DB15∕T 4256-2026 牛疱疹病毒4型感染诊断技术

ICS65.020.30

CCSB41

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T4256—2026

牛疱疹病毒4型感染诊断技术

Diagnostictechniquesforbovineherpesvirus4infection

2026-01-15发布2026-02-15实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T4256—2026

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古金迈诗生物科技有限公司、内蒙古农业大学、

内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、土默特左旗动物疫病防控中心、通辽市动物疫病预防控制中心、

内蒙古自治区质量和标准化研究院。

本文件主要起草人：刘玉梅、刘东霞、赵利平、张彦婷、陈学飞、关平原、李劼、徐晓静、赵丽霞、

郭宇、刘慧、庄金山、刘利军、石明伟、张鸣华、杨晓婷、宋鑫。

I

DB15/T4256—2026

牛疱疹病毒4型感染诊断技术

1范围

本文件规定了牛疱疹病毒4型感染临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准，包含样

品采集、保存和处理，病毒分离与鉴定，实时荧光PCR以及病毒中和抗体检测技术。

本文件适用于牛饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对牛疱疹病毒4型感染的诊断、监测和流

行病学调查等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

牛疱疹病毒4型（牛伽玛疱疹病毒4型,BoHV-4）bovinegammaherpesvirus4,BoHV-4

属于正疱疹病毒科(Orthoherpesviridae)、γ-疱疹病毒亚科（Gammaherpesvirinae）、细长病毒

属（Rhadinovirus），是一种双链DNA病毒，病毒颗粒较大（直径150nm～200nm），是有囊膜的二十

面体粒子，基因组大小约144kb。

牛疱疹病毒4型感染bovineherpesvirustype4infection

牛伽玛疱疹病毒4型（Bovinegammaherpesvirus4,BoHV-4）侵入牛体的组织、器官，在其中生长、

繁殖，并引起宿主出现病理反应的过程。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BoHV-4：牛疱疹病毒4型（BovineHerpesvirustype4，BoHV4）

CPE：致细胞病变效应（CytopathicEffect）

DMEM：DMEM培养基（DuLbecco’sModifiedEagleMedium）

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MDBK细胞：牛肾细胞（BovineKidneyCells）

