《生物化学》-第12章

１２.１核酸和核苷酸的酶促降解12.1.1核酸的降解食物中的核酸多与蛋白质结合为核蛋白,在胃中受胃酸的作用,或在小肠中受蛋白酶作用,分解为核酸和蛋白质.核酸主要在十二指肠由胰核酸酶(pancreaticnucleases)和小肠磷酸二酯酶(phosphodiesterases)降解为单核苷酸.核苷酸由不同的碱基特异性核苷酸酶(nucleotidases)和非特异性磷酸酶(phosphatases)催化,水解为核苷和磷酸.核苷可直接被小肠黏膜吸收,或在核苷水解酶(nucleosidases)和核苷磷酸化酶(nucleosidephosphorylases)作用下,水解为碱基、戊糖或１-磷酸戊糖.下一页返回１２.１核酸和核苷酸的酶促降解体内核苷酸的分解代谢与食物中核苷酸的消化过程类似,可降解生成相应的碱基,戊糖或１-磷酸核糖.１-磷酸核糖在磷酸核糖变位酶催化下转变为５-磷酸核糖,成为合成PRPP的原料.碱基可参加补救合成途径,也可进一步分解.上一页下一页返回１２.１核酸和核苷酸的酶促降解12.1.2嘌呤的分解嘌呤核苷酸可以在核苷酸酶的催化下,脱去磷酸成为嘌呤核苷,嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶(purinenucleosidephosphorylase,PNP)的催化下转变为嘌呤.嘌呤在生物体内进一步分解,但不同生物分解嘌呤碱基的能力不同,因此代谢产物也不同.对于灵长类、鸟类、爬行类、昆虫等动物,嘌呤碱基经水解、脱氨及氧化等作用最终生成尿酸.腺嘌呤核苷酸经水解和脱氨作用生成次黄嘌呤,次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)的作用下,生成黄嘌呤.而鸟嘌呤核苷酸经水解和脱氨作用生成黄嘌呤,最终黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下进一步生成尿酸(uricacid).上一页下一页返回１２.１核酸和核苷酸的酶促降解除了人类和猿类外,其他的哺乳动物可以在尿酸氧化酶的作用下将尿酸进一步氧化为尿囊素.硬骨鱼还可以进一步将尿囊素在尿囊素酶的作用下生成尿囊酸.两栖类及软骨鱼则可以在尿囊酸酶的作用下分解尿囊酸为尿素,而海洋无脊椎动物则可以进一步将尿素分解,直至生成氨和二氧化碳.体内嘌呤核苷酸的分解代谢主要在肝脏、小肠及肾脏中进行.正常生理情况下,嘌呤合成与分解处于相对平衡状态,所以尿酸的生成与排泄也较恒定.当体内核酸大量分解(白血病、恶性肿瘤等)或食入高嘌呤食物时,血中尿酸水平升高,当尿酸盐过饱时,形成结晶,沉积于关节、软组织、软骨及肾等处,而导致关节炎、尿路结石及肾疾患,称为痛风症.上一页下一页返回１２.１核酸和核苷酸的酶促降解12.1.3嘧啶的分解嘧啶核苷酸的分解代谢途径与嘌呤核苷酸的相似.首先通过核苷酸酶及核苷磷酸化酶的作用,分别除去磷酸和核糖,产生的嘧啶碱再进一步分解.嘧啶的分解代谢主要在肝脏中进行.分解代谢过程中有脱氨基、氧化、还原及脱羧基等反应.胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶.尿嘧啶和胸腺嘧啶先在二氢嘧啶脱氢酶的催化下,由NADPH＋H＋供氢,分别还原为二氢尿嘧啶和二氢胸腺嘧啶.二氢嘧啶酶催化嘧啶环水解,分别生成β-丙氨酸(β-alanine)和β-氨基异丁酸(β-aminosiobutyrate).β-丙氨酸和β-氨基异丁酸可继续分解代谢,β-氨基异丁酸也可随尿排出体外,因此食入含丰富DNA的食物、经放射线治疗或化学治疗的患者,以及白血病患者,尿中β-氨基异丁酸排出量增多.上一页返回12.2核苷酸的合成12.2.1嘌呤核苷酸的合成体内嘌呤核苷酸的合成有两条途径:①以磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及CO２等简单物质为原料合成嘌呤核苷酸的过程,称为从头合成途径(Denovosynthesis).从头合成途径是体内嘌呤核苷酸的主要合成途径;②利用体内游离嘌呤或嘌呤核苷,经简单反应过程生成嘌呤核苷酸的过程,称为补救合成途径(Salua-epathway).在部分组织如脑、骨髓中只能通过补救合成途径合成嘌呤核苷酸.下一页返回12.2核苷酸的合成１.嘌呤核苷酸的从头合成途径体内嘌呤核苷酸从头合成的主要器官是肝脏,其次是小肠黏膜和胸腺.嘌呤核苷酸合成部位在胞液.早在１９４８年,Buchanan等采用同位素示踪技术,用同位素标记不同化合物来喂养鸽子,并通过测定排出的尿酸中标记原子的位置,从而证实了合成嘌呤的原料包括磷酸核糖、甘氨酸、天门冬氨酸、谷氨酰胺、CO２和一碳单位.目前,嘌呤核苷酸的合成过程也已经被阐明,体内嘌呤核苷酸的合成是在磷酸核糖的基础上逐步合成嘌呤核苷酸.