pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体的制备

页，共37页第1章绪论纳米药物载体纳米材料主要是指结构基本单元没有超出纳米尺寸(1~100nm)范围的材料，其表面积比较大，表面能也比较高，这些特殊的结构性能赋予了纳米材料优越的性能，例如尺寸效应、表界面效应以及光电磁热效应[1]等等，使纳米材料在医药学领域方面展现了优越的应用价值。近几十年来，纳米技术在生物医学领域产生了巨大的影响[2]。纳米药物载体有多种利用途径，并且能够有效可行地提高药物利用度，使其备受科学家的青睐，在医学领域备受瞩目。仅仅很短的时间里，纳米医药开始在全球市场上占了很大的位置[3]，其中多功能纳米粒子是今后生物医学领域里的主流研究之一，被广泛应用于多模成像、热成像和图像引导疗法[4]。在化验领域里，无论是过敏反应还是各种细菌感染，甚至于严重的阿尔海默综合征以及良恶性肿瘤的检测，都能够看到纳米技术的身影，可以有效缩短检测时间并且降低检测成本，为抢救生命赢得更多的时间。纳米载体具有高效率和高容量的特点，因此被应用于疾病目标确证的快速检验工作当中，除此之外，在检测和诊断基因突变或者个体差异的DNA或RNA时也应用了纳米技术，研究进程得以缩短。金属纳米颗粒具有超顺磁性，凭借该特性，仅需3h即可将被测者血液样本当中90%的致命病原体进行正确的诊断，因此该技术被应用于败血症和念珠菌感染的快速诊断当中，不仅可以降低检测成本，更节约了检测时间。当前医学使用光学成像法对疾病进行诊断，其存在着一定的局限性，而使用纳米检测技术平台能够改善这一局面，并且可以准确地检测到循环中的肿瘤细胞，循环状态下的肿瘤细胞会产生十分细微的转移，使用当前的肿瘤筛查检测无法难以对其进行有效的检测，因此需要纳米检测技术解决这一难题。在过敏原的检测当中，过去常用的检测方式包括皮肤点刺实验和常规过敏源检测，但是存在效率低下而且患者的依从性相对较差等问题，生物纳米传感器技术的应用改善了这一局面。纳米材料在制药成药性方面有特别优势：1)可以有效的对药物的制剂学性质进行改善和优化，例如通过缩小其粒径，从而增加其溶解度；2)对药物的体内动力学参数进行调整和优化；3)能够明显使药物治疗指数得到提升，维持较高的生物活性，减少不良反应。普通小分子药物并不能输送至所有的位置，但是药物经过纳米药物运输系统就可以进行顺畅的传输，更加精准高效，且能降低用药成本和减少不良反应。传统的纳米载体无法经外部或内部刺激下在合适的浓度携带和释放药物，因此典型的纳米载体需要被修饰来变得智能。智能纳米载体具备以下优异性：第一，智能纳米载体能减少免疫系统的清除；第二，靶向递送药物；第三，能够响应刺激释放药物。使用多种类型的纳米颗粒能够搭建药物靶向载体体系，其特点是可以根据疾病的不同特点挑选最适合的药物载体类型，还可以根据治疗需要对纳米特征进行改善和调整，包括形状、尺寸、材料、表面功以及电荷等不同的因素，通过这一系列变化，能够有效地解决血液和口服系统的载药效果差和药物脱靶的问题，有效提高了药物输送效率，使治疗达到最佳效果。固然智能纳米载体在递送药物方面具有显著的优势，但是也存在一些局限性：第一，难以避免药物过早释放，导致毒副作用；第二，非靶向纳米载体导致病灶部位药物含量低，等等。这都是亟待解决的重要问题。随着纳米技术的不断进步与发展，纳米材料的安全性也逐渐引起了广泛的关注，世界各国政府都对纳米生物效应进行了专项研究。纳米材料的生物学效应和安全性研究不仅是生物医学领域中不可或缺的组成部分，也是纳米生物医药学应用领域需要应对的重大挑战。随着物质被分解得不断精细至纳米级的时候，其理化性质和生物学效应自然而然地会发生改变，比较常见的有生物代谢问题、尺寸效应以及表面效应等，即便是化学组成相同的纳米物质和常规物质，其生物效应也很可能会大有不同。然而纳米材料在实际的应用当中也可能会对人类的健康产生不同程度的危害，纳米病毒学基础研究是人类健康保护的首要屏障，通过大量研究后仍然存在许多迫切需要解决的问题。除此之外，这些新的药物载体系统仍然还有许多限制，例如，二氧化硅溶胶和药物的直接混合将导致药物的不均匀分散，并且药物的释放速率将受到样品批次的影响。脂质体载体稳定性差，易成网状内皮系统被清除，导致更少的药物到达病变区域。此外，还有研究表明，一些交联的壳聚糖微球的生物相容性较差。因此，理想的纳米药物载体体系应满足良好的生物安全性、稳定的结构以及缓控释性能等基本条件。目前无论是生物检测领域还是疾病的体外诊断工作中都普遍应用了纳米材料，比较常用的包括碳纳米材料、UCNPs、金纳米颗粒和半导体量子点等，但这些纳米材料的安全性都需要进一步提高，无论是重金属离子的毒性问题，还是尺寸和表面性质依赖的细胞毒性问题都需要高度重视，都是不可忽略的副作用。除此之外，纳米探针和纳米药物想要直接用于人体内部，其安全标准还需要不断的提高，应当同时对核心功能以及表面改性纳米材料的安全性进行全面的评估。现在，获批后应用于制备注射用纳米药物制剂的药物辅料非常少，仅有少数磷脂和磷脂衍生物以及人血清蛋白。在具体的治疗当中，虽然纳米药物的尺度效应具有一定的优势，但是必须要密切关注它和人体的组织细胞之间隐藏的排斥反应。此外，由于纳米药物制剂改变了原始药物在体内的分布行为，可能导致各种各样新型的不良反应致新的健康问题产生，所以这些都需要更加全面而深入的毒理学研究。介孔二氧化硅纳米载体纳米载体有很多种，比如脂质体、共聚物、介孔二氧化硅、有机硅纳米和碳材料等等，相比于其他纳米材料，介孔二氧化硅纳米载体(MSN)在过去几十年内已经被广泛应用于药物传输，MSN作为递药系统的载体具有很多优异特性[5]，大的比表面积和比孔容、表面数量众多的硅羟基、具有极高的稳定性和生物相容性，易修饰并且可生物降解等等特点[6-8]，使其未来有应用于临床诊断和治疗的潜力。