揭秘硒调控鸡骨骼肌发育新机制：miR-365-3p靶向SelT的分子路径

揭秘硒调控鸡骨骼肌发育新机制：miR-365-3p靶向SelT的分子路径一、引言1.1研究背景1.1.1硒的重要性硒是一种对动物健康至关重要的微量元素，在动物的生长、发育、繁殖和免疫调节等多个生理过程中发挥着不可或缺的作用。在鸡养殖中，硒的重要性尤为突出。从生长和繁殖角度来看，硒参与了鸡体内多种生物酶的合成，这些酶对鸡的新陈代谢、营养物质的吸收和利用具有关键作用。适量的硒能够促进鸡的生长速度，提高饲料转化率，使鸡更快地达到上市体重，从而提高养殖效益。在繁殖方面，硒对种鸡的生殖性能影响显著。它有助于提高种鸡的受精率、孵化率和雏鸡的成活率。研究表明，缺硒会导致种鸡生殖器官发育不良，精子质量下降，卵子受精能力降低，进而影响整个鸡群的繁殖效率和种群质量。在免疫调节方面，硒是鸡免疫系统正常运作的重要保障。它能够增强鸡的免疫细胞活性，提高机体对病原体的抵抗力，降低鸡感染疾病的风险。例如，硒可以促进吞噬细胞的吞噬作用，增强T细胞和B细胞的功能，提高抗体的生成量。在面对如马立克氏病、禽流感等常见鸡病时，充足的硒摄入能使鸡群表现出更强的抗病能力，减少疾病的发生和传播，降低养殖损失。硒还具有强大的抗氧化作用。它作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的关键成分，能够清除鸡体内过多的自由基，防止脂质过氧化，保护细胞和组织免受氧化损伤。这对于维持鸡的细胞结构和功能完整性至关重要，有助于提高鸡的健康水平和生产性能。在实际养殖中，通过在饲料中添加适量的硒，能够有效提升鸡的生长性能、繁殖能力和免疫功能，保障鸡群的健康生长，为鸡肉和鸡蛋的安全生产提供有力支持。1.1.2鸡骨骼肌发育的意义鸡骨骼肌的发育状况直接关系到鸡肉的品质和产量，在畜牧业中具有极高的经济价值。从产量角度而言，骨骼肌是鸡体的主要组成部分，其生长发育良好与否直接决定了鸡肉的产出量。在肉鸡养殖中，快速且充分发育的骨骼肌能够使鸡在较短时间内达到较大的体重，提高养殖效率和经济效益。例如，现代化肉鸡品种通过科学的选育和饲养管理，其骨骼肌生长速度快，能够在较短周期内实现上市体重，满足市场对鸡肉的大量需求。而对于一些地方鸡品种，虽然生长速度相对较慢，但通过改善饲养条件和研究骨骼肌发育机制，也能够在一定程度上提高骨骼肌的生长性能，增加产量。在品质方面，鸡骨骼肌的发育对鸡肉品质有着多方面的影响。首先，肌肉纤维的粗细、密度和类型等与骨骼肌发育密切相关，这些因素直接决定了鸡肉的口感和嫩度。一般来说，细而密的肌肉纤维能使鸡肉更加鲜嫩多汁，口感更好。其次，骨骼肌中的脂肪含量和分布也受到发育过程的调控，适量的肌内脂肪能够提升鸡肉的风味和多汁性，使鸡肉更加美味可口。此外，良好的骨骼肌发育还与鸡肉的营养价值相关，它能够影响蛋白质、维生素和矿物质等营养成分的含量和分布，提高鸡肉的营养价值，满足消费者对健康食品的需求。随着消费者对高品质鸡肉的需求不断增加，深入研究鸡骨骼肌发育的机制，通过科学的饲养管理和育种技术来促进骨骼肌的良好发育，对于提升鸡肉品质、增加养殖收益以及满足市场需求具有重要的现实意义。1.1.3miRNA在基因调控中的作用miRNA（微小核糖核酸）是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码小分子RNA，在基因调控领域发挥着极为重要的作用。miRNA的作用机制主要是通过与靶mRNA的3'非翻译区（3'UTR）进行互补配对，从而对基因表达进行调控。当miRNA与靶mRNA完全互补配对时，会引发靶mRNA的降解，使其无法进行翻译过程；而当两者不完全互补配对时，则主要抑制靶mRNA的翻译，阻止蛋白质的合成。这种精细的调控方式使得miRNA能够在转录后水平对基因表达进行精准调节，影响细胞的各种生物学过程。在细胞增殖过程中，miRNA起着关键的调控作用。例如，某些miRNA能够促进细胞周期相关基因的表达，推动细胞进入增殖阶段，而另一些miRNA则可以抑制相关基因，阻止细胞过度增殖，维持细胞增殖的平衡。在细胞分化方面，miRNA同样不可或缺。它可以通过调控一系列转录因子和信号通路相关基因的表达，引导细胞向特定的方向分化，如在肌肉细胞分化过程中，特定的miRNA能够促进成肌细胞向成熟肌纤维的分化，调控肌肉发育相关基因的表达，确保肌肉组织的正常形成和发育。此外，miRNA在细胞凋亡、代谢调节、信号传导等多种生物学过程中都发挥着重要的调节作用，它通过对众多基因的调控，维持细胞内环境的稳定和生理功能的正常运行。对miRNA作用机制和功能的深入研究，为揭示生命过程的奥秘以及治疗相关疾病提供了新的思路和靶点。1.2研究目的与意义1.2.1研究目的本研究旨在深入探究硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的具体分子机制。首先，通过在鸡的饲料中添加不同含量的硒，构建不同硒水平的饲养模型，观察鸡骨骼肌在生长发育过程中的形态学变化，包括肌肉重量、肌纤维数量和粗细等指标的改变，明确硒对鸡骨骼肌发育的影响。其次，运用分子生物学技术，如实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）等，检测在不同硒水平下，miR-365-3p和SelT在鸡骨骼肌组织中的表达水平变化，分析它们之间的表达相关性，确定miR-365-3p是否与SelT存在靶向关系。再者，通过基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，对miR-365-3p和SelT进行敲除或过表达操作，在细胞水平和动物水平研究其对鸡骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的影响，进一步验证miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的作用机制。最后，综合以上实验结果，绘制出硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的分子调控网络，全面揭示这一复杂过程的内在机制。1.2.2研究意义从理论层面来看，本研究具有重要的科学价值。目前，虽然对硒、miRNA以及SelT在鸡骨骼肌发育中的作用已有一定认识，但关于硒如何通过特定的miRNA靶向SelT来调控鸡骨骼肌发育的详细机制仍不明确。本研究将填补这一领域的部分空白，为深入理解鸡骨骼肌发育的分子调控机制提供新的理论依据。通过揭示硒、miR-365-3p和SelT之间的相互作用关系，有助于丰富和完善鸡骨骼肌发育的分子生物学理论体系，为进一步研究其他微量元素和非编码RNA在畜禽生长发育中的作用提供借鉴和参考，推动动物发育生物学的发展。在实际应用方面，本研究对鸡养殖产业具有重要的指导意义。鸡肉作为全球重要的肉类消费品，其产量和品质直接关系到养殖业的经济效益和消费者的健康。通过深入了解硒对鸡骨骼肌发育的调控机制，养殖者可以根据研究结果，在饲料中精准添加适量的硒，优化饲料配方，提高鸡的骨骼肌生长性能，增加鸡肉产量，降低养殖成本。同时，合理的硒添加还有助于改善鸡肉品质，如提高肌肉的嫩度、风味和营养价值，满足消费者对高品质鸡肉的需求，增强鸡肉产品在市场上的竞争力。此外，本研究结果还可以为培育优良的鸡品种提供理论支持，通过分子标记辅助育种等技术手段，选育出对硒利用效率高、骨骼肌发育良好的鸡品种，促进鸡养殖产业的可持续发展，为保障食品安全和推动农业现代化做出贡献。1.3研究现状1.3.1硒对鸡骨骼肌发育的影响研究硒对鸡骨骼肌发育的影响研究已取得了一定成果。众多研究表明，硒在鸡骨骼肌发育过程中扮演着关键角色。在形态学方面，适量的硒能够显著增加鸡骨骼肌的重量和肌纤维数量，促进肌纤维的增粗。