主要反应包括次黄嘌呤核苷酸(IMP)的合成,由IMP再转变成腺嘌呤核苷酸(AMP)与鸟嘌呤核苷酸(-MP).上一页下一页返回12.2核苷酸的合成２.嘌呤核苷酸的补救合成途径在生物体内,核酸分解可以产生核苷及游离碱基,因此细胞可以利用游离碱基或核苷重新合成相应的核苷酸,此过程称为补救合成(salva-epathway).嘌呤核苷酸补救合成是一种次要途径.与从头合成途径相比,补救合成过程比较简单,消耗能量较少.对于生物体内嘌呤核苷酸的补救合成途径,一方面在特异的核苷酸磷酸化酶的作用下,游离碱基与磷酸核糖反应生成核苷,再由磷酸激酶催化,形成核苷酸.反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成另一方面,碱基也可与５-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应,生成嘌呤核苷酸.这种补救合成途径主要有两种特异性不同的酶参与:腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Adeninephosphoribosyltransferase,APRT)催化５-磷酸核糖焦磷酸与腺嘌呤碱基合成腺嘌呤核苷酸;次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-uaninephosphoribosyltransferase,H-PRT)催化５-磷酸核糖焦磷酸与次黄嘌呤碱基或鸟嘌呤碱基合成鸟嘌呤核苷酸或次黄嘌呤核苷酸.反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成补救合成途径有其特有的生理意义,一方面在于可以节省能量及减少氨基酸的消耗,另一方面对某些缺乏从头合成途径的组织,如人的白细胞和血小板、脑、骨髓、脾等,具有重要的生理意义.12.2.2嘧啶核苷酸合成体内嘧啶核苷酸的合成有两条途径:①利用天冬氨酸、氨基酸及CO２等简单物质为原料合成嘧啶核苷酸的过程,称为从头合成途径(denovosynthesis),是体内的主要合成途径;②利用体内游离嘧啶或嘧啶核苷,经简单反应过程生成嘧啶核苷酸的过程,称为重新利用或补救合成途径(alua-epathway).上一页下一页返回12.2核苷酸的合成１.嘧啶核苷酸的从头合成途径对嘧啶核苷酸的从头合成途径同样采用同位素示踪技术,同位素示踪表明,构成嘧啶核苷酸嘧啶环的第１位的氮,第４、５、６位的碳均由天冬氨酸提供;第２位的碳来源于CO２;第３位的氮来源于谷氨酰胺.嘧啶核苷酸的从头合成过程与嘌呤核苷酸的从头合成不同,是先合成嘧啶环,然后再与磷酸核糖相连而成.２.嘧啶核苷酸从头合成的调节在细菌中,天冬氨酸氨基甲酰转移酶(ATCase)是嘧啶核苷酸从头合成的主要调节酶.在大肠杆菌中,该酶主要受别构调节,其中ATP是其别构激活剂,而CTP则为其别构抑制剂.而在许多细菌中,UTP是该酶的主要别构抑制剂;上一页下一页返回12.2核苷酸的合成在动物细胞中,天冬氨酸氨基甲酰转移酶不是嘧啶核苷控.UDP和UTP抑制其活性,而ATP和PRPP为其激活剂.第二水平的调节是乳清酸核苷酸脱羧酶,UMP和CMP为其竞争抑制剂.乳清酸尿症是一种遗传性疾病,主要是由于缺乏催化嘧啶核苷酸从头合成反应的乳清酸磷酸核糖转移酶和乳清酸核苷酸脱羧酶,导致尿中排出大量乳清酸、生长迟缓和重度贫血.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成12.2.3脱氧核糖核苷酸的生成１.脱氧核糖核苷酸的合成过程脱氧核糖核苷酸的形成并不是从头合成,而是通过相应核糖核苷酸还原而来,这种还原作用是在二磷酸核苷酸水平上进行的.催化核糖核苷酸还原的酶是核糖核苷酸还原酶(ribonudeotidereductase).核糖核苷酸还原酶广泛存在于各种生物中,是生物体内唯一的催化４种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖核苷酸的酶.核糖核苷酸还原酶是一种别构酶,包括R１、R２两种亚基组成(图１２-１０),R１亚基由两条相同的α多肽链组成,R１亚基具有两个调节位点,R２亚基由两条相同的β多肽链组成.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成R１与R２亚基交界处具有酶的催化位点.其中四种核糖核苷酸(ADP、-DP、UDP、CDP)作为反应底物,而ATP、dATP、d-TP、dTTP作为别构效应物.只有R１与R２两种亚基结合时,才具有酶活性.已经发现的核糖核苷酸还原酶有四种类型,不同生物的核糖核苷酸还原酶的区别主要在于产生的自由基基团不同,但它们的三级结构的活性中心和催化功能均相似.