总黄酮提取与纯化的研究进展

总黄酮提取与纯化的研究进展摘要黄酮类化合物广泛分布于植物界中，其提取与纯化方法多种多样。本文阐述了溶剂提取法、超滤提取法、酶解法等一些较为传统的提取方法，以及一些传统与现代技术相结合的新型方法，如超声提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等提取方法，同时详细概述了大孔树脂吸附法、聚酰胺树脂吸附法、高速逆流色谱法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、膜分离纯化技术等纯化方法，并对其优缺点进行分析，旨在为今后植物黄酮的研究和开发提供参考。关键词：黄酮；提取；纯化AdvancesinextractionandpurificationoftotalflavonoidsAbstractFlavonoidsarewidelydistributedintheplantkingdom,andtheextractionandpurificationmethodsarevarious.Thisarticleexpoundsthesolventextraction,ultrafiltrationextraction,enzymatichydrolysisandsoonsomeofthemoretraditionalextractionmethods,aswellassomenewmethodofcombiningtraditionalandmoderntechnology,suchasultrasonicextraction,microwaveassistedextraction,supercriticalfluidextraction,extractionmethods,atthesametimedetailedsummarizesthemacroporousadsorptionresin,polyamideresinadsorptionmethod,high-speedcountercurrentchromatography,highperformancecapillaryelectrophoresis,highperformanceliquidchromatography,membraneseparationandpurificationtechnologyandpurificationmethod,andanalyzestheiradvantagesanddisadvantages,toprovidereferenceforfutureresearchanddevelopmentofplantflavonoids.Keywords:Flavonoids;extraction;purification

前言黄酮类化合物（flavonoids）是色原酮或色原烷的衍生物，不是某种单一的化合物，而是一种广泛存在于自然界中，泛指两个具有酚羟基的苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列具有相同或相似结构的化合物[1]，是生命中一种较为重要的生理活性物质，有着较多的提取分离纯化方法，其化合物大多都显黄色，广泛存在与谷物、植物根茎、花中，大部分来源于色彩鲜艳的花卉、水果和树叶[2]。黄酮类化合物有着有着悠久的发展历史，近年来，因具有多种提取纯化方法而逐渐被广泛引用，大多数植物体内均含有黄酮类化合物。目前，我国植物资源最丰富，约有3万多种高等植物。据统计，具有生理活性的黄酮类物质有5000多种，随着科技的不断发展，各方面的研究也越来越广泛和深入。近年来，黄酮类化合物的研究方向更倾向于提取和纯化的新方法，因此，为了获得良好的提取分离效果，必须在有效的植物黄酮的提取和纯化过程中进行更深入的研究，将会产生积极的作用，充分利用自然资源和更好的利用自然资源。总的来说，目前黄酮类化合物用于实验和生产过程中的提取分离纯化方法有很多，每种提取纯化方法都有其各自的优缺点，为了提高黄酮类物质的提取率、降低生产成本，应考虑所选物质的结构、性质、生物活性以及提取工艺等多种条件来选择最合适的分离纯化方法。近年来，随着社会的进步和发展，发现了很多应用物理电场的新兴技术，并逐步应用到生活中的各个方面，对未来的发展必将有着广阔的前景。因此，本文详细阐述了黄酮化合物的提取工艺和纯化方法，并对各工艺利弊进行分析作一综述，为进一步开发利用黄酮类化合物提供理论基础。