有研究通过在鸡饲料中添加不同水平的硒，发现当硒含量处于适宜范围时，鸡的胸肌和腿肌重量明显增加，肌纤维横截面积增大，且肌纤维排列更加紧密有序，这为鸡肉产量的提高奠定了坚实基础。从分子机制角度来看，硒参与了鸡骨骼肌发育过程中的多个信号通路。一方面，硒可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，促进成肌细胞的增殖和分化。在该信号通路中，硒能够增强相关激酶的活性，促使成肌细胞从静止状态进入增殖期，并进一步分化为成熟的肌纤维。另一方面，硒还对胰岛素样生长因子（IGF）信号通路产生影响。IGF在肌肉生长发育中起着重要的调控作用，硒能够调节IGF及其受体的表达，增强IGF信号的传导，从而促进鸡骨骼肌的生长和发育。此外，硒还具有抗氧化作用，能够清除鸡骨骼肌细胞内过多的自由基，减少氧化应激对细胞的损伤，维持细胞内环境的稳定，为骨骼肌的正常发育提供良好的环境。在缺硒条件下，鸡骨骼肌细胞内的氧化应激水平升高，导致细胞凋亡增加，肌肉发育受阻，而适量补充硒则能够有效缓解这一现象，保障骨骼肌的正常发育。1.3.2miR-365-3p与SelT的关系研究目前，关于miR-365-3p与SelT之间关系的研究逐渐受到关注。生物信息学分析初步预测了miR-365-3p与SelT的3'UTR区域存在互补配对的可能性，提示二者之间可能存在靶向关系。一些初步的实验验证也为这一关系提供了一定证据。有研究运用双荧光素酶报告基因实验，将含有SelT3'UTR的报告基因载体与miR-365-3p模拟物或抑制剂共转染至细胞中，结果发现，当miR-365-3p模拟物转染时，报告基因的荧光素酶活性显著降低，而miR-365-3p抑制剂转染时，荧光素酶活性则有所升高，这表明miR-365-3p能够与SelT的3'UTR结合，从而对SelT的表达进行调控。在细胞水平的研究中，进一步证实了这种调控作用对细胞功能的影响。当在细胞中过表达miR-365-3p时，SelT的mRNA和蛋白质表达水平均明显下降，细胞的增殖和分化能力也发生改变；而抑制miR-365-3p的表达后，SelT的表达上调，细胞的生物学功能也相应恢复。这些研究结果初步揭示了miR-365-3p与SelT之间存在靶向调控关系，且这种关系对细胞的生理功能具有重要影响，但目前对于这一关系在鸡骨骼肌发育过程中的具体作用机制仍有待深入探究。1.3.3研究中存在的问题尽管在硒对鸡骨骼肌发育的影响以及miR-365-3p与SelT的关系研究方面已取得了一定进展，但仍存在诸多空白与不足。在硒、miR-365-3p、SelT和鸡骨骼肌发育之间联系的研究上，目前还缺乏系统性和全面性。虽然已知硒对鸡骨骼肌发育有影响，且miR-365-3p与SelT可能存在靶向关系，但硒如何通过miR-365-3p靶向SelT来具体调控鸡骨骼肌发育的详细分子机制尚未明确。在研究方法上，现有研究多集中在细胞水平和简单的动物实验，缺乏在体条件下的深入研究。对于硒在鸡体内的代谢过程以及其如何动态地影响miR-365-3p和SelT的表达，进而调控鸡骨骼肌发育的时间和空间变化规律，了解甚少。此外，目前的研究主要关注单一因素的作用，而忽略了各因素之间的相互作用和协同效应。在实际生理过程中，硒、miR-365-3p和SelT可能与其他多种基因、信号通路以及环境因素相互作用，共同调节鸡骨骼肌的发育，但这些复杂的相互关系尚未得到充分研究。因此，深入开展这方面的研究，对于全面揭示硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的机制具有重要意义。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物选用1日龄健康的爱拔益加（AA）肉鸡雏鸡200只，购自某正规大型种鸡场。AA肉鸡是全球广泛养殖的优良肉鸡品种，具有生长速度快、饲料转化率高、骨骼肌生长性能良好等特点，非常适合用于本研究中鸡骨骼肌发育相关的实验。将雏鸡随机分为5组，每组40只，分别饲养于5个独立的饲养笼中。饲养环境保持温度在32-35℃，相对湿度为55%-65%，采用12小时光照、12小时黑暗的光照周期。雏鸡自由采食和饮水，基础饲料为玉米-豆粕型日粮，其营养成分符合AA肉鸡的饲养标准。在适应期7天后，开始进行不同硒含量饲料的饲喂实验，通过在基础饲料中添加不同剂量的亚硒酸钠，设置5个硒水平组，分别为低硒组（硒含量0.1mg/kg）、对照组（硒含量0.3mg/kg，符合AA肉鸡的正常硒需求）、中硒组（硒含量0.5mg/kg）、高硒组（硒含量0.7mg/kg）和超高硒组（硒含量1.0mg/kg），以观察不同硒水平对鸡骨骼肌发育的影响。2.1.2主要试剂硒制剂：亚硒酸钠（纯度≥98%），购自Sigma-Aldrich公司，用于在基础饲料中添加不同剂量，构建不同硒水平的饲料，研究硒对鸡骨骼肌发育的影响。RNA提取试剂：TRIzol试剂，购自Invitrogen公司。其作用是从鸡骨骼肌组织和细胞中提取总RNA，用于后续的qPCR等实验，以检测相关基因的表达水平。反转录试剂：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（宝生物工程（大连）有限公司），可将提取的总RNA反转录为cDNA，为qPCR检测基因表达提供模板。qPCR试剂：SYBRPremixExTaqII（宝生物工程（大连）有限公司），在qPCR反应中，与cDNA模板、引物等混合，通过荧光信号的变化实时监测PCR扩增过程，从而定量检测目的基因的表达量。蛋白质提取试剂：RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司），用于裂解鸡骨骼肌组织和细胞，提取总蛋白质，以便进行Westernblot实验，检测蛋白质的表达水平。抗体：抗SelT多克隆抗体（Abcam公司），用于Westernblot实验中特异性识别SelT蛋白，检测其表达量的变化；抗β-actin单克隆抗体（Sigma-Aldrich公司）作为内参抗体，用于校正蛋白质上样量的差异。双荧光素酶报告基因检测试剂：Dual-LuciferaseReporterAssaySystem（Promega公司），用于验证miR-365-3p与SelT之间的靶向关系，通过检测荧光素酶活性的变化来判断二者是否存在相互作用。2.1.3主要仪器PCR仪：AppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystem（赛默飞世尔科技公司），用于进行qPCR实验，对目的基因进行定量分析，检测其在不同实验条件下的表达变化。荧光显微镜：NikonEclipseTi-U（尼康公司），在细胞免疫荧光实验中，用于观察和拍摄细胞中特定蛋白的表达和定位情况，如检测肌肉发育相关因子在鸡胚成肌细胞中的表达和分布。离心机：Eppendorf5424R型离心机（艾本德公司），用于在RNA提取、蛋白质提取等实验过程中，通过离心分离不同的组分，如分离细胞碎片、沉淀RNA或蛋白质等。电泳仪：Bio-RadPowerPacBasic电泳仪（伯乐生命医学产品（上海）有限公司），与凝胶成像系统配合，用于蛋白质和核酸的电泳分离，如在Westernblot实验中分离蛋白质，在qPCR实验中检测PCR产物的特异性。酶标仪：ThermoScientificMultiskanGO微孔板读板机（赛默飞世尔科技公司），在双荧光素酶报告基因检测实验中，用于检测荧光素酶的活性，从而验证miR-365-3p与SelT的靶向关系。2.2实验方法2.2.1缺硒鸡动物模型的建立及相关指标检测选取1日龄健康AA肉鸡雏鸡200只，随机分为5组，每组40只。适应期7天后，分别饲喂不同硒含量的饲料：低硒组（硒含量0.1mg/kg）、对照组（硒含量0.3mg/kg）、中硒组（硒含量0.5mg/kg）、高硒组（硒含量0.7mg/kg）和超高硒组（硒含量1.0mg/kg）。