但是目前来看，在临床治疗中仍然存在一些问题，比如当通过掺杂等方法提高介孔二氧化硅纳米材料的降解能力时，如何实现同时在肿瘤位置长期积累也是我们需要深入研究的问题。而且尽管介孔二氧化硅纳米材料展现出了良好的生物相容性，但是尚未明确它们在体内是否会有长期毒性，这些都是需要研究者继续探索和解决的问题。1.2.1发展历史纵观硅系介孔材料可知，其中发展速度最快的纳米材料就是MSN，其不仅具有介孔材料的特性，还具备纳米材料的特性，1992年美国科学家Kresge第一次合成含有介孔结构的二氧化硅分子筛，自此之后科学家们在合成时使用了多种模板，应用了各种方法，获得了结构特征各异的介孔二氧化硅材料。在2003年由Lai等人设计合成以MSN为载体的智能化递药系统，至今发展都十分迅速。这种系统一般使用各种化学实体(如纳米粒子、超分子聚合体和有机分子等等)在MSN的孔道两端或者内部，当体内环境因素改变刺激MSN的孔道打开，药物即可实现智能释放。在MSN智能递药系统的设计方案当中，除了常规的设计路线，还有很多非常独特的想法，目的是为了帮助介孔二氧化硅纳米药物可以在系统当中持续稳定的发挥作用。在纳米粒子外包裹一层亲水聚合物能够使循环时间得到有效的延长，常常使用聚乙二醇(PEG)包裹纳米粒子这样能够避免单核吞噬系统的清除，纳米粒子的表面可以用靶向配体进行进一步修饰。2016年Heidegger[9]在试验当中使用刚分离的原代小鼠体内的免疫细胞，评估MSN对其的功能和生物相容性，证明MSN既无毒又无炎症，是一种高效的药物载体。1.2.2制备方法及其结构90年代初期第一次出现相关报道描述用表面活性剂作为结构导向剂，应用于制备长程有序结构的介孔二氧化硅。随着对载药领域研究的不断深入，制备技术不断发展，MSN种类的不断增加，纳米粒子的形貌尺寸孔径等都可以被设计和控制。MSNs的合成方法有很多，常用的方法之一是模板法，用有机分子(主要是表面活性剂)为模板，有机和无机硅源推进界面反应，形成由二氧化硅包裹的规则有序的组装结构，然后使用煅烧加热或者溶剂萃取的方法将其中的材料进行去除，保留了无机骨架，最后形成有序的多孔纳米结构。除此之外，还有溶胶凝胶法、反向胶束法、水热合成法和共沉淀法等方法。图SEQ图\*ARABIC1模板法合成MSNs示意图[10]通过控制条件可以制备出不同类型MSN[11]，不同类型的纳米粒具有不同的特点，比如MCM-41的尺寸在20~500nm、孔径在2~10nm范围内可调；SBA-15具有较大的孔径(最大可达30nm)，较厚的孔壁(最厚可达6.4nm)[12]，易于去除模板剂，适合负载多肽蛋白类药物[13,14]。以应用最为广泛的典型介孔二氧化硅纳米材料MCM-41为例，最初使用的液晶模板和前驱体分别为表面活性剂十六烷基溴化铵(CTAB)和正硅酸四乙酯(TEOS)或者偏硅酸钠(Na2SiO3)，碱作为催化剂合成制备的。一旦CTAB的浓度超出了临界值将会自动组成胶束，二氧化硅前驱体分子在胶束的极性端表面凝结形成二氧化硅。将表面活性剂完全去除之后即可得到MCM-41型介孔二氧化硅纳米粒子。其表面积的最大值为700m2/g，孔道尺寸范围为1.6-10nm。另外，介孔二氧化硅纳米材料的合成方法和合成条件会严重影响其形貌和介孔通道。通过改变碳链的长度可以获得不同的形态(例如球形，椭圆形，杆状和管状等)的介孔二氧化硅纳米材料，这些颗粒的孔道结构也可能不同，包括六角形孔道和Moir6型螺旋通道等。此外，水热合成法由于其良好的产品性能、性价比较高，并且晶型容易控制等特点得到了普遍的应用。无论哪种制备方法都有各自的优缺点，因此在实际应用中，需要结合具体情况做出相应的选择，用最合适的制备方法制备我们需要的样品。二氧化硅和多种磷脂具有高度的亲和力[15]，可以很容易吸附在细胞表面从而内在化。抗癌药物大多有毒性，部分药物水溶性很差，因此通过药物载体系统避免药物活性提前消失，有利于药物的贮藏和运输，而具有良好缓释特性的介孔二氧化硅被广泛用于药物运载。MSN能够穿过细胞间隙，并通过最小的毛细血管和血脑屏障吸收，做到通过孔的打开来控制和缓慢释放客体分子，从而提高了药物的耐久性。MSN可以通过巯基、胺基通过硅烷偶联剂对介孔硅能物质表面进行改性，使改性材料具有环境响应和靶向性。进一步通过自组装、化学键合、包封等作用的介孔盖，构成一个“阀门”，药物可以被包封在介孔二氧化硅中空洞里，利用肿瘤细胞与正常组织生理环境的差异，在特定环境因素的调节下，复合药物载体通过质子化使用，手性分子扭转或化学键断裂打开“阀门”，使药物得以释放，达到定点定量，长期缓释的目的。MSN具有耐酸碱性、耐热性、易使其表面功能化、孔道排列独特、包封活性大、药物释放时间短、比表面积大、毒性低[16]等优点，是实用性很强的载体。1.2.3影响载药因素孔径、比表面积、孔容、孔结构类型、表面官能化和壳层厚度等都是影响介孔二氧化硅载体中药物递送效率的重要因素[17]。孔径和孔体积主要通过空间位阻影响药物的吸附和释放，比表面积和表面官能化主要通过增加活性部位点和药物与介孔二氧化硅之间的相互作用力来增加药物的吸附量，孔结构类型也会在一定程度上影响药物的吸附和释放，而对于中空介孔二氧化硅而言，其壳层厚度会影响药物的扩散能力从而影响了药物的负载和释放能力。药物的释放速率取决于孔径的大小，通常药物的吸附是通过将高浓度的药物溶液浸泡在介孔二氧化硅基质中来实现的，这种方法主要取决于基质的吸附特性。