NBS：新生牛血清（NewbornBovineSerum）

PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

TCID50：半数细胞培养物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）

5生物安全措施

样品采集的生物安全措施应符合GB/T27401的规定,样品处理的生物安全措施应符合GB19489的规

定。

6临床诊断

流行病学

6.1.1易感动物

通常主要感染牛，也可感染绵羊、山羊、豚鼠等，导致已感染动物出现繁殖障碍。

6.1.2传染源

病畜和带毒畜为主要传染源。

6.1.3传播途径

本病通过直接接触传播，也可通过间接接触传播，接触病畜和带毒畜的口鼻分泌物、生殖道分泌物

均可感染本病，人工受精、胚胎移植也是其传播的潜在途径。

6.1.4流行特点

一年四季均可发生感染，无明显的季节性，与气候或温度变化无显著关联。

临床症状

大多数呈隐性感染，发病牛主要临床症状表现为产后子宫炎、流产，翻开外阴肉眼可见点状白色水

泡疹。

病理变化

子宫肿大，子宫内膜充血、水肿，子宫壁增厚，子宫腔内可见大量浑浊、脓性渗出物。流产的胎儿

可能自溶，或可见肝脏坏死等病变。

结果判定

当牛出现上述症状和病理变化时，可判定为牛疱疹病毒4型感染的疑似病例。

7实验室诊断

病毒分离鉴定

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7.1.1主要试剂耗材

7.1.1.1MDBK细胞系。

7.1.1.2无菌棉拭子。

7.1.1.3NBS。

7.1.1.4DMEM培养基。

7.1.1.5青霉素（100U/mL）。

7.1.1.6链霉素（100μg/mL）。

7.1.1.7细胞培养板。

7.1.1.82%磷钨酸。

7.1.2主要仪器

7.1.2.1电子天平。

7.1.2.2研磨仪。

7.1.2.3台式冷冻离心机。

7.1.2.4生物安全柜。

7.1.2.5CO2培养箱。

7.1.2.6倒置显微镜。

7.1.2.7冰箱。

7.1.2.8微量可调移液器（20μL～200μL、100μL～1000μL、1000μL～5000μL）。

7.1.2.9电子显微镜。

7.1.2.10超速冷冻离心机。

7.1.3样品采集与保存

7.1.3.1采集与保存原则

按照NY/T541执行。

7.1.3.2拭子

用无菌棉拭子反复刮擦眼结膜、呼吸道粘膜、阴道粘膜、阴茎或包皮黏膜5～10次，蘸取分泌物后

将棉拭子浸入2mLPBS（配制方法按照附录A中的A.1执行）中，4℃冷藏运输，24h内送至实验室；对

于不能在24h内送达实验室样品，应以冷冻状态运送。取样进行检验时，振荡、挤干拭子，浸泡液采用

4,000g离心1min，取上清液-20℃保存备用。

7.1.3.3精液

取解冻或新鲜精液样品1mL～1.5mL于微量离心管中，振荡混匀，采用5,000g离心30s，取上清

液-20℃保存备用。

7.1.3.4组织样品

无菌采集流产物或流产胎儿组织脏器1g以上剪碎，加入2mLPBS（配制方法按照附录A中的A.1执

行），于研钵或组织匀浆器中研磨制成悬液，5,000g离心20min，取上清液-20℃保存备用。

7.1.3.5血清

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用采样器采集待检活牛静脉血2mL～5mL，4℃保存，24h内送至实验室。待凝固后，2,000g离

心5min，取上清液-20℃保存备用。

7.1.4病毒分离

取临床样品的处理组织液，经0.22μm针头滤器无菌过滤后，按照10%的比例接种到长满单层的MDBK

细胞，按千分之一比例添加10万单位青链霉素混合液（配制方法按照附录A中A.2执行），置于37℃，

含5%CO2的培养箱中吸附1h～2h后，弃去处理组织液，根据培养容器重新加入适量病毒维持液（配

制方法按照附录A中A.3执行），同时设对照组，置于37℃，5%CO2培养箱，培养3d～5d，逐日观察，

记录细胞病变。如3d～5d内不出现病变，按上述方法盲传3～5代，每代逐日观察细胞病变，当出现细

胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长、聚集形成网状的典型病变（见附录B中B.1），则进行病毒特异性鉴