核苷核苷酸还原酶包含２个别构位点,其中活性中心通过生物自由基的作用催化核糖核苷酸还原,底物特异结合位点通过别构作用调控４种dNTPs的平衡,因此目前该酶在DNA合成与修复、细胞增殖分化及癌症治疗等方面具有重要作用,也成为研究酶功能及抗癌药物开发的工具酶.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成大肠杆菌核糖核苷酸还原酶催化机理于１９９０年由J.A.Stubbe最早提出.目前,该酶催化的反应过程为:首先第４３９位的半胱氨酸(Cys)从底物核糖核苷酸的C３位置获得H,而C２位置的OH和第２２５位的半胱氨酸(Cys)反应生成一分子水后,C２位置从第４６２位的半胱氨酸(Cys)重获H,从而促使第４６２位与第２２５位的半胱氨酸(Cys)之间形成二硫键,最后第４３９位的半胱氨酸(Cys)又将H重新交回给C３位.通过该过程,核糖核苷酸被(NDP)还原为脱氧核糖核苷酸(dNDP).在反应过程中,在核糖核苷酸还原酶作用下,所含的硫基被氧化为二硫键,再在硫氧化还原蛋白还原酶(thioredoxinreductase)催化下,最终由NADPH供氢重新还原为还原型的硫氧化还原蛋白.因此,NADPH是NDP还原为dNDP的最终还原剂.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成核糖核苷酸还原酶催化ADP、-DP、CDP反应直接生成dADP、d-DP、dCDP.反应式如下:由于没有胸腺嘧啶核苷酸,因此胸腺嘧啶核苷酸主要是由尿嘧啶核苷酸转变为尿嘧啶脱氧核苷酸经甲基化而生成.在不同的生物体内,中间产物尿苷脱氧核苷酸的获得途径主要有两种:一方面,UDP在核糖核苷酸还原酶的作用下生成dUDP,再在核苷二磷酸激酶的作用下生成dUTP;上一页下一页返回12.2核苷酸的合成另一方面,CDP在核苷酸还原酶作用下生成dCDP,再在核苷二磷酸激酶作用下生成dCTP,dCTP在脱氢酶作用下也可生成dUTP.dUTP脱磷酸生成dUMP,dUMP在胸腺嘧啶核苷酸合酶(thymidylatesynthase)的作用下由N５,N１０-亚甲基四氢叶酸提供亚甲基后生成dTMP.反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成２.脱氧核糖核苷酸合成的调节DNA合成的前体是dATP、d-TP、dCTP和dTTP四种dNTP,脱氧核糖核苷酸的合成需要精细的调节,一方面需要调节核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的供求关系;另一方面,四种dNTP要维持平衡,缺少任一种dNTP都是致命的,而一种dNTP过多也可致突变,因此,保持dNTP的适当比例也是细胞正常生长所必需.四种dNTP的合成水平受到反馈调节,各种dNTP通过别构效应调节不同脱氧核糖核苷酸生成.因为,某一种特定NDP经还原酶作用生成dNDP时,需要特定NTP的促进,同时受到另一些NTP的抑制.通过这种调节方式使四种dNTP保持适当的比例,维持细胞的正常生长和代谢.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成12.2.4三磷酸核苷酸的合成核苷酸的最主要功能是构成核酸,生物体内包括DNA和RNA两大类,而合成DNA和RNA的原料一般为三磷酸核苷酸,即dNTP和NTP.因此,核苷酸合成过程中,三磷酸核苷酸物质的生成对于生物体内DNA和RNA的合成特别重要.DNA和RNA合成中所需要的三磷酸产物主要包括ATP、-TP、CTP、UTP、dATP、d-TP、dCTP、dTTP.其中三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(-TP)、三磷酸尿苷(UTP)的合成过程是相似的,都是在核苷一磷酸激酶(nucleosidemonophosphatekinase)的催化下生成二磷酸核苷酸(ADP、-DP、UDP).上一页下一页返回12.2核苷酸的合成二磷酸核苷酸再在核苷二磷酸激酶的作用下生成三磷酸核苷酸(ATP、-TP、UTP),这两步反应均需要消耗能量.反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成三磷酸胞苷酸(CTP)的合成主要是在UTP的基础上氨基化生成的.细菌中,UTP直接与氨作用,从而生成CTP;而动物中,UTP和谷氨酰胺在CTP合酶催化下,消耗能量ATP,由谷氨酰胺提供氨基生成CTP.反应过程见嘧啶核苷酸的合成过程,反应式如下:三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP、d-TP、dCTP是核糖核苷酸还原酶催化下生成dADP、d-DP、dCDP后,在核苷二磷酸激酶的作用下生成dATP、d-TP、dCTP.