基质的孔径决定了可被吸附到孔中的药物分子的大小。孔径的减小将不可避免地导致药物吸附量和释放速度的减少，这与空间位阻效应的影响有关。药物负载量会随着比表面积的增加而增多，大量研究表明，比表面积是影响包含官能团的药物分子的亲水性和吸附能力的重要因素。具有更多硅羟基团的介孔二氧化硅可以有效地增加活性位点，进一步提高药物吸附量。药物和介孔之间的相互作用是表面吸附作用，但是药物和药物之间的静电相互作用可能会导致介孔孔道阻塞，所以孔容越大，药物的负载量就越大。研究证明，相互连接的介孔类型可以提供更顺畅的通风过程，笼状一维孔道结构比其他类型的孔结构能提供更高的药物吸附能力和更慢的药物释放速率，相对于无微孔的介孔二氧化硅，有微孔的存在释药性更强，可能是微孔的存在使不溶性药物以单个分子的形式被限制在孔中，从而允许药物的稳定释放。但当不存在微孔时，药物更容易结晶成稳定且不溶的水合物形式，导致药物释放的速度变慢。因此介孔二氧化硅的孔结构类型也是很重要的影响因素。通常药物分子和介孔二氧化硅会通过弱的非共价相互作用(例如氢键，静电相互作用和物理吸附等)相结合。因此，对其用合适的官能团进行修饰可以改善药物的吸附和释放性能。研究证明用磷酸酯硅烷做介孔二氧化硅的表面修饰可以更好地控制带正电荷的药物吸附与释放。对于中空介孔二氧化硅而言，壳层的厚度会影响药物的负载和释放能力，壳厚度越薄，限制药物扩散的能力就越弱，药物释放的百分比会显著增加。但空心尺寸的区别对介孔二氧化硅纳米药物载体的载药性能基本不会有影响，不同空心尺寸测定的药物释放百分量基本不变。1.3刺激响应型介孔二氧化硅因为MSN只能在特定的条件下释放药物，所以能够有效地提高药物治疗的针对性，减少用药量并降低药物的毒性和副作用。目前，已经研究了多种刺激反应机制，使刺激响应型纳米载体可以对施加的刺激(例如pH，温度，还原剂，光，磁场等等)产生精准的响应并改变物理结构或化学性质，从而实现对药物递送和释放的控制。随着药物载体设计方面的研究不断发展，利用刺激响应性纳米粒子来实现实时定量地在肿瘤部位定点释放药物已在现实中成功实现。在智能施药领域当中，以pH响应为最主要的方法。1.3.1pH响应常见的环境响应方式中，以pH作为因素的研究最多，原因是许多生命活动都涉及pH的变化，人体正常的pH值为7.4[18]，而炎症和肿瘤组织的pH值分别为6.6和6.5～7.2，明显低于正常值，不一样的细胞组分间也存在跨膜pH梯度，而pH响应纳米载体能够精准智能释药的前提正是体内微环境的这些差异pH响应型介孔二氧化硅纳米粒的响应机制通常表现为两种[19]：第一种响应机制是在pH敏感材料的基础上实现的，用pH敏感的基团搭建载体，pH环境的变化会导致敏感基团发生不同变化，质子化或者去质子化改变了聚合物分子的解离程度，进一步改变聚合物链的水溶性，最终实现药物释放功能；第二种响应机制是通过pH敏感键实现的，借助于pH敏感键实现药物和MSN表面之间的连接，即使在弱酸的环境当中，药物也能够可控释放。一些具有pH敏感性的无机材料或聚合物也可以用于构建pH响应型MSN因此也可以使用这些材料搭建pH响应的，比较常见的此类材料包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氢氧化物、聚丙烯酸(PAA)、磷酸钙等等，它们都具有遇酸易溶解的特点，因此可以实现药物的释放。在一定条件下(特别是酸性条件下)，在MSN表面上固定芳胺/铵茎，并引入可移动的环状分子门来包围茎以控制负载的模型药物的传输[20]。2009年，Li[21]等人构建了β-环糊精(β-CD)和N-甲基苯并咪唑为基础的pH响应型MSN给药系统。XiaoX[22]等研究者用聚丙烯酸材料对MSN进行表面修饰，这样做的目的是为了是三氧化二砷的毒性得到减少，并且还可以对其药代动力学的相关参数进行优化，最终完成药物在酸性肿瘤微环境当中的释放。Rim[23]等人在研究当中使用磷酸钙对进行MSN表面装饰，当其处于细胞溶酶体pH的环境当中，磷酸钙溶解，实现客体抗癌药物的释放。Khosravian[24]等人研究设计的DTX/MSN-Met和DTX/MSN-FA(DTX/MSN-FA)具有较高的载药量和pH敏感的释药动力学，对乳腺癌具有明显的靶向给药作用，可降低剂量，提高细胞毒性，以实现对肿瘤细胞的有效抑制作用。此外，抵抗肿瘤还有其他的方法，内涵体/溶酶体处于酸性环境当中，因此在纳米载药系统的细胞质中，可以完成溶酶体的逸出，最终实现药物释放。举个例子，羧甲基壳聚糖和跨膜肽(TAT)的自组装包裹miRNA形成纳米颗粒，细胞溶酶体所处的环境pH=5.5，属于酸性环境，质子化反应发生之后，溶酶体迅速膨胀并逃逸，然后将miRNA释放于细胞质内部，有效实现对食道癌细胞增殖和迁移活动的抑制。在实际治疗中，药物对于pH的敏感响应和释放部位都是有要求的，比如口服给药[10]时希望纳米药物载体在肠道的碱性环境中释药，而在对人体进行肿瘤治疗的时候，通常希望药物在生理pH值环境当中不发生任何泄漏或者传递，直至到达肿瘤所处的酸性环境之后再进行药物的释放，一般情况下，以pH响应型纳米药物载体释药的pH响应点为2.0、5.0以及7.0，分别与胃酸、肿瘤组织以及正常组织的pH值相对应。此外，介于目的不同，纳米载体需要有特定的分子设计才能获得相应的释放机制，常见的有共价键引发的、分子间作用力以及物理结构引发的pH响应释药机制，其又继续细分到各种详细的类型来对应各种实际医疗情况。1.2.3其他响应除了pH响应方式外，其他的刺激响应方式也很受关注，比较常见的包括温度响应、酶响应、氧化还原响应、光响应、超声波响应、磁响应等等[18]。