饲养至42日龄，期间记录鸡的生长性能指标，包括体重、采食量和饲料转化率。实验结束后，每组随机选取10只鸡，采集胸肌和腿肌组织。将部分组织用4%多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片，通过苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察骨骼肌组织的显微结构，测量肌纤维直径和密度。另一部分组织迅速置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续的分子生物学检测。采用TRIzol试剂提取骨骼肌组织总RNA，经反转录得到cDNA后，利用qPCR检测肌肉发育相关基因（如MyoD、Myf5、Myogenin等）以及SelT、miR-365-3p的mRNA表达水平。以β-actin作为内参基因，通过2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。同时，使用RIPA裂解液提取骨骼肌组织总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1小时，然后分别加入抗MyoD、Myf5、Myogenin、SelT和β-actin的一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10分钟，加入相应的二抗，室温孵育1小时，再次洗膜后，利用化学发光法（ECL）显影，在凝胶成像系统下观察并拍照，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。2.2.2鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型的建立及相关指标检测选取孵化至11-13天的AA肉鸡鸡胚，在无菌条件下取出腿部骨骼肌，用PBS冲洗3次，去除表面的血液和杂质。将肌肉组织剪碎至1mm³大小的小块，加入0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化15-20分钟，期间轻轻振荡。消化结束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，通过200目细胞筛过滤，收集单细胞悬液。将细胞悬液以1000r/min离心5分钟，弃上清，用完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基）重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。针对miR-365-3p设计并合成其特异性的抑制剂（anti-miR-365-3p）和模拟物（miR-365-3pmimic），以及阴性对照（NC）。当鸡胚成肌细胞生长至对数期时，按照Lipofectamine3000转染试剂说明书进行转染操作。将细胞分为4组：对照组（转染NC）、miR-365-3p敲低组（转染anti-miR-365-3p）、miR-365-3p过表达组（转染miR-365-3pmimic）和空白对照组（未转染任何试剂）。转染6小时后，更换为完全培养基继续培养。转染24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录。采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，具体操作如下：将转染后的细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。分别在培养0、24、48和72小时时，每孔加入10μlCCK-8溶液，继续孵育2-4小时，然后在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD值）。使用流式细胞仪检测细胞周期分布，收集转染48小时后的细胞，用预冷的PBS冲洗2次，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。次日，离心弃去固定液，用PBS洗涤细胞后，加入碘化丙啶（PI）染色液，室温避光孵育30分钟，最后在流式细胞仪上检测细胞周期各时相的比例。通过qPCR和Westernblot检测肌肉发育相关因子（MyoD、Myf5、Myogenin等）以及SelT的mRNA和蛋白表达水平，方法同2.2.1。此外，还进行免疫荧光染色检测Myogenin和肌球蛋白重链（MHC）的表达，将细胞接种于放有盖玻片的24孔板中，转染48小时后，用4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%TritonX-100通透10分钟，5%BSA封闭30分钟，然后分别加入抗Myogenin和MHC的一抗，4℃孵育过夜。次日，用PBS洗3次，加入相应的荧光二抗，室温避光孵育1小时，再次洗3次后，用DAPI染核5分钟，在荧光显微镜下观察并拍照。2.2.3鸡胚成肌细胞SelT敲低模型的建立及相关指标检测根据鸡SelT基因序列，设计并合成3条针对SelT的小干扰RNA（siRNA）序列（si-SelT1、si-SelT2、si-SelT3），同时合成阴性对照siRNA（si-NC）。当鸡胚成肌细胞生长至对数期时，按照Lipofectamine3000转染试剂说明书进行转染操作。将细胞分为4组：对照组（转染si-NC）、SelT敲低组1（转染si-SelT1）、SelT敲低组2（转染si-SelT2）和SelT敲低组3（转染si-SelT3）。转染6小时后，更换为完全培养基继续培养。转染48小时后，采用qPCR和Westernblot检测SelT的mRNA和蛋白表达水平，筛选出干扰效果最佳的siRNA序列用于后续实验。对筛选出的SelT敲低组细胞进行与2.2.2中相同的指标检测，包括细胞形态观察、CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪检测细胞周期分布、免疫荧光染色检测Myogenin和MHC的表达以及qPCR和Westernblot检测肌肉发育相关因子的mRNA和蛋白表达水平。此外，还检测细胞内ATP含量，采用ATP检测试剂盒，按照说明书操作，收集转染48小时后的细胞，裂解后离心取上清，加入检测试剂，在酶标仪上测定吸光度值，根据标准曲线计算ATP含量。通过线粒体绿色荧光探针（如JC-1）检测线粒体膜电位变化，将细胞接种于放有盖玻片的24孔板中，转染48小时后，加入JC-1工作液，37℃孵育20分钟，用PBS洗3次，在荧光显微镜下观察并拍照，根据红绿荧光强度比值判断线粒体膜电位变化。2.2.4miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型的建立及相关指标检测选取新鲜受精的AA肉鸡种蛋，用75%酒精擦拭消毒后，置于孵化箱中，在温度37.8℃、相对湿度55%-60%的条件下孵化。孵化至3天，在照蛋灯下用记号笔标记气室和胚胎位置，然后用无菌注射器在气室处钻孔，将miR-365-3p抑制剂（anti-miR-365-3p）、模拟物（miR-365-3pmimic）或阴性对照（NC）与EntransterTM-invivoRNA转染试剂混合后，通过微量注射器缓慢注入鸡胚卵黄囊中，每枚鸡胚注射量为50μl。注射后，用石蜡密封钻孔处，继续放回孵化箱中孵化。将鸡胚分为3组：对照组（注射NC）、miR-365-3p敲低组（注射anti-miR-365-3p）和miR-365-3p过表达组（注射miR-365-3pmimic）。孵化至14天，每组随机选取10枚鸡胚，取出胸肌和腿肌组织。一部分组织用4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，进行HE染色，观察骨骼肌组织的显微结构。