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成三磷酸胸腺核苷酸(dTTP)胸腺嘧啶核苷酸主要是由尿嘧啶脱氧核苷酸经甲基化而生成dTMP后,再在核苷一磷酸激酶和核苷二磷酸激酶的作用下形成的.反应式如下:12.2.5辅酶核苷酸的生物合成生物体内核苷酸合成核酸,这是核苷酸最主要的功能.除此之外,核苷酸还有一种重要的功能,即组成辅酶,因此,辅酶核苷酸的合成也具有重要意义.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成有些辅酶核苷酸可在生物体内自由存在,如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸及辅酶A.１.烟酰胺核苷酸的合成烟酰胺核苷酸主要包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶Ⅰ,NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ,NADP).作为脱氢酶的辅酶,烟酰胺核苷酸主要在生物氧化还原系统中起着传递氢的作用.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成的原料主要有烟酸、５-磷酸核糖焦磷酸、ATP、谷氨酰胺.合成过程为:烟酸与５-磷酸核糖焦磷酸在烟酸单核苷酸焦磷酸化酶(nicotinatemononucleotidepyrophosphorylase)的作用下生成烟酸单核苷酸,随后烟酸单核苷酸和ATP结合生成脱酰胺-NAD,催化该步反应的酶为脱酰胺-NAD焦磷酸化酶(deamido-NADpyrophosphorylase),最后脱酰胺-NAD与谷氨酰胺,在NAD合成酶(NADsynthetase)作用下生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,同时消耗ATP.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸化后即转变为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,催化该反应的酶为NAD激酶(NAD-kinase),上一页下一页返回12.2核苷酸的合成反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成２黄素核苷酸的合成黄素核苷酸主要包括黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD).作为脱氢酶的辅酶,黄素核苷酸主要在生物氧化还原系统中起着传递氢的作用.黄素核苷酸合成的原料主要是核黄素和ATP,反应过程为:核黄素和ATP在黄素(flavokinase)的作用下,生成黄素单核苷酸,黄素单核苷酸和ATP又在FAD焦磷酸化(FADpyrophosphorylase)作用下生成FAD.反应式如下:上一页下一页返回12.2核苷酸的合成３.辅酶A的合成辅酶A主要以泛酸、半胱氨酸和ATP为原料合成,合成过程包括:第一步:泛酸与ATP在泛酸激酶(pantothenatekinase)作用下生成４′-磷酸泛酸.第二步:４′-磷酸泛酸与半胱氨酸在磷酸泛酰半胱氨酸合成(phosphopantothen-ylcysteinesynthetase)催化下生成４′-磷酸泛酰半胱氨酸.第三步:４′-磷酸泛酰半胱氨酸在４′-磷酸泛酰半胱氨酸脱(phosphopantothen-ylcylcysteinedecarboxylase)催化下脱羧生成４′-磷酸泛酰巯基乙胺.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成第四步:４′-磷酸泛酰巯基乙胺与ATP在脱磷酸辅酶A焦磷酸化酶(dephospho-CoApyrophosphorylase)催化下生成脱磷酸辅酶A.该反应是唯一的可逆反应.第五步:脱磷酸辅酶A与ATP在脱磷酸辅酶A激酶(dephospho-CoAkinase)催化下最终生成辅酶A.上一页下一页返回12.2核苷酸的合成反应式如下:上一页返回12.3DNA的复制和修复12.3.1DNA聚合酶DNA合成的原料为脱氧核糖核苷酸,它们在DNA聚合酶的作用下聚合而成.DNA聚合酶全称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase),一般简称为DNA-pol.DNA聚合酶主要包括两种活性:一是５′-３′的聚合活性,主要是通过聚合反应,将脱氧核糖核苷酸进行聚合;二是核酸外切酶活性,其中核酸外切酶活性又包括３′-５′外切酶活性,主要是从３′端水解DNA链,作用主要是辨认错配的碱基对,并将其水解,而５′-３′外切酶活性,主要是能从５′端水解DNA链,主要作用是能切除突变的DNA片段.下一页返回12.3DNA的复制和修复