定。

7.1.5病毒鉴定

7.1.5.1取出现典型细胞病变培养物，反复冻融3次，以3000g离心10min，取上清提取DNA，采用

实时荧光PCR进行核酸检测，进一步鉴定是否为BoHV4。

7.1.5.2取采集组织样本制成1:5PBS悬液或细胞培养物3000g离心30min，取上清，15000g离

心30min，取上清，以40000g离心5h，弃上清，加0.5mL蒸馏水悬浮，滴加铜网，2%磷钨酸负染

30min，室温下自然干燥后，电镜下观察病毒粒子形态。如电镜下观察发现，完整病毒颗粒(含包膜)直

径约为150nm～200nm,呈球形，包膜表面可见糖蛋白形成的刺突结构（见附录B中B.2）。可初步判

定为牛疱疹病毒4型疑似病例。（选做）

实时荧光PCR

7.2.1主要试剂耗材

7.2.1.1微量可调移液器（1μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μ

L）。

7.2.1.2无菌无酶离心管。

7.2.1.3PCR扩增管。

7.2.1.4病毒DNA提取试剂盒。

7.2.1.5商品化PCR预混液。

7.2.1.6阴性对照：DEPC水。

7.2.1.7阳性对照：带目的片段的质粒DNA，制备方法与基因序列见附录C中的C.1及C.2。

7.2.1.8引物序列和探针见附录C中的C.3，加DEPC水配制成100μmol/L的储存浓度和10μmol/L

工作浓度。

7.2.2主要仪器

7.2.2.1实时荧光PCR仪

7.2.2.2台式冷冻离心机。

7.2.2.3生物安全柜。

7.2.2.4旋涡混匀器。

7.2.3待检样品

处理后的样品或细胞培养物。

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7.2.4病毒DNA提取

使用病毒DNA提取试剂盒或用自动化核酸提取仪，提取已处理的待检样品（拭子、精液、细胞培养

物、组织、血清等）中的DNA。

7.2.5实时荧光PCR

7.2.5.1反应体系

取BoHV-4上游引物（BoHV-4-F）、BoHV-4下游引物（BoHV-4-R）和BoHV-4探针（BoHV-4-P）参照附

录C中的C.4进行引物、探针序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10μmol/L。同时设阴性对照和阳性

对照。反应体系25μL：2×PremixExTaqTM（ProbeqPCR）12.5μL，BoHV-4上游引物0.5μL，

BoHV-4下游引物0.5μL，BoHV-4探针1μL，RNase-FreeddH2O8.5μL。将配制好的反应体系充分混

匀，分装于0.2mLPCR扩增管中，吸取待检样品、阴性对照、阳性对照的DNA溶液各2μL，加入到对应

的PCR扩增管中，盖好管盖瞬时离心后，放入PCR仪中进行PCR反应。

7.2.5.2反应条件

每次PCR均应设阳性对照与阴性对照，参数：95℃预变性2min；95℃变性15s、56℃退火/延伸

30s（收集信号），45个循环。

7.2.6样品结果判定

7.2.6.1试验成立条件

7.2.6.1.1阴性对照无Ct值或Ct值＞40且未出现特异性扩增曲线。

7.2.6.1.2阳性对照Ct值＜30，并出现特异性扩增曲线，判为试验成立。否则，本次试验无效。

7.2.6.2样品结果判定

7.2.6.2.1阴性

若待测样品Ct值＞40或无Ct值，则结果判定为BoHV-4核酸阴性。

7.2.6.2.2阳性

若待测样品出现特异性的扩增曲线，且Ct值≤35，则结果判定为BoHV-4核酸阳性。

7.2.6.2.3可疑

若待测样品35＜Ct值≤40，出现特异性的扩增曲线，则结果判定为BoHV-4核酸可疑，即该样品需要

进行复检。如复检结果为阳性或可疑，则判定为BoHV-4核酸阳性，否则判定为阴性。

病毒中和抗体测定

7.3.1毒株

6

BoHV-4毒株，毒价≥10TCID50/mL。

7.3.2主要试剂耗材

7.3.2.1离心管。

7.3.2.2新生牛血清。

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7.3.2.3DMEM培养基。

7.3.2.4青霉素（100U/mL）。

7.3.2.5链霉素（100μg/mL）。

7.3.2.696孔细胞培养板。

7.3.2.7MDBK细胞系。

7.3.2.8阴性对照血清、阳性对照血清。

7.3.3主要仪器

7.3.3.1生物安全柜。

7.3.3.2CO2培养箱。

7.3.3.3倒置显微镜。

7.3.3.4冰箱。

7.3.3.5移液器（20μL～200μL、100μL～1000μL、1000μL～5000μL）。

7.3.4待检样品

按照7.1.3.5采集分离血清。

7.3.5操作步骤

7.3.5.1血清灭活

将待检血清、阳性血清和阴性血清在56℃水浴灭活30min，取出备用。

7.3.5.2中和病毒工作液制备

用病毒维持液（配制方法按照附录A中的A.3执行）将中和用病毒稀释成200TCID50/0.1mL。

7.3.5.3血清稀释

将待检血清及阴性、阳性对照血清用含2%新生牛血清的DMEM培养基（按千分之一添加10万单位青链

霉素混合液，配制方法按照附录A中的A.2执行），使用浓度为：青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL）

