（正式版）DB37∕T 3087-2017 《猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术》

ICS65.020.30DB37/T3087—20172018-01-29实施2018-01-29实施IDB37/T3087—2017本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。DB37/T3087—2017猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫下列术语与定义适用于本标准。聚合酶链式反应。十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂5.1仪器设备5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。5.1.3电热恒温水槽。5.1.4稳流稳压电泳仪。5.1.5水平电泳槽。工2DB37/T3087—20175.1.6凝胶成像系统。5.1.7紫外透射反射分析仪。5.1.9烧杯(1000mL)。5.1.10电子天平精度为：0.001g。5.1.12组织匀浆器或研钵。5.1.142℃~8℃冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。5.2.210%SDS液(见附录A.2)。5.2.370%乙醇(见附录A.3)。5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。5.2.5DNAMarker2000。5.2.6超纯水：符合GB/T6682,三级。PRV-Fwd:5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3;PRV-Rev:5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3;扩增片段长度348bp。6操作程序6.1样品的采集和处理6.1.1样品的采集临床上猪的脑组织、淋巴结等，置于-20℃冰柜或液氮中保存。6.1.2样品的处理6.1.2.1取猪的脑组织、淋巴结等约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨。6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。6.2DNA的提取6.2.1取研磨液500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的SDS溶6.2.2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。6.2.3取上清于一新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。6.2.4取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000g离心15min。6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g离心15min,弃上清。6.2.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.2.7加入100μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。3DB37/T3087—2017表1PCR反应体系(50μL)序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，循环30次，72℃延伸10min结束。6.4.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。6.4.3加入分子量标准。6.4.4盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳，30min～40min。6.4.5用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。6.4.6用分子量标准比较判断PCR片段大7.1在阳性对照出现348bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立(参见附录A.5)。7.2被检样品出现348bp扩增带判定为伪狂犬病病毒gE基因阳性，未出现相应扩增带的样品判定为伪狂犬病病毒gE基因阴性(参见附录A.6)。4DB37/T3087—2017(规范性附录)试剂的配制试剂名称用量蛋白酶K灭菌双蒸水A.210%十二烷基硫酸钠(SDS溶液，pH7.2)试剂名称用量十二烷基硫酸钠灭菌双蒸水浓盐酸调pH至7.2灭菌双蒸水加至100mL试剂名称用量无水乙醇灭菌双蒸水试剂名称用量琼脂糖0.6g0.5×TBE缓冲液5DB37/T3087—20172