１.大肠杆菌DNA聚合酶目前在大肠杆菌中主要含有五种DNA聚合酶,分别为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,其中主要的三种聚合酶特征见表１２-１.２.真核生物DNA聚合酶真核细胞主要包括５种DNA聚合酶,分别为DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε.DNA聚合酶α位于细胞核,主要起引发作用,不具有５′→３′外切酶活性,主要负责染色体DNA的复制.DNA聚合酶β位于细胞核内,主要参与修复过程.DNA聚合酶γ在线粒体内参与线粒体DNA的复制;DNA聚合酶δ位于细胞核内,具有５′→３′聚合活性及３′→５′外切酶活性;DNA聚合酶ε位于细胞核内,主要与DNA损伤修复有关.各种聚合酶的基本特征见表１２-３.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

３.复制中其他的酶因子除了DNA聚合酶外,DNA复制过程还需要其他酶蛋白因子的作用,主要包括解螺旋酶、拓扑异构酶、引物酶、连接酶及单链结合蛋白.这些蛋白因子在DNA复制过程中起着不同的作用.解螺旋酶(helicase)主要利用ATP供能,作用于氢键,使DNA双链解开成为两条单链.引物酶(primase)主要是在复制起始时催化生成RNA引物的酶.单链DNA结合蛋白(sin-lestrandedDNAbindin-protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)是存在于细胞核内的一类酶.其既能水解,又能连接磷酸二酯键,它能催化DNA链的断裂和结合,从而控制DNA的拓扑状态.拓扑异构酶主要包括两种类型:拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中的一条链,使DNA解链旋转不致打结,适当时候封闭切口,DNA变为松弛状态,反应不需ATP;而拓扑异构酶Ⅱ则切断DNA分子的两条链,断端通过切口旋转使超螺旋松弛,需要利用ATP供能.DNA连接酶(DNAli-ase)连接DNA链３′-OH末端和相邻DNA链５′-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链.DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用,在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用,同时也是基因工程的重要工具酶之一.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

12.3.2DNA的半保留复制DNA作为遗传信息的载体,具有两条反向平行的脱氧核糖核苷酸链,两条链之间以氢键连接形成双螺旋结构模型.Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型时即推测,DNA在复制时两条链之间的氢键断裂,两条链解连成单链,然后以每条单链为模板各自合成一条新的DNA链,这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA,另一条链是新合成的,这种复制方式为半保留复制.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