1黄酮类化合物的提取方法1.1溶剂提取法溶剂提取法是目前我国最经典，实验室应用最广泛的方法之一，通常根据所选药材以及溶剂的性质选用合适的提取方法。1.1.1有机溶剂提取法这是目前实验室使用最频繁、最简单的方法之一，其原理是根据各成分的溶解度不同，选用对有效成分溶解度大，对无效成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从所选药材中提取出来。一般所选用的有机溶剂有乙醚和乙醇。李强等[3]在有机溶剂提取的基础上，加以紫外光照射20min，重复提取2次，黄酮类物质在黄刺玫花中提取率显著提高。1.1.2热水提取法适用于对黄酮苷类的提取，因为黄酮苷类在热水中溶解度高，为了提高提取效率而采用此法进行提取。虽然设备简单，不含有害溶剂，但因黄酮收率低、杂质多、操作复杂且耗时长，故不常使用。但其提取物质受提取次数影响较大，朴春红等[4]用热水提取法重复提取荞麦壳中黄酮类物质，3次效果较好。李晓军等[5]均采用热水提取法，通过优化提取条件，最终金银花中总黄酮提取率为8.01%。1.1.3系统溶剂提取法根据提取物中各类成分的极性不同依次选用极性从小到大的溶剂进行提取，但此法得率较低，所以目前仅用于实验室，很难实现工业化的形成。为毛樱桃进一步研究提供理论依据，而采取毛樱桃总黄酮通过乙醇提取，石油醚、水除杂，乙酸乙酯萃取富集，其得率、纯度及抗炎活性均显著提高[6]。总而言之，溶剂提取法操作相对简单，成本较低，设备普通较常见，但所需时间长，提取温度要适宜，否则将会破坏黄酮类化合物的母核结构和生理功能；提取率低，杂质多且难以去除，还会产生溶剂污染，空气污染和资源浪费等。1.1.4碱性稀醇或碱性水提取法黄酮类化合物大多具有酚羟基的结构，提取时先用碱性物质浸提，再用酸性物质进行酸化，最后析出沉淀。常用的碱性物质有稀的氢氧化钠溶液和石灰水溶液，它们各有其优缺点，一般根据提取物的结构性质选用不同的碱性物质进行提取。例如，当用碱性较强的饱和石灰水作溶剂时，可以考虑选用从槐米中进行提取[7]，与之相反，当用氢氧化钠溶液作为溶剂时，提取物可以选用菊花，且提取效果较好[8]。此法操作简单，产物易于提纯，有高效性和选择性，但不适合用于大规模的生产。实验过程中需要注意的是，所选用碱的浓度应符合提取物的性质，以免在破坏黄酮类化合物的结构，导致失去活性，进而影响提取效率。1.2超滤法提取利用超滤膜两侧的压力差为推动力，根据提取物的性质不同，选用不同孔径的滤膜进行提取植物中的有效成分。为了提高提取物的纯度可以选用此法，不仅可以降低生产物料的成本，环保而且可以有效的避免污染的产生。在选择最佳的超滤条件下，银杏叶提取物中黄酮含量为4.83%，绞股蓝提取物黄酮含量为3.58%[9]。1.3酶解法[10]对于含杂质大多为淀粉、果胶、蛋白质等的中药材的提取，我们可以选用酶解法（Enzymatichydrolysis）。其原理是利用酶的专一性破坏细胞壁，从而更好的释放和提取生物活性物质。近年来，酶辅助提取法被逐步完善。孟庆焕等[11]用酶法辅助乙醇提取牡丹种皮中总黄酮，发现酶法辅助乙醇法黄酮类物质提取率高于乙醇提取法。赵正栋等[12]采用酶解法提取银杏叶黄酮，总黄酮提取率为92.38%。酶解法不仅具有成本低、提取率高、反应条件温和、目的性强、操作简便等优点，并且为绿色化学提供了可能性。1.4超声提取法此法是一种较新的方法，为了加速黄酮类物质的转移，故采用不同参数的超声波在液体中的空化作用进而提高提取效率，且具有耗能低、不破坏有效成分、效率高、方法简单、节约能源、安全环保、经济实用的特点。当超声功率208.48W，提取时间43.62min时，张卓睿等[13]采用超声提取法提取罗汉果花中的黄酮，，黄酮的提取率为6.54%。