植物基因工程

第八章

植物基因工程第一页，共七十四页。一、高等植物的遗传特性二、高等植物基因工程的发展历程

三、高等植物的基因转移系统四、转基因植物的基因鉴定五、植物基因工程的应用第八章

植物基因工程第二页，共七十四页。

植物的基本特征

遗传操作的简易性

整株植物的再生性

染色体的多倍体性一、高等植物的遗传特性第三页，共七十四页。植物的基本特征植物低等植物藻类地衣高等植物无根、茎、叶等分化器官合子不经胚直接发育为个体含根、茎、叶、花、果分化器官合子经胚再发育为个体苔藓门蕨类门裸子门被子门第四页，共七十四页。遗传操作的简易性

大多数高等植物具有自我授精的遗传特征，通常能产生大量的后代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。第五页，共七十四页。整株植物的再生性

植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，放在含有合适营养和植物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。第六页，共七十四页。整株植物的再生性

植物细胞具有纤维素构成的细胞壁，通常不能有效地吸收外源DNA。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。第七页，共七十四页。（四）染色体的多倍体性

很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物呈多倍体型，其染色体数目范围从24至144不等。这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异第八页，共七十四页。1983年美国和比利时首次将外源基因导入烟草和胡萝卜1994年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市1995年转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国投入生产2000年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。二、高等植物基因工程的发展历程第九页，共七十四页。

三、高等植物的基因转移系统Ti质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序植物细胞的直接转化程序植物原生质体的再生程序第十页，共七十四页。

几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤（冠瘿瘤），这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。（一）Ti质粒介导的整合转化程序Ti质粒的结构与功能第十一页，共七十四页。（1）Ti质粒的图谱区整个质粒160-240kb

T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱第十二页，共七十四页。转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。①T-DNA（transfer-DNA）左边界右边界生长素基因细胞分裂素基因冠瘿碱合成生长素基因:tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤;iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径.第十三页，共七十四页。tmt基因编码产物催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。在T-DNA的两端还含有左右2个边界，左边界(leftborder,LB)和右边界(rightborder,RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。第十四页，共七十四页。②毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，

进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。③Con区(regionsencodingconjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。④Ori区(originofreplication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。第十五页，共七十四页。①第一步:植物受伤植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、

羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。(2).农杆菌的感染和生存第十六页，共七十四页。②第二步

感染植物

第三步

毒性基因（vir）表达T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。virA、virG、virD、virB④第四步

T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。⑤第五步

诱导冠瘿瘤第十七页，共七十四页。第十八页，共七十四页。（6）第六步

土壤农杆菌代谢冠瘿碱。第十九页，共七十四页。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米

能够自发地整合到植物的染色体上。

能转化多种植物。

强启动子

(3).Ti质粒转化的对象(4).Ti质粒作为载体的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。第二十页，共七十四页。（5）T-DNA的染色体整合机制第二十一页，共七十四页。①野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；③tms和tmr基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；⑤无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。

(6).天然Ti质粒作载体的缺点第二十二页，共七十四页。（7）Ti质粒的改造除去生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；除去Ti质粒的其它非必需序列，最大限度地缩短长度；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。第二十三页，共七十四页。改造后的Ti质粒载体模式leftrightMCSAMProriVirselect第二十四页，共七十四页。9.Ti载体的类型（1）共整合载体（cointegratevectors）最早获得广泛应用的Ti质粒，是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的①pGV3850的特点：是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。第二十五页，共七十四页。第二十六页，共七十四页。外源基因插入pGV3850依赖于同源重组第二十七页，共七十四页。外源基因KanrpBR322土壤农杆菌含pGV3850植物组织卡那霉素筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素的土壤农杆菌外源基因表达鉴定转化插入感染pBR322与pGV3850重组整合到染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。第二十八页，共七十四页。共整合转化程序第二十九页，共七十四页。（2）双元载体（binaryvectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（<10kb）①双元载体的结构Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）第三十页，共七十四页。第三十一页，共七十四页。②双元载体的转化转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。1）基因插入2）帮助质粒（

helperplasmid）Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。第三十二页，共七十四页。左右外源基因双元载体Vir帮助质粒农杆菌Vir农杆菌左右外源基因感染植物转化左右外源基因进入植物细胞核，整合，表达E.coli第三十三页，共七十四页。第三十四页，共七十四页。双元系统的特点是两个质粒即穿梭质粒和Ti质粒，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒编码植物选择标记，表达信号，并具有位于两个T-DNA边界序列之间的用于外源基因的多克隆位点。双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒，具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的左右边界序列发生相互作用，从而将T-DNA转移进入植物基因组。

双元系统的特点第三十五页，共七十四页。第三十六页，共七十四页。（二）植物病毒介导的转染程序

病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种策略：第三十七页，共七十四页。二、植物病毒介导的转染程序

以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。1、转染植物细胞原生质体第三十八页，共七十四页。（二）植物病毒介导的转染程序

植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。

2、转染植物组织第三十九页，共七十四页。转染植物组织双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序第四十页，共七十四页。（三）植物细胞的直接转化程序1、枪击法