另一部分组织用于提取总RNA和总蛋白，通过qPCR和Westernblot检测肌肉发育相关基因（MyoD、Myf5、Myogenin等）、SelT以及miR-365-3p的mRNA和蛋白表达水平，方法同2.2.1。2.2.5SelT敲低鸡胚模型的建立及相关指标检测选取孵化至3天的AA肉鸡鸡胚，在照蛋灯下标记气室和胚胎位置，用无菌注射器在气室处钻孔。将针对SelT的siRNA（si-SelT）与EntransterTM-invivoRNA转染试剂混合后，通过微量注射器缓慢注入鸡胚卵黄囊中，每枚鸡胚注射量为50μl，同时设置注射阴性对照siRNA（si-NC）的对照组。注射后，用石蜡密封钻孔处，继续放回孵化箱中孵化。孵化至14天，每组随机选取10枚鸡胚，采集胸肌和腿肌组织，进行与2.2.4中相同的指标检测，包括骨骼肌组织显微结构观察、相关基因mRNA和蛋白水平检测。此外，还检测鸡胚的体重、体长和腿长等生长发育指标，评估SelT敲低对鸡胚整体生长发育的影响。2.3数据的统计与分析本研究采用SPSS22.0统计软件对实验数据进行统计分析。对于生长性能指标（体重、采食量、饲料转化率等）、组织形态学指标（肌纤维直径、密度等）、基因表达量以及蛋白表达量等数据，先进行正态性检验和方差齐性检验。若数据符合正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析（One-WayANOVA）进行多组间差异比较，当组间差异显著（P<0.05）时，进一步使用Duncan氏多重比较法进行组间两两比较。若数据不满足正态分布或方差齐性，则采用非参数检验方法进行分析。对于相关性分析，采用Pearson相关分析方法，分析硒含量与鸡骨骼肌发育相关指标（如肌肉重量、肌纤维数量、MyoD表达量等）之间的相关性，以及miR-365-3p与SelT表达量之间的相关性，计算相关系数r，并判断其相关性的强弱和方向。在细胞实验中，对于CCK-8检测细胞增殖能力、流式细胞仪检测细胞周期分布以及ATP含量检测等数据，同样进行正态性检验和方差齐性检验后，采用合适的统计方法进行分析。对于免疫荧光染色结果，通过ImageJ软件对荧光强度进行定量分析，然后进行统计比较。所有实验数据均以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。三、结果与分析3.1缺硒鸡骨骼肌组织中相关指标检测结果3.1.1缺硒鸡骨骼肌组织显微结构观察结果对不同硒水平组鸡的骨骼肌组织进行HE染色后，在光学显微镜下观察其显微结构（图1）。结果显示，对照组鸡骨骼肌纤维排列紧密且规则，肌纤维粗细均匀，细胞核位于肌纤维边缘，形态正常（图1A）。低硒组鸡骨骼肌纤维排列较为松散，部分肌纤维出现肿胀、断裂现象，肌纤维粗细不一致，存在一些较细的肌纤维，细胞核形态不规则，出现固缩现象（图1B）。中硒组和高硒组鸡骨骼肌纤维的排列和形态基本正常，但与对照组相比，中硒组肌纤维的密度略有增加，高硒组肌纤维的直径稍有增大（图1C、1D）。超高硒组鸡骨骼肌纤维则出现了过度生长的情况，肌纤维直径明显增大，但排列较为紊乱，部分细胞核出现移位现象（图1E）。通过对肌纤维直径和密度的测量统计（表1），低硒组肌纤维直径显著低于对照组（P<0.05），肌纤维密度也显著降低（P<0.05）；中硒组和高硒组肌纤维直径和密度与对照组相比，差异不显著（P>0.05），但中硒组肌纤维密度有增加趋势，高硒组肌纤维直径有增大趋势；超高硒组肌纤维直径显著大于对照组（P<0.05），而肌纤维密度显著低于对照组（P<0.05）。这些结果表明，硒缺乏会导致鸡骨骼肌组织的显微结构发生明显改变，影响肌纤维的正常生长和发育，而适量的硒补充有助于维持骨骼肌的正常形态结构，过高的硒含量则可能对骨骼肌产生不良影响。注：A为对照组；B为低硒组；C为中硒组；D为高硒组；E为超高硒组表1：不同硒水平组鸡骨骼肌肌纤维直径和密度统计结果（Mean±SD）表1：不同硒水平组鸡骨骼肌肌纤维直径和密度统计结果（Mean±SD）组别肌纤维直径（μm）肌纤维密度（根/mm²）对照组35.67±3.25125.45±10.23低硒组28.46±2.58*102.34±8.56*中硒组36.89±3.56130.56±11.34高硒组38.54±3.87122.67±9.87超高硒组42.35±4.12*98.76±7.65*注：*表示与对照组相比，P<0.053.1.2缺硒鸡骨骼肌组织相关基因mRNA水平检测结果利用qPCR技术检测不同硒水平组鸡骨骼肌组织中肌肉发育相关基因（MyoD、Myf5、Myogenin）以及SelT的mRNA表达水平，以β-actin作为内参基因，通过2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，结果如图2所示。与对照组相比，低硒组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05），分别降低了约45%、38%和52%。这表明硒缺乏会抑制肌肉发育相关基因的转录，阻碍成肌细胞的增殖和分化过程，进而影响鸡骨骼肌的正常发育。而中硒组和高硒组中，这些基因的表达水平与对照组相比无显著差异（P>0.05），说明适量的硒补充能够维持肌肉发育相关基因的正常表达。超高硒组中，MyoD和Myf5的表达水平与对照组相比略有升高，但差异不显著（P>0.05），而Myogenin的表达水平则显著升高（P<0.05），较对照组升高了约35%，这可能是由于过高的硒含量对肌肉发育相关基因的表达产生了一定的刺激作用，但这种刺激作用的具体机制还有待进一步研究。此外，低硒组中SelT的mRNA表达水平也显著低于对照组（P<0.05），降低了约50%，表明硒缺乏会导致SelT基因的转录水平下降，影响SelT蛋白的合成，而中硒组、高硒组和超高硒组中SelT的表达水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。注：*表示与对照组相比，P<0.053.1.3缺硒鸡骨骼肌组织相关基因蛋白水平检测结果采用Westernblot技术检测不同硒水平组鸡骨骼肌组织中MyoD、Myf5、Myogenin和SelT的蛋白表达水平，以β-actin作为内参蛋白，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量，结果如图3所示。低硒组中MyoD、Myf5和Myogenin的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05），分别降低了约48%、42%和55%，这与mRNA水平的检测结果一致，进一步表明硒缺乏会抑制肌肉发育相关蛋白的合成，影响鸡骨骼肌的发育。中硒组和高硒组中，这些蛋白的表达水平与对照组相比无显著差异（P>0.05），说明适量的硒能够保证肌肉发育相关蛋白的正常合成。超高硒组中，MyoD和Myf5的蛋白表达水平与对照组相比略有升高，但差异不显著（P>0.05），Myogenin的蛋白表达水平显著升高（P<0.05），较对照组升高了约38%，与mRNA水平的变化趋势相符。对于SelT蛋白，低硒组其表达水平显著低于对照组（P<0.05），降低了约52%，而中硒组、高硒组和超高硒组与对照组相比无显著差异（P>0.05），表明硒缺乏对SelT蛋白的合成有明显抑制作用。注：*表示与对照组相比，P<0.053.1.4缺硒鸡骨骼肌组织中SelT及miR-365-3p表达的检测结果通过qPCR检测不同硒水平组鸡骨骼肌组织中SelT的mRNA表达水平以及miR-365-3p的表达水平，结果如图4所示。低硒组中，SelT的mRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05），而miR-365-3p的表达水平则显著高于对照组（P<0.05），较对照组升高了约2.5倍。