李佳秀等[14]用超声波辅助提取法重复提取山楂皮渣中总黄酮，4次效果较好。1.5双水相提取法是近几年新发展起来的一种液-液萃取技术，当提取物质进入双水相体系中，由于分子间的相互作用和生物分子的分配系数不同，从而达到提取的目的。双水相体系具有操作简单、条件温和、提高选择性、不存在残留有机溶剂等优点，但由于天然植物中所含成分复杂，而且此法具有较高的专一性和选择性，所以为提取有效成分开辟了一条新的道路，但用于目前实验的并不多。在PEG1500/磷酸盐体系双水相系统中，当取用一定量的银杏叶提取物时，由于其分配系数的不同，黄酮类化合物处于PEG1500体系中，其他无关成分则进入磷酸盐体系中，从而将其进行分离，提取率高达98.2%[15]。1.6微波辅助萃取法微波辅助萃取（Microwaveassistedextraction，MAE）是在传统技术的方法上外加微波能技术形成的一种新的萃取方法。吉莉莉等[16]提取辣木叶总黄酮则采用微波辅助提取法进行提取，提取率高达90%以上；李菁等[17]提取金银花中总黄酮时采用微波辅助提取法，实验结果证实金银花中总黄酮的得率受采收时间影响最显著。近几年，随着微波辅助提取法的逐步完善，采用此法提取黄酮，可以很大程度上缩短提取时间，节约能源，从而提高提取效率。此法具有提取效率高、设备简单、安全、操作容易、较高的选择性、易于控制等优点。1.7超临界流体萃取法超临界流体萃取技术（Super-cifticalfluidextraction，SFE）是利用对物质具有良好的溶解和传质特性，在临界温度和临界压力状态下，将流体与被分离物质接触，使其选择性的将不同成分的从液体或固体中萃取有效成分并进行分离的方法。超临界流体同时具有气体和液体的优点，能够很快的达到传质平衡，实现物质的有效分离，其中，最常用的超临界流体是二氧化碳（CO2）。因为CO2是非极性溶剂，所以限制了对极性较强的物质的提取与分离[18]。为了改变其溶解性所以可以考虑在应用中加入夹带剂，常用的夹带剂有乙醇等。何扩[19]利用超临界CO2提取法，提取率为3.27%，而超临界CO2法得到的黄酮提取率提高到3.95%。采用超临界CO2提取银杏黄酮，可大幅度提高提取效率[20]，但由于工业化萃取设备的费用较大，仍不适宜用于大规模提纯银杏叶黄酮。通过分析不同的提取方法可以得出以下结论：用溶剂提取法提取黄酮类化合物，虽然存在设备简单、操作容易等优点，但浸出时间长且收率低等缺点，故不常使用；随着酶辅助提取法的不断完善，从而为提取生物活性物质提供了更多可能；双相萃取采用两种不同的液体进行萃取，提取率高，而通过在原有技术上结合不同物理电场形成的新型技术，如超声波、微波或超临界流体的方法改变了上述提取法的不足。如超声波具有空化效应可以加速黄酮类物质的转移，从而提高提取效率；微波通过微波能破坏生物大分子的次级键，从而将细胞中的有效成分提取出来。2黄酮类化合物的分离纯化虽然可以通过不同提取方法从植物中得到一定纯度的黄酮，但都是多种成分的混合物，想要得到纯度更高的黄酮，还需要结合新的技术对其提取物进行进一步的分离纯化，从而达到更高的提取效率。2.1聚酰胺树脂吸附法聚酰胺树脂是一类富含酰胺基团的高分子化合物，故可与其他物质相互作用形成氢键而被吸附，同时与不能形成氢键的化合物进行分离[21]。为了进一步纯化银杏叶黄酮，Zhang等[22]采用聚酰胺树脂对银杏叶粗提物溶液进行吸附，黄酮含量从24.0%提高到了55.0%。张蕾，廖琼峰等采用聚酰胺树脂的方法提取苦参中的总黄酮[23]，这种方法可以有效地收集提取物中的总黄酮，且可与其生物碱类成分进行分离。该方法选择性较高，目的性较强，为大规模分离纯化黄酮化合物提供了一种潜在的途径。2.2大孔树脂吸附法此法是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂。大孔吸附树脂（Macroporousabsorptionresin）是依靠分子之间的相互作用力形成氢键，通过良好的大孔网状结构和巨大的比表面积进行物理吸附，最终达到分离的效果。