将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。第四十一页，共七十四页。2、电击法

将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。第四十二页，共七十四页。3、融合法

将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。

所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。第四十三页，共七十四页。4、花粉管导入法

将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物转基因研究。

特点是直接、简便。受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合难以建立再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。第四十四页，共七十四页。第四十五页，共七十四页。（四）植物原生质体的再生程序悬浮物离心除细胞碎片；将原生质体悬浮液滴在无菌滤纸片上，置于含有普通植物细胞（所谓的滋养细胞）的固体再生培养基，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散的植物生长因子及其它化合物；将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含有纤维素酶的缓冲液中保温；标准的高等植物原生质体制备和再生程序是：第四十六页，共七十四页。培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。第四十七页，共七十四页。植物原生质体的再生程序

第四十八页，共七十四页。第四节、转基因植物的基因鉴定转基因植物的基因鉴定方法1.表型2.选择压力-抗性基因3.PCR4.southern-blotting5.northern-blotting6.western-blotting7.后代遗传分析

第四十九页，共七十四页。转基因植物的southern-blotting分子鉴定第五十页，共七十四页。（一）利用转基因技术研究基因的表达与调控转报告基因研究植物基因的表达与调控报告基因（reportergene

）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

五、植物基因工程的应用第五十一页，共七十四页。报告基因条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。第五十二页，共七十四页。目前植物中常用的报告基因：（1）大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）

该酶能催化许多β–葡萄糖苷酯类物质的水解，将其与X–葡萄糖苷酸（X-gluc）保温，产生蓝色反应，借此可预测报告基因的表达程度。第五十三页，共七十四页。（2）昆虫的荧光素酶基因

昆虫荧光素和ATP以及表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。第五十四页，共七十四页。TPb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因GUS应答调控元件转录调控因子卤代葡萄糖醛苷酸X-gluc蓝色化合物荧光素酶报告基因GFP发射荧光昆虫荧光素第五十五页，共七十四页。（二）利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料1、转基因植物作为生物反应器的优势

植物易于生长，农田管理成本相对低廉。

植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似。

绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠。第五十六页，共七十四页。2、植物生物反应器生产医用蛋白（1）转基因烟草表达小鼠抗体：利用农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。从转基因烟草的叶子可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白总量的1.5%。实验结果表明，植物细胞的蛋白分泌系统能有效识别小鼠抗体前体的信号肽序列。第五十七页，共七十四页。第五十八页，共七十四页。高歇斯症(Gaucher'sdiseasa，GD)，又名葡萄糖脑苷脂沉积病，是溶酶体贮积病中最常见的一种。由于葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase，GBA)的活力明显降低，致使葡萄糖脑苷脂蓄积于单核-巨噬细胞及脑组织内，形成形态特异的高歇斯细胞，随病情发展并发血细胞减少、神经系统症状及骨骼病变等。（2）转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶hGC第五十九页，共七十四页。人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症（Gausher’sdisease）遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗2000-8000只人类胎盘，因此这种药物一直供不应求。美国VPI研究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。第六十页，共七十四页。3、利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂转基因烟草和马铃薯生产果聚糖

果聚糖是果糖的多聚体，可被人体肠胃中的微生物发酵，刺激双歧杆菌生长，释放短链脂肪酸进入循环系统，保健价值高。3-6聚体的果聚糖有甜味，是低能量的助甜剂，有助于降低体重，因此国际上果聚糖的销售量很大。荷兰科学家把果糖基转移酶基因导入烟草和马铃薯中，在获得的转基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有良好的开发前景。第六十一页，共七十四页。4、利用植物生物反应器生产工业原料转基因油菜生产月桂酸

首批用于大规模生产并取得巨大经济效益的非食用性转基因植物产品是工业用油，其中包括制造肥皂等去垢剂的十二碳月桂酸。油菜通常产生十八碳的不饱和脂肪酸，但只要在其体内表达另一个特殊的基因即可使转基因油菜合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。此外，鉴于油菜植物易生长且产量高的特点，人们还致力于用它来生产其它工业用油，如可作润滑油和尼龙生产原料的芥酸以及用于麦淇淋制作的6-十八碳烯酸等。第六十二页，共七十四页。（三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物产高品质产物的转基因植物第六十三页，共七十四页。1、控制果实成熟的转基因植物

蔬菜和水果成熟后，呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并导致果实皱缩和腐烂。控制细胞中乙烯合成速度，能有效延长果实的成熟状态及存放期。

植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。采用反义RNA技术封闭番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，转基因番茄的乙烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。第六十四页，共七十四页。乙烯生物合成机制S-腺苷甲硫氨酸第六十五页，共七十四页。2、抗病虫害的转基因植物

全世界每年因虫害损失数千亿美元。目前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂。不但严重污染环境，且诱使害虫产生相应的抗性。抗虫作物已占全球转基因的22％。外源基因：苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40种，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最广泛。第六十六页，共七十四页。第六十七页，共七十四页。3、抗除草剂