12.3.3DNA的半不连续复制一般将生物体基因组中能独立进行复制的单位称为一个复制子(replicon).一般真核生物具有多复制子,而原核生物一般是单复制子.复制子进行复制时,一般有一个固定的复制起点(ori-in),无论是真核生物还是原核生物,进行复制时均是从复制起点开始进行复制的.复制开始时,DNA双链解螺旋成为单链,分别以其为模板进行复制,此时形成的DNA结构就像个叉子,因此叫作复制叉(replicationfork).大多数DNA复制的方向是双向复制,有两个复制叉,少数进行单向复制,只有一个复制叉(图１２-２０).上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

DNA双螺旋由两条方向相反的单链组成,复制开始时,双链打开,形成一个复制叉,两条单链分别做模板,各自合成一条新的DNA链.由于DNA一条链的走向是５′→３′方向,另一条链的走向是３′→５′方向,但生物体内DNA聚合酶只具有５′→３′的聚合活性,只能催化DNA从５′→３′的方向进行新链的合成.因此,以３′→５′方向的母链为模板时,复制合成出一条５′→３′方向的新链方向与聚合酶的聚合活性一致,因此,这条新链沿着解链的方向前进,前进方向与复制叉打开方向是一致的,因此这条链的合成是连续进行的,这条链称为前导链(leadin-strand).上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

而另一条母链DNA是５′→３′方向,以它为模板时,新链的方向为３′→５′.沿着解链的方向,聚合酶不能发挥５′→３′的聚合活性,因此该链在复制过程中首先进行解链,当达到一定的长度时,在沿着与解链方向相反的方向,合成许多条５′→３′方向的短链,这条链也叫作随从链(la--in-strand).随从链复制只能先以短片段的形式合成,最后再将多个片段连接成一条完整的链.这种现象是在１９６８年,由冈崎(Okazaki)及其同事在研究大肠杆菌中的噬菌体DNA复制情形时发现的,因此这些片段就叫作岗崎片段(Okazakifra-ments).上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

一般原核生物岗崎片段含有１０００~２０００个核苷酸,而真核生物冈崎片段一般有１００个核苷酸.因此,在DNA复制过程中,由于前导链的合成是连续进行的,而随从链的合成是不连续进行的,所以DNA的复制是半不连续复制(图１２-２１).12.3.4原核细胞与真核细胞的DNA的复制DNA复制体系中主要包括dATP、d-TP、dCTP、dTTP、聚合酶、模板(template)、引物(primer)及其他的酶及蛋白质因子.参照模板DNA母链,加载引物后,在聚合酶和其他的酶及蛋白因子的共同作用下,利用底物dNTP,按照５′→３′方向进行聚合反应,不断形成新的磷酸二酯键,从而合成DNA新链,完成DNA的复制.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

无论是真核生物还是原核生物,DNA复制过程大致都经历三个阶段,即复制的起始、DNA链的延伸和复制的终止,但真核生物和原核生物复制过程也有所不同,具体复制过程如图１２-２２所示.2.真核生物DNA的复制过程在真核生物细胞中,DNA复制只是细胞周期的一部分,它只在S期进行.第一批复制子的激活标志着S期的开始.在之后的几个小时里,其余的复制子相继启动.真核生物的复制子相对较小,其长度为４０~１０００碱基对.真核生物DNA复制和原核生物DNA复制基本过程相同,前导链持续合成,滞后链分段合成,但复制时所需要的酶和蛋白因子存在一定的差异.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

真核生物每个染色体有多个起始点,是多复制子复制.复制有时序性,即复制子以分组方式激活而不是同步启动.真核生物复制起始时,DNA聚合酶α(DNA-polα)具有引物酶活性,合成一段引物,即能起始前导链和后随链的合成,为新链合成提供３′-OH.DNA聚合酶δ主要负责DNA复制的酶,起到延长子链参与前导链和后随链的合成的作用,DNA-聚合酶δ同时具有聚合酶活性和解螺旋酶活性,真核生物的DNA聚合酶δ和细菌DNA聚合酶基本性质相同,均以dNTP为底物,需M-２＋激活,聚合时必须有模板链和具有３′-OH的引物链,链的延伸方向为５′→３′,上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