从1∶2开始作2倍系列稀释至1∶64（或根据实际情况适当增加稀释度），将各稀释度待检血清以及阳性

和阴性血清分别加入96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，每孔50μL。

7.3.5.4中和

向各待检血清、阴性血清及阳性血清中加入200TCID50/0.1mL的中和病毒工作液50μL/孔，振摇

混匀后，置37℃中和1h，期间振摇2～3次。

7.3.5.5其他对照设立

7.3.5.5.1正常细胞对照

向正常细胞对照的4个孔中分别加入含2%新生牛血清的DMEM培养液100μL/孔。

7.3.5.5.2病毒回归对照

将病毒含量为200TCID50/0.1mL的病毒液作10、100、1000倍稀释，每个稀释度4孔，每孔50μL，

并补加含2%新生牛血清的DMEM培养液50μL/孔（不作稀释即为100TCID50/0.1mL、作10倍稀释即为10

TCID50/0.1mL、作100倍稀释即为1TCID50/0.1mL、作1000倍稀释即为0.1TCID50/0.1mL）。

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7.3.5.5.3病毒含量测定

将中和用病毒做10倍系列稀释，取10-4～10-7稀释度，每个稀释度各4孔，每孔100μL。

7.3.5.6加细胞悬液

向所有孔中加入浓度约为10～20万个细胞/mL的含8%～10%新生牛血清的MDBK细胞悬液100μL/孔，

置37℃、5%CO2培养箱培养3d～5d，每日用倒置显微镜观察细胞病变。

7.3.6结果判定

7.3.6.1试验成立条件

每日显微镜下观察细胞病变，培养3d～5d后进行结果判定。阳性对照血清滴度不应比其已知效价

差1个滴度以上；阴性血清中和抗体效价应不高于1:4；正常细胞对照不产生CPE；病毒回归对照中0.1

TCID50/0.1mL孔不产生CPE，100TCID50/0.1mL孔全部产生CPE；病毒含量测定的TCID50值不应比其已知

TCID50值差0.5个滴度以上。

7.3.6.2判定标准

统计待检血清的细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价：

a)病毒中和抗体滴度＜1:4判为阴性；

b)1:4≤病毒中和抗体滴度＜1:8判为可疑；

c)病毒中和抗体滴度≥1:8判为阳性。

8综合判定

经7.1或7.2检测结果为阳性，可判定为牛疱疹病毒4型感染病例。

经7.3检测结果为阳性，判定为牛疱疹病毒4型曾经感染或正在感染。

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A

A

附录A

（规范性）

试剂的配制

A.10.04mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS液）配制

称量NaCl8.5g、Na2HPO4.12H2O14.3g、KH2PO40.5g，蒸馏水定容至1000mL后，121℃高压灭菌

15min备用。

A.210万单位青霉素和链霉素混合液配制

将10支青霉素（160万单位）和16支硫酸链霉素（100万单位/1g）加入纯化水使其全部溶解，定容

到160mL,用0.22μm滤器过滤后放-20℃度保存备用。使用时按千分之一比例加入培养体系，确保硫

酸链霉素终浓度为100ug（100单位）/mL，青霉素终浓度为100单位/mL。

A.3病毒维持液配制

取980mLDMEM培养基与20mLNBS混合均匀，4℃密封保存，建议现配现用。

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B

B

附录B

（资料性）

病毒分离鉴定

B.1BoHV4细胞病变示意图

BoHV4细胞病变示意图见图B.1。

AB

a)正常MDBK细胞对照图b)BoHV4感染MDBK细胞病变图

图B.1BoHV4细胞病变示意图

B.2牛疱疹病毒4型电镜图（选做）

牛疱疹病毒4型电镜图见图B.2。

BoHV-4具有疱疹病毒共有的一般形态特征，有囊膜，核衣壳呈立体对称的正20面体，直径约100

nm，而整个病毒粒子的直径约150nm。该病毒为有囊膜病毒，BoHV-4电镜图见图B.2。

图B.2牛疱疹病毒4型电镜图

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