATCC24690，并且在某些实施方案中，真菌是构巢曲霉菌株，包括但不限于菌株来源。可以选择革兰氏阴性菌或革兰式阳性菌。细菌的例子包括但不限于芽孢杆菌属属(Chloronema)细菌(例如，巨大绿线菌(C.gigateum)))、绿色硫细菌(例如，绿菌属杆菌(R.capsulatus))和红微菌属(Rhodomicrobium)细菌(例如，范氏红微菌angustifolia)、Cupheaappendiculata、Cupheaavigera、Cupheaavigeravar.pulcherrima、Cupheaaxilliflora、巴菲萼距花(Cupheabahiensis)、Cupheabaillonis、Cupheabrachypoda、Cupheabustamanta、Cupheacalcarata、Cupheacrassiflora、蓝斑萼距草(Cupheacyanea)、Cupheadecandra、粗齿萼距花(Cuphea花(Cupheahyssopifolia)(墨西哥石楠花)、Cupheahyssopoides、火红萼距花(Cupheaignea)、Cupheaingrata、Cupheajorullensis、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、浅黄萼距花(Cuphealutescens)、Cupheamelanium、Cupheamelvilla、小花萼距花(Cupheamicrantha)、小瓣萼距花(Cupheamicropetala)、Cupheamimuloides、CupheaCupheapseudovaccinium、美丽萼距花(Cupheapulchra)、总状萼距花(Cuphearacemosa)、匍匐萼距花(Cuphearepens)、柳叶萼距花(Cupheasalicifolia)、Cupheasalvadorensis、Cupheaschumannii、无柄萼距花(Cupheasessiliflora)、Cuphea[0515]在一些情况下，本文公开的内容包括例如在DNA扩增期间将非天然核酸掺入生长文献中所述：Bordo,等人JMolBiol217:721-729(1991)和Hayes,等人ProcNatlAcad[0518]还可以使用具有改进非天然核酸进入活性位点区域以及在活性位点区域中与非糖的非天然核酸的特异性是野生型聚合酶对天然核酸和/或不含修饰的糖的非天然核酸的非天然核酸的特异性是野生型聚合酶对天然核酸和/或不含修饰的碱基的非天然核酸的特核酸的特异性是野生型聚合酶对包含三磷酸酯的核酸和/或不含三磷酸酯的非天然核酸的[0520]在一些实施方案中，修饰的或野生型聚合酶具有对非天然核酸的松弛的特异型聚合酶对包含修饰的糖的非天然核酸的特异性和对天然核酸的特异性是野生型聚合酶饰的碱基的非天然核酸的特异性和对天然核酸的特异性是野生型聚合酶对天然核酸的特[0521]外切核酸酶活性的不存在可以是野生型特征或由变体或工程化聚合酶赋予的特DNA聚合酶的例子包括polA、polB(参见例如Parrel和Loeb,NatureStrucBiol2001)polC、polD、polY、polX和逆转录酶(RT)，但是优选地是进行性高保真度聚合酶(PCT/核酸酶活性。在一些实施方案中，修饰的或野生型聚合酶基本上缺少针对非天然核酸的3’酶活性是野生型聚合酶对天然核酸的校对外切核酸酶活性的至少约60％、70％、80％、本文所述方法中可以调整以调谐反应速率的度存在以竞争聚合酶-链-模板核酸二元复合物中相同位点的链合成时，DNA聚合酶保真度可以作为正确的与错误的天然和非天然核酸掺入的比率来测量。DNA聚合酶保真度可以作为天然和非天然核酸的(kcat/Km)与错误的天然和非天然核酸的(kcat/Km)的比率中kcat和Km是稳态酶动力学中的Michaelis-Menten参数(Fersht,A.R.(1985)Enzyme天然来源的聚合酶或其变体。在一个例子中，可以针对掺入非天然核酸或UBP(例如，筛选聚合酶。可以使用展示如与野生型聚合酶相比对非天然核酸的修饰的特性的聚合酶然存在的核苷酸)存在下的持续合成能力、聚合酶在非天然核酸存在下的平均模板读长[0528]本文所用的可以具有掺入特定结构的非天然核酸的能力的聚合酶还可以使用定[0529]所述组合物的修饰的聚合表达增加或过表达促进增加的非天然碱基对(UBP)在工程化细体或改变的形式。DNA聚合酶及其特性尤其详细描述于以下中：DNAReplication第2版,包括但不限于激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等人,1991,Gene,108:1,Stratagene)、乌兹炽热球菌(Pyrococcuswoesei)(Pwo)DNA聚合酶(Hinnisdaels等人,1996,Biotechniques,20:186‑8,BoehringerMannheim)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶(Myers和Gelfand1991,Biochemistry30:7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶(Stenesh和McGowan,1977,BiochimBiophysActa475:32)、嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