温度和pH一样，都是人体正常组织和癌变组织的重要差别因素，一般来说，病变组织的温度会比正常组织较高，构建温度响应的介孔二氧化硅纳米药物载体一般是在颗粒表面通过温敏性聚合物修饰实现的。当温度变化时，温度响应性纳米载体至少有一种组分会发生结构变化而引起相变，从而释放出所运载的药物。在理想条件下，温敏感的纳米载体可以在正常体温条件下保持药物的包封状态，但当加热到相变温度以上时，纳米载体的结构会破裂并导致药物的快速释放，以防药物被循环代谢和肿瘤清除。酶几乎在所有的生理活动中都发挥着基础作用，借助转基因、基因敲除或敲入动物模型，酶在生理和病理条件下的活性研究已经取得了显著进步。许多酶在肿瘤组织内可以高度表达，而在正常组织中相对较低甚至没有表达，所以酶响应药物递送的反应条件温和，特异性高并且对生物组织的伤害程度较低。[25]组织蛋白酶B能够在酸性的肿瘤细胞溶酶体中高度表达，还能够特异性地水解短肽(GFLG)。利用这一特性，可以将GFLG与MSN表面功能性配体进行连接，实现对纳米颗粒精准的靶向识别，而且处于肿瘤细胞溶酶体当中的GFLG还能够完全的被组织蛋白酶B水解，并释放其中所含的阿霉素，增强抗肿瘤活性。氧化还原响应的二氧化硅纳米载体通常采用二硫键分子做链接剂，利用有机分子或者无机纳米粒子(磁颗粒、金纳米颗粒和量子点)作为纳米塞，加入二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)等还原剂时，切断连接介孔颗粒和无机纳米塞的二硫键，颗粒表面的纳米塞脱落，介孔被打开，药物得以释放，所以氧化还原响应通常是不可逆的。光作为控制释放药物的响应因素也被重点研究。光照具有无创、易控制、可穿透性等特点，是控制释放领域近年来最受关注的刺激因素之一。目前，基于光刺激响应的介孔二氧化硅纳米载体的设计原理包括光刺激下二聚体和单体的转化，光诱导的顺反异构化，光或光敏剂引起的裂解反应以及光热效应等。[26]然而光触发响应也不是完美的，其缺点在于仅可以进行10mm左右的穿透，深度相对较低，这主要是因为人体软组织对不足700nm的紫外线/可见光能够进行比较强的散射。所以该方法只在人体浅表区域适用(眼睛和皮肤等)。因此，可以对长波长和双光子响应的新型光敏剂进行研究，将其和近红外激光(650-900nm)进行结合后发现，其组织渗透能够达到更深的层次，并且散射较弱，造成的人体组织损伤最小，由此可知，使近红外光触发受控释放载药的纳米载药系统具有广阔的应用前景。超声波具有无创和非电离辐射等优势，并且可以通过调节频率，占空比和超声时间来调节组织穿透的深度，因此它可以用作控制药物释放的外部刺激。[27]低频超声(频率在kHZ范围内)能够实现空化阈值，但是也可能因此诱导增强血管通透性，引起肿瘤细胞的转移和扩散。可以通过超声波和造影剂的相互作用使诊断所需的空化阈值有所下降。纳米微泡的不足之处在于短的半衰期，无法外渗等，这些都给其在组织靶向当中的应用带来了不利的影响。全氟化碳(PFC)纳米制剂在超声环境当中，可以发生空化作用蒸发产生微泡，经过一些列的改变实现药物准确地释放于肿瘤位置，能够显著的提高治疗效果，有效的控制肿瘤细胞的转移和扩散，除此之外，PFC还可以携带氧气，并在超声波的触发之下进行释放。磁场响应的特点表现为：在磁场恒定的前提下，能够对纳米材料进行定向介导，还可以利用交变磁场使人体的体温得到升高；或者将二者进行组合，最终得到纳米材料的磁响应，该材料在进入人体之后，借助于外源磁场作用能够对其进行磁性介导，通过分析实体瘤模型可知，能够获得较好的药物肿瘤富集效果。磁场响应的缺点主要表现为两个方面，一个是控释效果相对较差，另外一个是药物载量相对较低。这些不足之处可以通过下列方法进行改善：将药物分子和纳米载体借助于共价键进行偶联，使用纳米自组装将角鲨烯-吉西他滨共聚物覆盖于四氧化三铁纳米晶体的外表面，不仅可以有效的提高载药量，同时还可以避免爆炸性释药，针对白血病模型来看，其MRI成像功能得到了显著的提升，其化疗效果也得到了改善。在细胞基因转染方面，寡核苷酸主要通过磁性纳米载体进行运载，将四氧化三铁与跨膜肽-寡核苷酸复合物进行偶联之后得到的纳米粒子不仅具有非常高的生物相容性，而且与传统的跨膜肽-寡核苷酸复合物进行比较，其定向介导的转染率提高了4倍左右。[28]1.4pH响应介孔二氧化硅纳米载体优势及目前研究现状该载体的最大释药特点是可以调节媒介的pH值，其显著的优点是能够在微酸性的肿瘤环境中实现智能释药，并且可以增加药物在血液中循环的时间，使肿瘤位置的药物得以集聚。例如，在酸性的肿瘤环境当中，壳聚糖能够发生膨胀同时氨基质子化，促进了封存的肿瘤坏死因子α(TNF-α)可以进行快速的释放。当聚多巴胺-介孔二氧化硅纳米颗粒处于酸性(pH=5.0或6.0)环境中的时候，位于其表面的聚多巴胺涂层开始脱落，同时释放两亲性阳离子药物去甲丙胺地昔帕明(作用是对高血压、抑郁质以及恶性肿瘤等进行治疗)。通过苯甲醛表面官能化传统的介孔二氧化硅，将广谱抗癌药物阿霉素(DOX)载入内部，借助DOX和苯甲醛当中的氨基和醛基可以获得pH敏感的动态苯甲酰亚胺共价键，使药物本身变成了控制阀，形成了自我控制的针对肿瘤部位pH敏感的纳米药物输送系统，针对肿瘤的治疗来说，双重pH响应纳米载体能够更加智能化地调节。临床给药方面存在恶性肿瘤组织致密，部分区域血管缺如导致药物很难均匀分布等问题[29]，纳米载体的体内抗癌性能研究是一项十分复杂的工程，pH响应型的特点集中体现在两个方面，一个是载体修饰前后，另外一个是和单纯药物进行比较。