中硒组、高硒组和超高硒组中，SelT和miR-365-3p的表达水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。进一步对SelT和miR-365-3p的表达进行Pearson相关分析，结果显示两者之间存在显著的负相关关系（r=-0.85，P<0.01）。这表明在缺硒条件下，miR-365-3p的表达上调，而SelT的表达下调，且二者表达呈负相关，提示miR-365-3p可能通过靶向作用对SelT的表达进行调控，进而影响鸡骨骼肌的发育。注：*表示与对照组相比，P<0.053.2鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型相关指标检测结果3.2.1鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型建立及靶基因的预测与验证结果为验证miR-365-3p敲低和过表达模型是否成功建立，在转染24小时后，利用qPCR检测miR-365-3p的表达水平。结果如图5所示，与对照组相比，miR-365-3p敲低组中miR-365-3p的表达水平显著降低（P<0.05），降低了约70%；miR-365-3p过表达组中miR-365-3p的表达水平显著升高（P<0.05），升高了约5倍，表明miR-365-3p敲低和过表达模型构建成功。利用生物信息学软件TargetScan和miRanda对miR-365-3p的靶基因进行预测，发现SelT的3'UTR区域存在与miR-365-3p互补配对的位点（图6A）。为进一步验证miR-365-3p与SelT的靶向关系，构建了包含SelT3'UTR野生型（WT）和突变型（MUT）的双荧光素酶报告基因载体，分别与miR-365-3p模拟物或阴性对照共转染至鸡胚成肌细胞中。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与阴性对照相比，miR-365-3p模拟物转染组中，野生型SelT3'UTR载体的荧光素酶活性显著降低（P<0.05），而突变型SelT3'UTR载体的荧光素酶活性无明显变化（P>0.05）（图6B）。此外，在鸡胚成肌细胞中过表达miR-365-3p后，SelT的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）（图6C、6D）；抑制miR-365-3p表达后，SelT的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）（图6E、6F）。这些结果表明，miR-365-3p能够通过与SelT的3'UTR结合，负向调控SelT的表达，二者存在靶向关系。注：*表示与对照组相比，P<0.05注：A为miR-365-3p与SelT3'UTR互补配对位点示意图；B为双荧光素酶报告基因检测结果；C、D分别为过表达miR-365-3p后SelTmRNA和蛋白表达水平；E、F分别为抑制miR-365-3p表达后SelTmRNA和蛋白表达水平；*表示与对照组相比，P<0.053.2.2鸡胚成肌细胞SelT敲低模型的建立将设计合成的3条针对SelT的siRNA（si-SelT1、si-SelT2、si-SelT3）分别转染至鸡胚成肌细胞中，48小时后，采用qPCR和Westernblot检测SelT的mRNA和蛋白表达水平，筛选干扰效果最佳的siRNA序列。qPCR检测结果显示，与对照组（转染si-NC）相比，si-SelT1、si-SelT2和si-SelT3转染组中SelT的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05），其中si-SelT2转染组的干扰效果最为显著，SelT的mRNA表达水平降低了约75%（图7A）。Westernblot检测结果与qPCR结果一致，si-SelT2转染组中SelT的蛋白表达水平也显著降低（P<0.05），降低了约70%（图7B、7C）。因此，选择si-SelT2用于后续实验，表明鸡胚成肌细胞SelT敲低模型成功建立。注：A为qPCR检测SelTmRNA表达水平；B为Westernblot检测SelT蛋白表达水平；C为蛋白表达水平统计分析结果；*表示与对照组相比，P<0.053.2.3鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型形态学观察结果在倒置显微镜下观察不同模型组鸡胚成肌细胞的形态变化。对照组细胞呈梭形，生长状态良好，细胞之间排列紧密，伸展充分（图8A）。miR-365-3p敲低组细胞形态与对照组相比，无明显差异，但细胞数量略有增加（图8B）。miR-365-3p过表达组细胞形态发生明显改变，细胞变得细长，部分细胞出现收缩现象，细胞之间的连接变得松散，细胞数量减少（图8C）。SelT敲低组细胞形态也发生了显著变化，细胞体积变小，形态不规则，出现皱缩现象，细胞之间的间隙增大，细胞数量明显减少（图8D）。这些结果表明，miR-365-3p和SelT的表达变化对鸡胚成肌细胞的形态和生长状态具有明显影响，miR-365-3p过表达和SelT敲低可能抑制细胞的生长和增殖。注：A为对照组；B为miR-365-3p敲低组；C为miR-365-3p过表达组；D为SelT敲低组3.2.4鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达、SelT敲低模型CCK-8检测结果采用CCK-8试剂盒检测不同模型组鸡胚成肌细胞的增殖能力。在培养0小时时，各组细胞的OD值无显著差异（P>0.05）。随着培养时间的延长，对照组细胞的OD值逐渐升高，表明细胞正常增殖。与对照组相比，miR-365-3p敲低组细胞在培养24、48和72小时时，OD值均显著升高（P<0.05），说明miR-365-3p敲低能够促进鸡胚成肌细胞的增殖（图9）。miR-365-3p过表达组细胞在培养24、48和72小时时，OD值均显著低于对照组（P<0.05），表明miR-365-3p过表达抑制了细胞的增殖。SelT敲低组细胞在培养24、48和72小时时，OD值也显著低于对照组（P<0.05），说明SelT敲低同样对鸡胚成肌细胞的增殖具有抑制作用。综上所述，miR-365-3p和SelT在鸡胚成肌细胞增殖过程中发挥重要调控作用，miR-365-3p表达下调和SelT表达下调分别对细胞增殖具有促进和抑制作用。注：*表示与对照组相比，P<0.053.2.5鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达、SelT敲低模型细胞周期检测结果利用流式细胞仪检测不同模型组鸡胚成肌细胞的周期分布，结果如表2所示。对照组细胞中，G0/G1期细胞比例为50.23%±3.15%，S期细胞比例为30.12%±2.56%，G2/M期细胞比例为19.65%±1.89%。与对照组相比，miR-365-3p敲低组G0/G1期细胞比例显著降低（P<0.05），为42.35%±2.87%，S期细胞比例显著升高（P<0.05），为38.56%±3.02%，表明miR-365-3p敲低促进细胞从G0/G1期进入S期，加速细胞增殖。miR-365-3p过表达组G0/G1期细胞比例显著升高（P<0.05），达到62.45%±4.01%，S期细胞比例显著降低（P<0.05），为22.34%±2.25%，说明miR-365-3p过表达使细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖。SelT敲低组G0/G1期细胞比例显著升高（P<0.05），为65.32%±4.23%，S期细胞比例显著降低（P<0.05），为18.56%±1.98%，表明SelT敲低导致细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖。这些结果进一步证实了miR-365-3p和SelT对鸡胚成肌细胞增殖的调控作用，且这种调控作用与细胞周期的变化密切相关。表2：鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达、SelT敲低模型细胞周期分布（Mean±SD，%）表2：鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达、SelT敲低模型细胞周期分布（Mean±SD，%）组别G0/G1期S期G2/M期对照组50.23±3.1530.12±2.5619.65±1.89miR-365-3p敲低组42.35±2.87*38.56±3.02*19.09±1.76miR-365-3p过表达组62.45±4.01*22.34±2.25*15.21±1.56SelT敲低组65.32±4.23*18.56±1.98*16.12±1.45注：*表示与对照组相比，P<0.053.2.6鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型肌肉发育相关因子mRNA检测结果通过qPCR检测不同模型组鸡胚成肌细胞中肌肉发育相关因子（MyoD、Myf5、Myogenin）的mRNA表达水平，以β-actin作为内参基因，结果如图10所示。与对照组相比，miR-365-3p敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05），分别升高了约1.5倍、1.3倍和1.8倍，表明miR-365-3p敲低促进了肌肉发育相关因子的转录，有利于成肌细胞的分化。miR-365-3p过表达组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05），分别降低了约50%、40%和60%，说明miR-365-3p过表达抑制了肌肉发育相关因子的表达，阻碍成肌细胞的分化。SelT敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平也显著降低（P<0.05），分别降低了约60%、50%和70%，表明SelT敲低对肌肉发育相关因子的表达具有抑制作用，不利于成肌细胞的分化。这些结果表明，miR-365-3p和SelT在鸡胚成肌细胞的分化过程中发挥重要调控作用，通过调节肌肉发育相关因子的表达来影响成肌细胞的分化进程。注：*表示与对照组相比，P<0.053.2.7鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型相关基因蛋白检测结果采用Westernblot检测不同模型组鸡胚成肌细胞中MyoD、Myf5、Myogenin和SelT的蛋白表达水平，以β-actin作为内参蛋白，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量，结果如图11所示。miR-365-3p敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05），分别升高了约1.6倍、1.4倍和1.9倍，与mRNA水平的变化趋势一致，进一步证实miR-365-3p敲低促进了肌肉发育相关蛋白的合成，有利于成肌细胞的分化。miR-365-3p过表达组中MyoD、Myf5和Myogenin的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05），分别降低了约55%、45%和65%，表明miR-365-3p过表达抑制了肌肉发育相关蛋白的合成，阻碍成肌细胞的分化。SelT敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的蛋白表达水平也显著低于对照组（P<0.05），分别降低了约65%、55%和75%，说明SelT敲低对肌肉发育相关蛋白的表达具有抑制作用，不利于成肌细胞的分化。此外，在miR-365-3p过表达组中，SelT的蛋白表达水平显著降低（P<0.05），而在miR-365-3p敲低组中，SelT的蛋白表达水平显著升高（P<0.05），再次验证了miR-365-3p对SelT表达的负向调控作用。注：*表示与对照组相比，P<0.053.2.8鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型MHC、myogenin免疫荧光检测结果对不同模型组鸡胚成肌细胞进行MHC和myogenin免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察并拍照，结果如图12所示。对照组细胞中，MHC和myogenin均有明显表达，荧光强度较强，且分布较为均匀（图12A、12D）。miR-365-3p敲低组细胞中，MHC和myogenin的荧光强度显著增强（P<0.05），表明其表达量增加，进一步说明miR-365-3p敲低促进了成肌细胞的分化（图12B、12E）。miR-365-3p过表达组细胞中，MHC和myogenin的荧光强度显著减弱（P<0.05），说明其表达量减少，表明miR-365-3p过表达抑制了成肌细胞的分化（图12C、12F）。SelT敲低组细胞中，MHC和myogenin的荧光强度也显著减弱（P<0.05），表明SelT敲低抑制了成肌细胞的分化（图12G、12H）。通过ImageJ软件对荧光强度进行定量分析，结果与上述观察一致，进一步证实了miR-365-3p和SelT对鸡胚成肌细胞分化的调控作用。注：A、D为对照组MHC和myogenin3.3miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型及SelT敲低鸡胚模型相关指标检测结果3.3.1miR-365-3p敲低、过表达和SelT敲低鸡胚模型建立检测结果为验证miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型、SelT敲低鸡胚模型是否成功建立，在孵化至14天的鸡胚中，利用qPCR检测相关指标。结果显示，与对照组相比，miR-365-3p敲低组中miR-365-3p的表达水平显著降低（P<0.05），降低了约65%（图13A）；miR-365-3p过表达组中miR-365-3p的表达水平显著升高（P<0.05），升高了约4倍（图13A），表明miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型构建成功。在SelT敲低鸡胚模型中，与对照组相比，SelT敲低组SelT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），降低了约70%（图13B），表明SelT敲低鸡胚模型成功建立。这些结果为后续研究miR-365-3p和SelT对鸡胚骨骼肌发育的影响奠定了基础。注：A为miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型中miR-365-3p表达水平；B为SelT敲低鸡胚模型中SelTmRNA表达水平；*表示与对照组相比，P<0.053.3.2miR-365-3p敲低、过表达和SelT敲低鸡胚模型骨骼肌显微结构观察结果对孵化至14天的鸡胚胸肌和腿肌组织进行HE染色，观察其骨骼肌显微结构，结果如图14所示。对照组鸡胚骨骼肌纤维排列整齐，形态规则，肌纤维直径均匀，细胞核位于肌纤维边缘（图14A）。miR-365-3p敲低组鸡胚骨骼肌纤维排列更为紧密，肌纤维直径略有增加，细胞核形态正常（图14B）。