但真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性.同时,DNA-聚合酶δ作用需要增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearanti-en,PCNA)的辅助作用,PCNA相当于β亚基,形成环状夹子,与DNA-聚合酶δ结合后增加聚合酶的持续合成能力.DNA聚合酶ε与后随链合成有关,在DNA合成过程中对核苷酸切除及碱基的切除修复中起着重要的作用,相当于原核生物的DNA聚合酶Ⅰ.与原核生物环状DNA不同,真核生物滞后链冈崎片段上RNA引物的去除分为两步:首先,一种可特异性切除DNA-RNA杂合底物的RNA酶H１发挥核酸内切酶的活性,在靠近RNA与DNA的连接处切开引物,由具备５′→３′核酸外切酶活性的FEN１蛋白降解RNA片段.最后,由DNA连接酶将相邻的冈崎片段连接起来.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

真核生物染色体DNA呈线状,复制时,前导链可连续复制,直到模板链的末端,释放出完整的子代染色单体,而后随链以不连续的方式复制,染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物,去除后留下空隙.因此,真核生物能够通过形成端粒结构来完成５′端部分DNA链的复制,以免该链子代DNA的５′端序列逐步缩短.端粒(telomere)是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其共同特点是一条链上富含T、-短序列的多次重复,而其互补链上富含A、C.维持染色体的稳定性,防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

主要作用是维持DNA复制的完整性,防止染色体结构基因在复制时丢失,解决了末端复制的难题.端粒的形成需要端粒酶(telomerase)的催化,端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体,具有端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)、端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein１,hTP１)、端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)活性.12.3.5逆转录作用１.逆转录作用上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

双链DNA是大多数生物的遗传物质.生物体中大多数是以DNA为模板来合成子代DNA的,即DNA指导下的DNA合成.但在某些病毒中,其遗传物质是RNA而不是DNA,因此它的复制方式是以RNA为模板合成DNA,即RNA指导下的DNA合成,其合成方向(RNA→DNA)与转录过程(DNA→RNA)相反,因此称为逆转录(reversetranscription).逆转录也可称为反转录,是一种特殊的复制方式.２.其他复制方式滚环复制(rollin-circlereplication)是某些低等生物的复制形式.D环复制(D-loopreplication)是线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)的复制形式.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

12.3.6DNA的损伤与修复DNA作为遗传信息的载体,是生命赖以生存的基础,维持DNA分子的完整性对生物体至关重要.一般来说,由于遗传物质结构的改变而引起的遗传信息改变,称为突变.从分子水平来看,突变就是DNA分子上碱基的改变.在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdama-e).众多生物内外环境因素都可能引起DNA分子的损伤,一方面有些突变或DNA的损伤可能影响细胞的功能或生存,导致疾病,甚至死亡,因此,在进化过程中细胞修复DNA损伤的能力非常重要,这是保持遗传稳定性的重要机制;另一方面,从漫长的进化机制来看,突变又是进化的分子基础.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

１.DNA的损伤造成DNA损伤的因素有生物体内自发的,也有外界许多的物理化学元素.(１)自发因素(２)物理因素(３)化学因素２.DNA损伤的类型根据DNA分子的改变,突变主要有以下几种类型:上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

(１)点突变(pointmutation):指DNA上单一碱基的变异.其中嘌呤替代嘌呤(A与-之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transverion).很多疾病的发生就是由点突变引起的,如镰刀型红细胞贫血.(２)缺失(deletion):指DNA链上一个碱基或一段核苷酸链乃至整个基因的消失.如有些地中海贫血、生长激素基因缺失等.(３)插入(insertion):指一个碱基或一段核苷酸插入到DNA链中.在为蛋白质编码的序列中,如缺失及插入的核苷酸数不是３的整倍数,则发生读框移动(readin-frameshift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frameshiftmutation).上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

(４)倒位或转位(transposition):指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置或从一处迁移到另一处.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

３.DNA修复DNA修复(DNArepairin-)是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新执行它原来的功能;但有时并不能完全消除DNA的损伤,只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而继续生存.也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这种修复功能,就无法对付经常发生的DNA损伤事件,就不能生存.所以,研究DNA修复也是探索生命的一个重要方面,并且与军事医学、肿瘤学等密切相关.对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