一般情况下，免疫系统易将较大的纳米粒子清除[30]，当粒子的尺寸为100nm的时候，可以在人体内保持相对理想的分布和较优的清除集聚行为，而pH响应纳米载体的尺寸通常都在几至几百纳米之间，负载条件较好。相对于单纯药物来说，pH响应型纳米载体粒子可以在pH刺激作用下发生水解，或者导致其分子间作用力发生改变，在生物体系内可以更精准地释药，以抗癌药物吉西他滨为例，观察其在不同pH下的释放动力学，可以发现其在中性条件下“零释放”，在酸或碱性条件下，一定范围内可以做到酸性或碱性越强释放量越大，这种特殊性能让抗癌药物在体内的药物传输领域有十分广阔的实用前景。1.5本项目研究的提出癌症是长久以来一直被视作人类健康的头号杀手，在我国周朝时期和古埃及的历史当中都对这一疾病及所用的治疗手段进行过相关记载，然而并没有研究出有效的治疗方法。针对恶性肿瘤的预防和治疗是世界性问题，在上千年的历史长河中，无论是东方还是西方都无法对癌症治疗取得突破性进展，直到最近的一个多世纪才取得了卓越的进步。在传统化疗中，不少药物是基于癌细胞的生长速度快于健康细胞这一情况，所以主要针对的是不断分裂生长的细胞。其中阿霉素作为一种常用的抗癌药物，作用机理是通过自身与双链DNA结合，抑制细胞核内DNA复制，从而引发细胞凋亡[31]。但是由于部分正常细胞也是快速在生长的，所以用于化疗的药物也会攻击那些细胞，造成严重的副作用，导致常规化疗的失败[32]。此外，多重耐药性(MDR)使癌细胞能够通过发展对化疗药物的抗药性而逃避化疗的影响。因此在治疗过程中，传统的肿瘤化疗方法的缺陷和不足使临床治疗效率达到瓶颈，而癌症纳米医学的出现和发展为治疗提供了新契机。通过长期的研究，想要同时满足降低药物用量、增强药物疗效和减少药物毒性，最好的方法就是控制释放药物，《自然》杂志收录的一篇文章里就靶向治疗进行评述时说，“致癌基因的发现让我们能够研发出一种‘激光制导’的治疗方法——瞄准导致肿瘤细胞生长失控的基因靶点，集中火力进行致命打击。”[33]因此智能释药系统(SDDS)是我们期望实现的目标。在这里从以下三个方面介绍课题的研究目标；1)纳米载体，选用了介孔二氧化硅，原因是其具有优异的各项性能，是可以进行载体设计的良好纳米平台。2)靶向机制，通过EPR效应—实体瘤组织由于结构完整性差有着高通透性与滞留效应，一定尺寸的纳米颗粒选择性的聚集—实现的被动靶向，相比于主动靶向制备简易。３)刺激响应，Si-Fe-O键是具有pH响应性的，并且Fe是人体内必需的微量元素，以相对较低的剂量引入体内时，它将具有高度的生物相容性。因此本课题最终选择制备Fe掺杂的pH响应型介孔MSN，表征其形貌大小等方面，关注pH响应释药性能，进一步理解pH响应型介孔二氧化硅特性，熟悉相关实验流程及原理。基于功能化修饰的介孔二氧化硅纳米药物传递系统前景广阔，但是对于实际生活中临床应用出现的问题，需要持之以恒地进行研究，还需要不断的对细胞毒性、DNA损伤、致畸性、体内代谢过程进行更加深入的研究和详细的评估，进一步提高纳米药物的安全性和有效性。现如今，经过临床研究发现，药物载体系统的给药途径不再局限于注射，口服以及透皮吸收系统都具有较好的效果。与体外抗癌研究相比，将纳米载体应用于体内抗药的研究其复杂程度明显更高需要更加深入的研究。

第2章实验过程及方法2.1实验方案混合原材料混合原材料30℃下反应6小时过滤、干燥产物550℃下煅烧6小时得到产物物理表征测试体外pH响应释药性能载入DOX2.2实验材料所有化学药品均应按规定使用。表SEQ表\*ARABIC1实验材料试剂化学式规格正十八烷基三甲氧基硅烷C18TMS分析纯 正硅酸乙酯TEOS分析纯乙醇铁C6H15FeO3化学纯乙醇阿霉素(DOX)CH2COOHC27H29NO11分析纯/去离子水H2O/氨水NH3·H20分析纯磷酸盐缓冲溶液PBS/2.3实验仪器所用玻璃仪器均清洗干净，干燥后再在实验中使用。表SEQ表\*ARABIC2实验仪器仪器名称型号生产厂家玻璃器具/泰坦电子天平FA2004上海舜宇恒平仪器有限公司电热鼓风干燥箱101-1EBS北京市光明医疗仪器有限公司马弗炉旋涡混合器循环水真空泵pH计恒温水浴锅医用离心机超声波细胞粉碎机电动搅拌器/XH-BSHZ-DⅢPHS-3CHH-S双列八孔H1850JY92-IINJB90-S/江苏天翎仪器有限公司巩义市予华仪器有限公司上海仪电科学仪器股份有限公司长城湖南湘仪实验室仪器开发有限公司宁波新芝生物科技股份有限公司梅颖浦透射电子显微镜(TEM)JEM2100F日本电子株式会社扫描电子显微镜(SEM)氮气吸附脱附仪傅里叶红外光谱仪(FTIR)X射线光电子能谱(XPS)HitachiS-4800JW-BK224Nicolet6700PHIQuantera日本日立公司北京精微高博公司美国热电尼高力公司日美纳米表面分析仪器公司紫外可见分光光度计AgilentCary1000美国安捷伦科技公司2.4实验方法2.4.1制备pH响应介孔二氧化硅首先称量59mg乙醇铁，将其加入30mL乙醇中超声，直到充分溶解。在剧烈搅拌下将62.5µLC18TMS(模板剂)和132.5µLTEOS(硅源)滴加到由60mL乙醇、25mL去离子水和8.75mL氨水组成的混合溶液中，之后立即加入乙醇铁溶液，并将混合物在30℃下继续搅拌6小时。通过抽滤收集产物，并用去离子水洗涤三次，而后在40℃下干燥数小时。最后，将合成后的产物在550℃下煅烧6小时以除去模板，最后获得含铁的pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体2.4.2表征1)分别在5kV的HitachiS-4800型扫描电子显微镜和200kV的JEM-2100F透射电子显微镜下观察样品的形貌和大小。