上中大中医实验学教案08细胞生物学研究方法

上海中医药大学《实验中医学》教案（6）课程名称实验中医学（理论部分） 总学时数36专业中医基础和中医临床专业 授课教师方肇勤内容细胞生物学研究方法及其在中医研究中的应用时数2本次课目的要求1．掌握细胞生物学的概念及内容。2．掌握细胞培养的概念，细胞培养技术的作用及其优点和局限性。3．了解细胞生物学研究的主要技术（包括细胞培养技术，形态学观察技术，细胞化学技术，细胞结构成分的离心分离技术和分析细胞学技术）。4．了解细胞生物学在中医药研究中的现状。5．了解中医的细胞培养研究范例。本次课的重点难点1．细胞生物学研究的主要技术。2．细胞生物学在中医药研究中的现状，经验和教训。3．中医的细胞培养研究范例的合理与不合理。本次课的应用教具多媒体设备。第五章细胞生物学研究方法及其在中医研究中的应用（2学时）通知：考试时间不变，请安排复习。一．一些基本的问题（课堂提问，要求2-4个同学回答）1．人、动物、细胞作为实验对象的异同？2．动物可不可以用来研究中医？动物不会讲话，无法交流；望闻问切困难，生物、生理上与人类有巨大区别。怎么办？有没有有利的地方，优越于人的？3．细胞可不可以用来研究中医？似乎还不如动物，连整体都没有了，如何用药、如何辨证、如何整体观？有没有有利的地方，优越于动物的？4．你如何选择细胞生物学来研究中医？能不能举一些例子？比如从某一项实验展开。回答可以用二仙汤为例，或肿瘤研究为例。二仙汤：1）有无作用；2）哪些组合、配伍、药物有效；3）药物的有效部位、成分、及其组合；4）被调控的组织、系统、器官；5）被调控的基因、基因组；6）整个调节链、网。用到不同的实验对象。二．离体和在体研究的利弊。解释“离体”和“在体”。细胞培养的优点1）因素单纯：培养细胞不受体内各种复杂因素的影响。2）实验条件易控：人为改变培养条件，即可观察细胞在单因素或多因素影响下的生理改变。3）重复性好：可避免种属及个体之间的差异。4）方法简便：便于使用各种技术方法观察研究活细胞的形态结构和生命活动。5）结果易于分析。6）经济：节约动物、药物。7）快速：可在较短时间内获得较多的实验样品和研究结果。8）便于应用人体组织。整体实验的优点1）保持了机体的完整性，神经、体液、脏腑、组织、药物代谢，等。2）符合临床用药。3）取材不受限制，创伤实验不受限制（不伤害人，或人不可以的实验）。4）数量满足方便。其他优点与细胞培养类似，即相对于人而言：5）实验条件易控：人为改变培养条件，即可观察细胞在单因素或多因素影响下的生理改变。6）重复性好：可避免种属及个体之间的差异（纯系动物）。7）方法简便：便于使用各种技术方法观察研究活细胞的形态结构和生命活动。8）结果易于分析。9）经济：节约药物和其他费用。10）实验周期较短。三．具体实验形式不是孤立的，是有密切联系的几种用途1．观测不同组织细胞的生物特性及其中医药调整作用2．观测不同肿瘤细胞，了解中医药对生物学特征，包括转移、分化、凋亡等影响3．细胞系，目的同上，而细胞稳定，而以上原代细胞的部分生物特性，可能会逐渐消失。4．工具，主要为细胞系，作为一种载体使用。比如研究基因的表达与调控，经常使用报道基因技术、哺乳类载体技术、基因转移技术，等（简单介绍）。四．细胞体外培养的一些基本理论和知识1．细胞周期（增殖态）G1+S+G2G1：细胞分裂后期，DNA合成前。S：DNA合成期，DNA增加一倍（拷贝）G2：介于S与M之间，时间短。M：细胞有丝分裂期。2．不同的称谓和意义名称原代培养细胞系阶段首次转化（指数生长期）连续细胞系（不死）有限细胞系（死亡）时间0~2周2~12周12周以上*50代，大约25~50周（6~12月）。3．讲义上引言部分介绍。五．细胞生物学研究的主要技术，介绍书上内容1．细胞培养技术1）细胞体外培养的一般条件（1）培养基（2）培养环境2）细胞培养的基本步骤原代细胞（从机体取出后直接培养的细胞）传代细胞（适合在体外培养条件下继续培养的细胞）。3）培养细胞的生长与观察2．形态学观察技术3．细胞化学技术1）酶细胞化学技术2）免疫细胞化学技术3）放射自显影技术4．细胞结构成分的离心分离技术5．分析细胞学技术1）流式细胞计（FCM）FCM（flowcytometer），又称荧光激活细胞分类仪（Fluorescenceactivatedcellsortor,FACS），流体喷射+激光+空气计数+γ射线能谱术+计算机+显微荧光光度计。方法：细胞分离、固定、染色、通过、检测、分析。可以分析单细胞和群体细胞。速度：5000个细胞/秒！2）显微分光光度计（MSP）MSP（microspectrophotometer，细胞光度计），光学显微镜+荧光显微镜+分光光度计。对细胞内的某些重要的生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试。3）激光共聚焦仪（interactivelasercytometer）建立于显微分光光度计与流式细胞计基础之上，研究单细胞水平的结构、功能、应