(１)直接修复这是最早发现的DNA修复方式.直接修复中光修复最常见,光修复是由细菌中的DNA光修复酶(photolyase)完成的,此酶能特异性地识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体,并与其结合,这步反应不需要光;结合后如受３００~６００nm波长的光照射,则此酶就被激活,将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体,然后酶从DNA链上释放,DNA恢复正常结构.后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中,人体细胞中也有发现.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

(２)错配修复(mismatchrepair,MMR)上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

错配修复是细胞复制后的一种修复机制,起维持DNA复制保真度、控制基因变异的作用.MMR系统广泛存在于生物体中,不同生物MMR系统有不同的组成成分和修复机制.Dam甲基化酶可使DNA的-ATC序列中腺嘌呤N６位甲基化的链切除,并以甲基化的链为模板进行修复.即NDA的半甲基化可区别子链与母链,使子链中的错配碱基被切除修复机制去除.(３)切除修复(excisionrepair)切除修复是修复DNA损伤最为普遍的方式,对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用.上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中,也是人体细胞主要的DNA修复机制.每个细胞都有一类DNA糖苷酶(DNA-lycosylase),现知至少有２０种不同的DNA糖苷酶,各具特异性.每一种酶能识别一种DNA分子中改变的碱基,能水解该改变的碱基与脱氧核糖间的糖苷键,使改变的碱基脱落,在DNA上产生一个缺失嘌呤或缺嘧啶的位点(apurinicorapyrimidinic-site,APsite),再通过切除修复机制进行修复.(４)重组修复(recombinationalrepair)在进行DNA复制时发生DNA损伤,此时DNA两条链已经分开,上一页下一页返回12.3DNA的复制和修复

其修复通过以下步骤进行:①受损伤的DNA链复制时,产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口;②另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换,将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处,而母链DNA出现缺口;③以另一条子链DNA为模板,经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口,最后由DNA连接酶连接,完成修补.(５)SOS修复SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式,修复结果只是能维持基因组的完整性,提高细胞的生成率,但留下的错误较多,故又称为错误倾向修复(errorpronerepair),使细胞有较高的突变率.上一页返回12.4RNA的生物合成的加工12.4.1转录RNA的复制:DNA指导下RNA的合成１.不对称转录转录时需要模板DNA链,但是只是以DNA一条链上的某一区段为模板进行转录,因此将DNA分子上转录出RNA的DNA区段称为结构基因(structural-ene).合成的RNA中,如只含一个基因的遗传信息,称为单顺反子;如含有几个基因的遗传信息,则称为多顺反子.DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链称为模板链(templatestrand),也称作反义链或负链或Watson链,相对的另一股单链是编码链(codin-strand)或有义链,也称为正链或Crick链.下一页返回12.4RNA的生物合成的加工

DNA转录成RNA时进行的是不对称转录(asymmetrictranscription).所谓的不对称转录,包含了两方面含义:一是在DNA分子双链上某一区段,一股链用作模板指引转录,另一股链不转录;二是模板链并非永远在同一条单链上.如图１２-３８所示.２.RNA聚合酶与RNA复制过程RNA聚合酶也称为转录酶,全称为依赖DNA的RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase,DDRP),DNA聚合酶启动DNA链合成时需要合成引物,而RNA聚合酶不需要引物,可直接启动RNA合成.上一页下一页返回12.4RNA的生物合成的加工

12.4.2RNA的复制:RNA指导下的RNA的合成DNA指导下的RNA合成是生物界RNA合成的主要方式,但有些生物像某些病毒的遗传信息贮存在RNA分子中,当它们进入宿主细胞后,靠复制而传代,因此它们进行的是RNA指导下合成RNA分子,也称为RNA复制.当以RNA为模板时,在RNA复制酶的作用下,按５′→３′方向合成互补的RNA分子,但RNA复制酶中缺乏校正功能,因此RNA复制时错误率很高.RNA复制酶只对病毒本身的RNA起作用,而不会作用于宿主细胞中的RNA分子.病毒RNA复制的几种方式:上一页下一页返回12.4RNA的生物合成的加工

①含正链RNA(＋)的病毒,例如噬菌体Q:(＋)RNA充当mRNA合成蛋白,以(＋)RNA为模板复制合成(－)RNA,再以(－)RNA为模板合成(