理想的铁掺杂MSN应当是大小均匀的球状颗粒，并且粒径在50nm左右，可以满足药物载体通过EPR效应在肿瘤处聚集的需要。透射电镜表征步骤：称取5mg样品于5mL乙醇溶液内，超声10min，使其分散均匀。而后用移液枪吸取液体，滴至电镜专用铜网上，待完全干燥。利用透射电镜观察样品，拍照记录清晰分散的图像用于之后分析样品形貌大小。2)通过在Nicolet6700光谱仪上收集的傅立叶变换红外(FTIR)光谱确定样品中的化学键和存在的无机物。除了介孔二氧化硅本身就存在的O−H、Si−O−Si等吸收峰，还应当出现Si−O−Fe的吸收峰，以证明铁掺杂二氧化硅的成功合成以及Fe所处位置。3)通过X射线光电子(XPS)分析样品表面元素成分，预计出现O、Si和Fe信号，同时可以计算出相应原子百分比，进一步表明样品中存在Si-O-Fe键。4)用氮气吸附等温线和相应的孔径分布表征Fe掺杂MSN在77.3K连续吸附条件下的介孔结构。用以证明其良好的介孔结构，得到比表面积与孔径分布信息，为样品载药性能提供支持。2.4.3载药本实验选择阿霉素(DOX)作为模板药物来评估样品的的载药量和释药行为。选用浸渍方法将DOX加载到样品中，首先，将样品和DOX分散在去离子水中，分别形成10mg/mL的分散液和10mg/mL的溶液。接着为了研究样品与DOX重量比对载药量的影响，将几个不同体积(0.1、0.125、0.25、0.5和1mL)的DOX溶液分别与1mL样品分散液混合，然后用去离子水稀释至4mL，将得到的混合物在室温且黑暗的条件下搅拌24h。最后将混合物以5000rpm的速度离心5分钟来收集装有DOX的样品，将其用去离子水洗涤3次。通过紫外可见分光光度计间接测量装载在样品中的DOX量(原理同释药部分所述)。则药物加载效率(DL)和药物截留效率(EE)通过以下公式计算：DL%EE%其中Wdox−L是加载到Fe-MSN中的DOX的重量，Wdox@MSn是DOX@MS的重量，Wdox−I是DOX的初始重量。2.4.4体外释药本实验通过使用紫外可见分光光度计来对体外释药能力进行测定。首先称取适量阿霉素溶解于无水乙醇中稀释，将得到的姜黄素标准品溶液在200nm-600nm波长范围内进行紫外扫描，记录下来紫外吸收图谱，即可得阿霉素的最大吸收波长480nm。再称取10mg姜黄素溶解于无水乙醇中，定容到100ml，得到姜黄素标准品储备液。在10ml的容量瓶中分别量取0.05、0.1，0.25，0.5，1.0毫升溶液，而后定容得到一系列不同浓度的标准溶液，分别测量其吸光度。而后以不同浓度药物的吸收峰面积为纵坐标，药物浓度为横坐标，绘制阿霉素标准曲线。采用透析法研究不同pH值(pH7.4、6.5、5.5、4.5)的PBS中的药物释放行为。将1mLDOX@Fe-MSN溶液(5mg/mL)转移到透析袋中。然后在37℃(模拟人体温度)的缓慢磁力搅拌下，将袋子浸入10mLPBS中。分别在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，36，48，72h时间点，抽取1mL释放液测定DOX释放量，同时补充等体积同pH值PBS。用紫外可见分光光度计测定释放液，将得到的吸收峰与所绘制的阿霉素标准曲线对照，得到相应DOX浓度。最后DOX的累积释放百分比(ARP)按以下公式计算：ARP%=Ci×10+其中n是从PBS中取出的释放液的总数，Ci是第i次释放液的药物浓度，W是透析袋中的初始DOX重量2.5试验设备工作原理2.5.1透射电子显微镜(TEM)透射电子显微镜(TEM)使用聚焦电子束作为光源，以透射电子作成像信号，可以获得亚埃级别的高分辨率。透射电子显微镜成像和衍射分析原理基于阿贝的二次成像原理，可以做形态分析和电子衍射分析。透射电子显微镜有分辨率、放大倍数和加速电压三种主要性能指标，分辨率是最重要的性能指标，分为线分辨率和点分辨率。放大倍数指的是样品区域的线性放大倍数，加速电压是决定电子枪发射的电子波长和能量的指标。透射电子显微镜主要用于观察普通显微镜所不能观察分辨的细微结构。图SEQ图\*ARABIC2透射电镜光路示意图[34]2.5.2扫描电子显微镜(SEM)扫描电子显微镜的工作原理是用非常细的电子束扫描样品，二次电子在样品表面被激发。电子由检测器收集，在电子装置中，闪烁器将其转换为光信号，然后由光电倍增管和放大器将其转换为电信号，以控制荧光屏上电子束的强度，并显示与扫描仪同步的扫描图像。扫描电镜有分辨率、放大倍数和景深三种主要性能指标，分辨率是指清除分开两个物体的能力，放大倍数是指电子束在荧光屏和在镜筒中的试样上最大扫描距离的比值，景深是指同等清晰度下样品平面沿光轴方向前后可移动的距离，放大倍数越大则景深越小。相比于透射电镜，扫描电子显微镜主要用哪个与观察固体表面形貌。图SEQ图\*ARABIC3透射电镜基本构造2.5.3紫外分光光度计紫外分光光度法是一种通过对特定波长或特定范围内的物质的吸光度或发光强度进行测量来对物质进行定性和定量分析的方法，具有快速、稳定、准确的优点。吸光物质含量与液体层厚度的乘积成正比。对于一般的紫外分光光度法，测量的相对误差为1％至3％。因为紫外分光光度法有准确度高、测定限制小、成本较低、操作简便等优点，现在成为了制药行业必不可少的检测设备之一。在药物标准中使用紫外分光光度法的项目包括吸收系数、溶解、纯度检查、含量测定和均匀性检查等等，在制药行业的现实生产中，紫外分光光度法应用最广泛的方面有药物含量测定、药物杂质检测、药物稳定研究、释放程度、药物负载行为测定和物质结构鉴定。