Huang等[24]用X-5树脂分离纯化枇杷叶中的总黄酮，纯化后的黄酮纯度为82.20%，比纯化前提高了2.14倍，回收率为81.08%，并且大孔吸附树脂可以重复使用3次。具有使用周期长、选择性好、物理化学稳定性高、吸附容量大等优点，因此被广泛应用。2.3高速逆流色谱法高速逆流色谱法（High-speedcounter-currentchromatography，HSCCC）是一种基于不同分配系数的两种不溶性液体中化合物的纯化，从而实现的液-液分配色谱法，可以有效地从未经预处理的粗提取物中分离目标化合物，实现对复杂混合物中各组分的进行分离分析，分离纯化与制备同步完成[25]。高速逆流色谱法可分离的天然产物有黄酮、糖类、皂苷类、生物碱类、多酚类等，已有报道高速逆流色谱成功地从植物中分离出黄酮[26]。程丽英等[27]通过对比大孔吸附树脂和高速逆流色谱法分离白藜芦醇的得率，得出经前者分离纯化所得的白藜芦醇得率为0.21%；经后者分离所得的白藜芦醇的得率稍低，为0.186%。2.4高效毛细管电泳法近年来，随着科技的高速发展，高效毛细管电法（Highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE）已逐渐成为一种发展最快的新型分离分析方法之一，这是一种具有电泳和高度色谱技术的双重优点。李红[28]等通过大量的参考文献、有关资料中的实验数据以及大量的临床研究进行分析，证实了HPCE具有高灵敏度，高分辨率，分析速度快，所用溶剂和试样较少，应用范围较广等特点。由于目前我国的生产技术不是很发达，所以HPCE技术受到了很多限制，只能局限于小规模的研究。2.5高效液相色谱法高效液相色谱法（Highperformanceliduidchromatography，HPLC）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂（表面键合有固定相的载体）的色谱柱，最终达到分离的目的。因具有“四高一广”的特点，故又称“高速液相色谱”、“高压液相色谱”等。根据其固定相和流动相的极性不同，可分为正相高效色谱法和反向高效色谱法，前者主要依靠吸附原理进行分离；后者则主要依靠分配原理进行分离，更具有广泛的用途，一般用于低极性的苷元。张作军[29]应用反相高效色谱法研究黄芪中两种不同成分的苷的测定，发现两种成分的峰面积和进样量有较好的线性关系，回收率均在98%左右，且操作简单、速度快。2.6膜分离纯化技术膜分离技术（Membraneseparation，MS）是一项最新发展起来的高效分离技术，被认为是21世纪最有发展前景的高新技术之一。其原理是以选择性透过膜的渗透作用为分离媒介，在常温下借助以透过膜两侧不同的浓度差、电位差、压力差为推动力，从而对提取物进行分离、提纯不同分子量的物质[30]。在膜分离过程中操作简单、分离效率高、工艺简单、常温下操作、易于自动化、适用范围广等优点，适用于对温度敏感的物质的提取分离，尤其适用于植物如中草药提取液，随着各种新型膜材料的不断发展，可有效解决目前某些天然植物提取物在提取分离中应用传统工艺无法解决的质量差、收率低、膜选择困难且价格昂贵等问题。3总结与展望植物黄酮的提取方法有很多，通常对各种植物均适用，但往往需要根据提取物的性质、溶解度、分配系数以及溶剂的极性来选取较合适的提取方法。传统的提取方法因消耗大量溶剂等缺点而逐渐被超声波、微波和超临界CO2流体等不同外加物理电场的新型提取法所取代。植物黄酮的纯化一般是利用聚酰胺吸附、大孔树脂吸附等纯化方法，不但浪费有机溶剂，而且繁琐、耗时，还会导致黄酮的不可逆吸附；制备高速逆流色谱法分离速度快，纯度较精准，不会造成溶剂污染，是分离植物黄酮的较好选择。近年来，随着社会的不断发展，各方面的研究也越来越广泛与深入，逐步发现了许多新型的分离纯化方法，但现有的提纯方法操作简单但还不能同时满足无污染、效率高且可以广泛应用于实验室等问题，因此，仍需要探索简单且能够大量生产的提纯方法，为更好地开发黄酮类物质提供理论支持。

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