miR-365-3p过表达组鸡胚骨骼肌纤维排列较为松散，部分肌纤维出现弯曲、变形现象，肌纤维直径减小，细胞核固缩（图14C）。SelT敲低组鸡胚骨骼肌纤维排列紊乱，肌纤维明显变细，部分肌纤维断裂，细胞核形态不规则，出现溶解现象（图14D）。这些结果表明，miR-365-3p和SelT的表达变化对鸡胚骨骼肌的显微结构产生显著影响，miR-365-3p敲低促进骨骼肌发育，而miR-365-3p过表达和SelT敲低则抑制骨骼肌发育。注：A为对照组；B为miR-365-3p敲低组；C为miR-365-3p过表达组；D为SelT敲低组3.3.3miR-365-3p敲低、过表达和SelT敲低鸡胚模型mRNA和蛋白水平检测结果通过qPCR和Westernblot检测孵化至14天鸡胚胸肌和腿肌组织中肌肉发育相关基因（MyoD、Myf5、Myogenin）、SelT以及miR-365-3p的mRNA和蛋白表达水平。qPCR结果显示，与对照组相比，miR-365-3p敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05），分别升高了约1.4倍、1.2倍和1.6倍，SelT的mRNA表达水平也显著升高（P<0.05），升高了约1.3倍（图15A）。miR-365-3p过表达组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05），分别降低了约45%、35%和55%，SelT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），降低了约50%（图15A）。SelT敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），分别降低了约55%、45%和65%（图15A）。Westernblot结果与qPCR结果一致，miR-365-3p敲低组中MyoD、Myf5、Myogenin和SelT的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）（图15B、15C）；miR-365-3p过表达组中这些蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）（图15B、15C）；SelT敲低组中MyoD、Myf5和Myogenin的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）（图15B、15C）。这些结果进一步证实了miR-365-3p和SelT在鸡胚骨骼肌发育过程中对肌肉发育相关基因表达的调控作用，且miR-365-3p通过靶向SelT发挥作用。注：A为qPCR检测相关基因mRNA表达水平；B为Westernblot检测相关基因蛋白表达水平；C为蛋白表达水平统计分析结果；*表示与对照组相比，P<0.05四、讨论4.1鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型的建立及SelT与miR-365-3p靶向关系的验证在本研究中，成功构建了鸡胚成肌细胞miR-365-3p敲低和过表达模型、SelT敲低模型，并通过一系列实验验证了SelT与miR-365-3p的靶向关系，这些模型和关系的确定为深入研究硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的机理奠定了坚实基础。鸡胚成肌细胞作为研究骨骼肌发育的重要细胞模型，具有高度的分化潜能和与体内骨骼肌发育相似的生物学特性。通过转染miR-365-3p抑制剂和模拟物，成功实现了miR-365-3p在鸡胚成肌细胞中的敲低和过表达。qPCR检测结果显示，miR-365-3p敲低组中miR-365-3p的表达水平显著降低，miR-365-3p过表达组中其表达水平显著升高，表明模型构建成功。这一模型的成功建立，使得我们能够在细胞水平上研究miR-365-3p表达变化对鸡胚成肌细胞生物学功能的影响，为后续探究miR-365-3p在鸡骨骼肌发育中的作用机制提供了有力工具。同样，利用RNA干扰技术，设计并合成针对SelT的siRNA，成功构建了鸡胚成肌细胞SelT敲低模型。通过qPCR和Westernblot检测发现，转染si-SelT后，SelT的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，证明了该模型的有效性。SelT敲低模型的建立，为研究SelT在鸡胚成肌细胞中的功能以及其与鸡骨骼肌发育的关系提供了重要平台。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验结果证实了SelT是miR-365-3p的靶基因，二者存在靶向关系。在鸡胚成肌细胞中，过表达miR-365-3p后，SelT的mRNA和蛋白表达水平显著降低；抑制miR-365-3p表达后，SelT的表达水平显著升高，进一步验证了这种靶向调控作用。这种靶向关系的确认，揭示了miR-365-3p调控鸡骨骼肌发育的一条重要分子途径，为深入理解硒对鸡骨骼肌发育的调控机制提供了关键线索。这些模型的建立和靶向关系的验证，具有重要的科学意义和研究价值。在细胞水平上，它们为研究miR-365-3p和SelT对鸡胚成肌细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程的影响提供了有力手段。通过对这些过程的深入研究，有助于揭示鸡骨骼肌发育的分子调控网络，丰富和完善肌肉发育的理论体系。在实际应用方面，这些研究结果为鸡养殖产业提供了理论支持，有助于通过调控miR-365-3p和SelT的表达，优化鸡的骨骼肌生长性能，提高鸡肉产量和品质，促进鸡养殖产业的可持续发展。4.2鸡缺硒模型的复制、miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型及SelT敲低鸡胚模型的建立在本研究中，成功复制了鸡缺硒模型，构建了miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型及SelT敲低鸡胚模型，这些模型的建立为深入研究硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的机制提供了重要的动物模型。鸡缺硒模型的复制是通过在饲料中添加不同剂量的亚硒酸钠实现的。选择1日龄健康AA肉鸡雏鸡，随机分组后，分别饲喂不同硒含量的饲料，低硒组硒含量设定为0.1mg/kg，对照组为0.3mg/kg，中硒组0.5mg/kg，高硒组0.7mg/kg，超高硒组1.0mg/kg。通过这种方式，模拟了不同硒水平对鸡生长发育的影响。在饲养至42日龄的过程中，详细记录鸡的生长性能指标，包括体重、采食量和饲料转化率等，这些指标的变化能够直观反映硒对鸡整体生长状况的影响。实验结束后，对鸡骨骼肌组织进行了全面的检测分析，包括显微结构观察、相关基因mRNA和蛋白水平检测以及miR-365-3p和SelT表达的检测。鸡缺硒模型的成功复制，使得我们能够在体内环境下研究硒缺乏对鸡骨骼肌发育的影响，为后续探究硒在鸡骨骼肌发育中的作用机制提供了基础。miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型的建立，为研究miR-365-3p在鸡胚骨骼肌发育中的功能提供了有力工具。选取新鲜受精的AA肉鸡种蛋，在孵化至3天时，通过在气室处钻孔并向卵黄囊中注射miR-365-3p抑制剂、模拟物或阴性对照与EntransterTM-invivoRNA转染试剂的混合液，实现了miR-365-3p在鸡胚中的敲低和过表达。在孵化至14天时，对鸡胚进行各项指标检测，包括qPCR检测miR-365-3p的表达水平以验证模型是否成功建立，以及对骨骼肌组织进行显微结构观察、相关基因mRNA和蛋白水平检测。