2.5.4氮气吸脱附氮气吸脱附的原理主要是样品在气体体系中，遇到低温会发生物理吸附，吸附机制有很多种，一般来说，单层吸附，多层吸附和毛细管凝聚是常用的。但是氮气脱吸附的测定范围比较小，大部分的大孔都没法测定。一般采用Kelvin方程计算介孔孔径，公式是：γk=2.5.5傅里叶红外光谱仪(FTIR)傅里叶红外光谱仪的原理是，从泵等光源发射连续波长的红外光，红外光稳定且高强度，通过抛物面镜的反射后通过光阑，再经抛物面镜达到准直镜，此时反射出来的是平行干涉光，再经抛物面镜反射至样品室。当样品中的基团与红外光振动频率相同时就会产生共振，基团就会吸收此频率的远红外光，而收集到远红外光情况就得到了干涉图，再通过傅里叶数学变换处理得到光强，最后计算得到样品的远红外光谱图。2.5.6X射线光电子能谱(XPS)电子能谱分析是利用电子束等粒子照射材料，使样品表面的原子或电子受激发，收集其能量和能量分布，得到电子能谱进行分析，是一种直观且有效的方法。一般分为两大类，光电子能谱(XPS)和俄歇电子能谱(AES)。本实验选用X射线电子能谱，激发光源为X射线，将内层电子激发出来，然后测定电子的能量，以动能为横坐标脉冲为纵坐标做电子能谱图，则得到样品的表面元素成分。结论本篇论文研究了pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体，对其制备方法、表征手法和载药性能进行了研究。肿瘤位置的pH值比人体正常组织低，相比于传统药物，pH响应的介孔二氧化硅纳米药物载体可以更精确地释放药物，因此具有降低释药成本和加强治疗效果的优势。pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体的体内抗癌性能主要是修饰载体方面，相对于一般药物更有研究价值，以调节pH值为媒介，定点在肿瘤的微酸环境里智能释药，而且pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体尺寸为几纳米到几百纳米左右，不容易被生物体内的免疫系统清除，能够更有效率地载药。由于现实情况限制，本次课题的实验部分无法在实验室中进行研究，因此最后选择了着重于理论分析的实验方案探究。实验方案设计内容为先用经典的合成方法合成pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体，收集到样品后，分别用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察样品的形貌，再通过收集傅里叶变换红外光谱确定铁掺杂二氧化硅的合成以及铁的位置，然后通过X射线光电子分析样品表面元素成分，接着用氮气吸附法得到比表面积与孔径的具体信息，完成表征分析，最后使用阿霉素做模板分析载药性能，通过紫外分光光度计完成体外释药分析。虽然pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体备受科学家们的青睐，目前的应用前景十分广阔，但是此类介孔二氧化硅纳米还存在一些局限性和不确定性，比如难以控制药物的提前释放从而导致不希望产生的毒副作用。所以针对现实中的临床应用问题，还需要进行更全面的评估，目前依然是处于试验阶段。但相信纳米技术的不断进步之后，这些问题也会被一一解决，pH响应型介孔二氧化硅纳米药物载体在医学领域会有更广泛的应用，取得更大的成就。

致谢本学期开展了毕业论文的相关研究工作，本文的撰写是在导师何勇菊老师的悉心指导下完成的，论文的每一个细节都是在何老师的认真审阅和倾力指导下完成的，满含着何老师的心血。在课题的进行过程中，介于不可抗力因素我们无法直接做实验，虽然没有实验数据，但是在实验设计、材料分析等方面，何老师都仔细提出了许多有针对性的建议，颇具建设性，让笔者的论文更为有深度和内涵。何老师清晰明了的逻辑、深厚的知识底蕴和注重细节的高标准要求引导着我，帮助我顺利地完成了论文。她的教导让我受益匪浅，对我的学习和未来的人生方向都产生了深远影响。同时在实验和论文撰写过程中，得到了课题组里等众多师兄师姐的帮助，特别是肖振宇师兄，教会我如何使用实验室的各种仪器，同时给我的实验提出了许多启发性的意见和指导，在此对他们致以最诚挚的感谢。感谢我大学四年的室友赵晨、文钰嫣、周艺晗、谭嘉懿和刘佳雨同学，他们在生活中帮助我包容我，让我感到友情的珍贵。也感谢材料国际1601的全体同学这四年里带给我的欢乐和帮助，来自于五湖四海的同窗之情感念于心，。更感谢李周老师、章立钢老师和彭需发老师对我的谆谆教诲，不论是学习问题还是人生选择方面都提供了很有价值的建议，让我从迷茫中走出来。最后还要感谢在疫情期间陪伴我写论文、照顾我生活起居的家人，因为疫情原因我们长时间呆在家中无法出门，感谢他们不嫌弃我在家添的麻烦，是他们在我焦躁的时候安慰我鼓励我，为我提供了物质和精神的双重支援，做了我最坚强的后盾。有他们在我身边支持我，我才能不舍不弃地坚持下去。作者：丛心然2020年5月