)(TIi)DNA聚合酶(也称为VentTMDNA聚合酶，Cariello等人,1991,PolynucleotidesRes,19:4193,NewEnglandBiolabs)、9°NmTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs)、Stoffel片段、Thermosequenasc8(AmershamPharmaciaBiotechUK)、酶(Diaz和Sabino,1998BrazJMed.Res,31:1239)、水生栖热菌(Thermusaquaticus) (Taq)DNA聚合酶(Chien等人,1976,J.Bacteoriol,127:1550)、DNA聚合酶、PyrococcuskodakaraensisKODDNA聚合酶(Takagi等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:4504)、JDF‑3DNA聚合酶(来自高温球菌属物种JDF‑3，专利申请WO0132887)、热球菌属GB‑D(PGB‑D)DNA聚合酶(也称为DeepVentTMDNA聚合酶，Ju16:820,NewEnglandBiolabs)、UlTmaDNA聚合酶(来自嗜热生物海栖热袍菌；Diaz和Sabino,1998BrazJ.Med.Res,31:1239；PEAppliedBiothermococcusgorgonarius，RocheMolecularBiochemicals)、大肠杆菌DNA聚合酶I 等人,1981,JBiol.Chem.256:3酶、RB69DNA聚合酶、KODDNA聚合酶、和ventR®DNA聚合酶(Gardner等人.(2004)“ComparativeKineticsofNucleotideAnalogIncorporationbyVentDNAPolymerase”J.Biol.Chem.,279(12),11834‑11842；Gardner和Jack“DeterminantsofnucleotidesugarrecognitioninanarchaeonDNApolymerase”NucleicAcidsTM、TM和DeepVentTMDNA聚RB69DNA聚合酶、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录CtNTT2(沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis))、PamNTT1、PamNTT2(Protochlamydiaamoebophila)、CcNTT(Caedibactercaryophilus)、或RpNTT1(普氏立克次氏体分离的基于蛋白质的酶及其功能变体。提及特定NTT(如下文所例示的那些)时将理解为包[0541]还可以使用具有改进非天然核酸进入细胞中以及在核苷酸结合区域中与非天然示出对非天然核苷酸的特异性输入活性高达相应野生型NTT的至少约0.1％(例如，约[0543]来自天然来源或其变体的NTT可以使用检测三磷酸酯的量的测定(如果三磷酸酯性输入活性。在一些实施方案中，NTT任选地展示出对能够支持复制和转录的天然核酸的[0545]本文所用的可以具有输入特定结构的非天然三磷酸酯的能力的NTT还可以使用定的特异性的NTT变体。例如，可以针对输入非天然三磷酸酯(例如d5SICSTP、dNaMTP、细胞中表达NTT变体。此类技术可以用于针对对本文所述的任何非天然三磷酸酯的活性来[0547]用于本文所述的方法、细胞或工程化微生物的核苷酸和/或核酸试剂(或多核苷[0548]核酸试剂有时包含与ORF相邻的核苷酸序列，其与ORF结合翻译并编码氨基酸标技术人员适当地选择。标签可以促进从培养物或发酵培养基分离和/或纯化所需ORF产物。[0549]具有或不具有非天然核苷酸的核酸或核酸试剂可以包含通常根据核酸的计划用多种特定分子间相互作用接触40S核糖体亚基。核糖体增强子序列的例子是已知的并且可以由技术人员鉴定(例如，Mignone等人,NucleicAPaulous等人,NucleicAcidsResearch31:722-733(2003)；Akbergenov等人,NucleicAcidsResearch32:239-247(2004)；Mignone等人,GenomeBiology3(3):Shaloiko等人,DOI:10.1002/bit.20267；和Gallie等人,NucleicAcidsResearch15:同源或异源核苷酸序列)可操作地连接的同源或异源启动子的转录来增加现有活性的表的核苷酸序列可操作地连接的同源或异源启动子的转录来降低[0557]来自表达盒或表达载体的核苷酸三磷酸转运蛋白的表达可以通过能够在原核细动子元件通常包含可以促进特定基因转录的DNA区域，通过提供对应于基因的RNA合成的起始位点来促进。在一些实施方案中，启动子通常位于其所调节的基因附近，位于基因上游 调节表达。用于核酸表达的非天然启动子(例如，通常与给定的核酸序列无关的启动子)通本文所述的具有所需活性的多肽的多核苷酸呈功能性连接。如本文关于启动子所用的术语子元件调节或控制编码序列经由转录的表达时，启动子与编码序列可操作地连接或呈功能用。[0558]启动子通常与RNA聚合酶相互作用。聚合酶是催化使用预先存在的核酸试剂合成或开放阅读框(ORF)可操作地连接。从启动子元件转录可以催化对应于与所述启动子可操