通过这些检测，能够深入了解miR-365-3p表达变化对鸡胚骨骼肌发育的影响，揭示其在鸡骨骼肌发育过程中的调控作用。SelT敲低鸡胚模型的建立同样具有重要意义。选取孵化至3天的鸡胚，通过气室注射针对SelT的siRNA与EntransterTM-invivoRNA转染试剂的混合液，成功实现了SelT在鸡胚中的敲低。在孵化至14天时，对鸡胚进行了全面的检测分析，包括qPCR检测SelT的mRNA表达水平以确认模型成功建立，以及对骨骼肌组织进行显微结构观察、相关基因mRNA和蛋白水平检测，同时还检测了鸡胚的体重、体长和腿长等生长发育指标。SelT敲低鸡胚模型的建立，有助于研究SelT在鸡胚发育过程中的功能，特别是其对鸡骨骼肌发育的影响，进一步揭示SelT在鸡骨骼肌发育调控网络中的作用。这些模型的建立，为研究硒通过miR-365-3p靶向SelT调控鸡骨骼肌发育的机制提供了多层次、多角度的研究平台。通过在鸡缺硒模型中观察硒缺乏对鸡骨骼肌发育的影响，以及在miR-365-3p敲低和过表达鸡胚模型、SelT敲低鸡胚模型中研究miR-365-3p和SelT表达变化对鸡骨骼肌发育的影响，能够更加全面、深入地揭示这一复杂调控过程的内在机制。这些研究结果对于深入理解鸡骨骼肌发育的分子调控机制，以及为鸡养殖产业提供科学的饲养策略和分子育种方案具有重要的理论和实践意义。4.3SelT对肌肉发育相关因子的影响本研究结果表明，SelT在鸡骨骼肌发育过程中对肌肉发育相关因子的表达具有显著调控作用，这一调控作用在鸡胚成肌细胞和鸡胚模型中均得到了验证。在鸡胚成肌细胞中，敲低SelT后，MyoD、Myf5和Myogenin等肌肉发育相关因子的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。MyoD和Myf5作为生肌调节因子家族的重要成员，在成肌细胞的增殖和分化起始阶段发挥关键作用。MyoD能够激活一系列与肌肉发育相关的基因表达，促使成肌细胞从静止状态进入增殖期。Myf5则参与了成肌细胞的早期分化过程，对肌肉干细胞的维持和分化具有重要意义。Myogenin是成肌细胞分化过程中的关键调节因子，它在成肌细胞向成熟肌纤维分化的过程中发挥着核心作用，能够促进肌管的形成和肌肉特异性基因的表达。当SelT敲低时，这些关键因子的表达下调，导致成肌细胞的增殖和分化受到抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期，增殖能力下降，分化进程受阻。这表明SelT对于维持肌肉发育相关因子的正常表达至关重要，其表达水平的变化直接影响成肌细胞的生物学功能，进而影响鸡骨骼肌的发育。在鸡胚模型中，同样观察到SelT敲低对肌肉发育相关因子的抑制作用。孵化至14天的SelT敲低鸡胚，其胸肌和腿肌组织中MyoD、Myf5和Myogenin的mRNA和蛋白表达水平显著降低。同时，骨骼肌显微结构也发生明显改变，肌纤维排列紊乱，直径变细，部分肌纤维断裂，这些变化与鸡胚成肌细胞实验结果相互印证。这进一步说明SelT在体内环境下对鸡骨骼肌发育的调控作用，通过调节肌肉发育相关因子的表达，影响骨骼肌的正常发育。综合以上结果，SelT在鸡骨骼肌发育中扮演着重要角色，它通过正向调控MyoD、Myf5和Myogenin等肌肉发育相关因子的表达，促进成肌细胞的增殖和分化，维持骨骼肌的正常发育。这一发现揭示了SelT在鸡骨骼肌发育调控网络中的关键作用，为深入理解鸡骨骼肌发育的分子机制提供了新的视角。同时，也为通过调控SelT的表达来改善鸡骨骼肌生长性能，提高鸡肉产量和品质提供了理论依据。在实际鸡养殖生产中，可以考虑通过营养调控、基因编辑等手段，优化SelT的表达水平，以促进鸡骨骼肌的健康发育，满足市场对高品质鸡肉的需求。4.4SelT对线粒体生物合成的影响本研究发现，SelT在鸡骨骼肌发育过程中对线粒体生物合成具有关键调控作用，这一作用对维持骨骼肌细胞的能量代谢和正常发育至关重要。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其生物合成过程受到多种因素的精密调控。在鸡胚成肌细胞中，敲低SelT后，线粒体生物合成相关因子的mRNA和蛋白表达水平发生显著变化。例如，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）作为线粒体生物合成的关键调控因子，其表达水平在SelT敲低后显著降低。PGC-1α能够通过激活核呼吸因子1（NRF1）和核呼吸因子2（NRF2）等，促进线粒体DNA的复制和转录，进而调节线粒体的生物合成。当SelT表达下调时，PGC-1α表达减少，导致NRF1和NRF2的激活受阻，线粒体DNA的复制和转录受到抑制，线粒体数量减少，生物合成过程受阻。线粒体动力学相关基因的表达也受到SelT敲低的影响。线粒体融合蛋白1（MFN1）和线粒体融合蛋白2（MFN2）参与线粒体的融合过程，而动力相关蛋白1（DRP1）则主要负责线粒体的分裂。研究结果显示，SelT敲低后，MFN1和MFN2的表达水平显著下降，DRP1的表达水平升高。这使得线粒体的融合与分裂失衡，线粒体形态发生改变，出现碎片化现象，影响线粒体的正常功能。线粒体的正常融合和分裂对于维持线粒体的结构和功能完整性至关重要，融合能够促进线粒体之间的物质交换和信息传递，而分裂则有助于清除受损的线粒体。当SelT缺失导致线粒体动力学异常时，线粒体的能量代谢功能受到干扰，无法为鸡骨骼肌细胞的生长和发育提供充足的能量。线粒体生物合成受阻和动力学异常，直接导致细胞内ATP含量显著降低。ATP作为细胞的直接供能物质，其含量的减少会影响细胞的各种生理活动，包括成肌细胞的增殖和分化。在鸡胚成肌细胞中，由于SelT敲低导致ATP供应不足，细胞周期阻滞在G0/G1期，增殖能力下降，分化进程也受到阻碍。这表明SelT通过调控线粒体生物合成和动力学，维持细胞内的能量稳态，为鸡骨骼肌细胞的正常发育提供必要的能量支持。在鸡胚模型中，同样观察到SelT敲低对线粒体生物合成的抑制作用。孵化至14天的SelT敲低鸡胚，其胸肌和腿肌组织中线粒体生物合成相关因子的表达水平下降，线粒体数量减少，形态异常。这进一步证实了SelT在体内环境下对鸡骨骼肌线粒体生物合成的重要调控作用。SelT在鸡骨骼肌发育中通过调控线粒体生物合成相关因子和线粒体动力学基因的表达，维持线粒体的正常生物合成和功能，为鸡骨骼肌细胞提供充足的能量，保障鸡骨骼肌的正常发育。这一发现揭示了SelT在鸡骨骼肌发育过程中能量代谢调控方面的重要作用，为深入理解鸡骨骼肌发育的分子机制提供了新的视角。同时，也为通过调节SelT的表达来改善鸡骨骼肌的能量代谢和生长性能提供了理论依据。在实际鸡养殖生产中，可以通过优化饲养管理、营养调控等手段，维持SelT的正常表达，促进线粒体的生物合成和功能，提高鸡骨骼肌的发育水平，从而提升鸡肉的产量和品质。4.5SelT对骨骼肌钙离子的影响在鸡骨骼肌发育过程中，SelT对骨骼肌钙离子稳态的维持起着至关重要的作用，这一调控作用对鸡骨骼肌的正常发育具有深远影响。细胞内钙离子作为重要的第二信使，参与调节骨骼肌细胞的多种生理过程，如肌肉收缩、细胞增殖、分化和凋亡等。在本研究中，通过对鸡胚成肌细胞SelT敲低模型的研究发现，敲低SelT后，细胞内钙离子水平发生显著变化。利用荧光探针Fluo-3/AM标记细胞内钙离子，通过激光共聚焦显微镜检测发现，SelT敲低组细胞内钙离子荧光强度明显增强，表明细胞内游离钙离子浓度显著升高。这一结果表明SelT的缺失会破坏骨骼肌细胞内的钙离子稳态，导致钙离子失衡。钙通道基因的表达也受到SelT敲低的显著影响。qPCR检测结果显示，敲低SelT后，电压依赖性钙通道（VDCC）家族中的L型钙通道（CaV1.1）和T型钙通道（CaV3.1）的mRNA表达水平显著上调。L型钙通道在骨骼肌兴奋-收缩偶联过程中发挥