参考文献毛宗万.纳米技术在生物医药中的应用及展望[J].药学进展,2019,43(05):321-323.JhaveriA,DeshpandeP,TorchilinV.Stimuli-sensitivenanopreparationsforcombinationcancertherapy[J].JournalControlRelease,2014,190:352-370.DhrubaJ.Bharali,ShakerA.Mousa.Emergingnanomedicinesforearlycancerdetectionandimprovedtreatment:Currentperspectiveandfuturepromise[J].Pharmacology&Therapeutics,November2010,128(2):324-335.TangC,AminD,MessersmithPB,AnthonyJE,Prad'hommeRK.PolymerDirectedSelf-AssemblyofpH-ResponsiveAntioxidantNanoparticles[J].Langmuir,2015,31(12):3612-3620.MuthusamiR,KesavanA,RamachandranV,etal.Synthesisofmesoporoussilicananoparticleswithalychee-likemorphologyanddualporearrangementanditsapplicationtowardsbiomimeticactivityviafunctionalizationwithcopper(II)complex[J].MicroporousandMesoporousMaterials,2020,294.MingHuiSun,ShaoZhuanHuang,LiHuaChen,etal.Applicationsofhierarchicallystructuredporousmaterialsfromenergystorageandconversion,catalysis,photocatalysis,adsorption,separation,andsensingtobiomedicine[J].ChemicalSocietyReviews.2016,45:3479-3563.G.Anbarasu,M.Malathy,P.Karthikeyan,R.Rajavel.SilicafunctionalizedCu(II)acetylacetonateSchiffbasecomplex:Anefficientcatalystfortheoxidativecondensationreactionofbenzylalcoholwithamines[J].JournalofSolidStateChemistry.2017,253:305-312.MalathyMoorthy,AnbarasuGovindaraj,BharathiMadheswaran,etal.Ni(II)‐IncorporatedMCM‐41Material‐HeterogeneousCatalystforC‐SandC‐NCrossCouplingReactions[J].ChemistrySelect.2016,1(15):4357-5073.HeideggerS,GößlD,SchmidtA,etal.Immuneresponsetofunctionalizedmesoporoussilicananoparticlesfortargeteddrugdelivery[J].Nanoscale,2016,8(2):938-948.唐玥,柯学.介孔二氧化硅纳米粒子药物递送系统研究进展[J].中国药科大学学报,2012,43(06):567-572.龚华梦.基于FRET的还原响应性介孔二氧化硅纳米载药体系的研究[D].湖北工业大学,2017:1-25.PiaopingYang,ShiliGaib,JunLin.Functionalizedmesoporoussilicamaterialsforcontrolleddrugdelivery[J].ChemSocRev.2012,41:3679-3698.HanshengHsueh,ChengtzuYang,JIZ,etal.FormationofTitaniumNitrideNanoparticleswithinMesoporousSilicaSBA-15[J].JournalofPhysicalChemistryB,2005,109(10):4404-4409.MoerzST,HuberP.ProteinAdsorptionintoMesopores:ACombinationofElectrostaticInteraction,CounterionRelease,andvanderWaalsForces[J].LangmuirtheAcsJournalofSurfaces&Colloids.2014,30(10):2729-2737.KilpeläinenM,RiikonenJ,VlasovaMA,etal.Invivodeliveryofapeptide,ghrelinantagonist,withmesoporoussiliconmicroparticles[J].JournalofControlledRelease.2009,137(2):166-170.DivyaGopalan,AbhijeetPandey,NayanabhiramaUdupa,SrinivasMutalik.Receptorspecific,stimuliresponsiveandsubcellulartargetedapproachesforeffectivetherapyofAlzheimer:Roleofsurfaceengineerednanocarriers[J].JournalofControlledRelease,2020,319:183-200.王婷婷.基于介孔二氧化硅的多功能纳米材料的制备及其在药物输送和荧光成像领域的应用[D].东北