β-烟酰胺单核苷酸 纯度和含量测定-征求意见稿

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业协会归口（以下简称“归口方”），提出方和归口方拥有所创制的团体标准文本（含制定过程中的草

案）的著作权，受《中华人民共和国著作权法》保护。除法律所允许的情形或事先得到书面许可外，任

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联系电话/p>

联系邮箱：yuefenpeng@

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2

前言

本文件参照GB/T1.1-2020《标准化工作导则-第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则

起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利，本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。

本文件由中国检验检疫科学研究院综合检测中心提出，由中国中小商业企业协会归口。

本文件起草单位：

本文件主要起草人：

本文件为首次发布。

3

T/CASME012-2021

β-烟酰胺单核苷酸纯度和含量的测定高效液相色谱法

1范围

本文件规定了β-烟酰胺单核苷酸纯度和含量测定方法的术语定义、试剂和材料、仪器设备、标准

溶液配制、样品前处理、色谱条件、试样测试和结果计算。

本文件适用于以生物法生产而成的原料和成品中β-烟酰胺单核苷酸纯度和含量的测定方法。

2术语和定义

2.1β-烟酰胺单核苷酸

NMN（Nicotinamidemononucleotide）：全称“β-烟酰胺单核苷酸”，是一种自然存在的生物活性核

苷酸。NMN有2种存在形式，α和β；β异构体是NMN的活性形式。

2.2β-烟酰胺单核苷酸分子式、CAS号和分子量

2.2.1分子式：C11H15N2O8P

2.2.2CAS号：1094-61-7

2.2.3相对分子质量：334.22（按2016年国际相对原子质量）

2.3生物法

生物法是指以发酵、生物转化、酶法、细胞培养和生物提取为一种或多种组合手段为技术的生

产工艺。

3试剂和材料

以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯试剂。

3.1β-烟酰胺单核苷酸对照品：含量不低于98%（HPLC）。

3.2甲醇：色谱级。

3.3磷酸二氢钾。

3.4四丁基硫酸氢铵。

3.5氢氧化钾。

3.6一级水。

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4仪器设备

4.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或DAD检测器和柱温箱系统。

4.2色谱柱：C18ODS-BP5um4.6mmx250mm（或同等分析效果的色谱柱）。

4.3分析天平：最小分度值0.01mg。

4.4超声波溶解器。

4.5微孔过滤器。

4.6微孔滤膜：0.45μm。

4.7粉碎机。

5标准溶液配制

5.1标准储备液的制备：1000mg/L

准确称取100mg（精确至0.0001g）β-烟酰胺单核苷酸的标准品至100mL容量瓶中，用一级水

溶解，经超声处理使完全溶解，定容，经0.45um水系微孔滤膜过滤，滤液浓度为1000mg/L的标准

储备液。

5.2标准中间液的制备：250mg/L

准确移取25mL标准储备液（A.3.1）于100mL容量瓶中，用一级水稀释至刻度，配制成浓度

为250mg/L的标准中间液。

5.3标准工作液的制备

准确移取0、1、2.5、5、10、25mL标准储备液（A.3.2）于25mL容量瓶中，用一级水稀释至

刻度，配制成浓度分别为0、10、25、50、100、250mg/L的标准工作液。

6样品前处理

6.1原料样品：

称取100mg（精确至0.01mg）供试品至100mL容量瓶中，用一级水溶解，经超声处理使完

全溶解，定容，经0.45um水系微孔滤膜过滤，滤液为供试品样品溶液。

6.2成品样品：

6.2.1每粒成品净含量

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随机抽取10粒及以上的成品或其内容物进行称量（精确至0.01mg），按照所取数量求其平均

值，得到每粒成品样品的净含量。

6.2.2β-烟酰胺单核苷酸提取

称取内容物粉末或磨碎后样品约50mg（精确至0.01mg）至100mL容量瓶中，加入50mL一

级水，超声溶解20min，再用一级水定容至刻度，经0.45um水系微孔滤膜过滤，滤液移入液相进

样瓶中，待测。若样品测试浓度超出工作曲线范围，可适当稀释后再测。

7色谱分析条件

7.1柱温：30℃。

7.2检测波长：254nm。

7.3流动相A：称取13.6g磷酸二氢钾，2.7g四丁基硫酸氢铵溶于800mL一级水中，搅拌至全

溶。用氢氧化钾溶液调节pH至3.5±0.05，补水至1000mL，加甲醇64mL，搅拌均匀，最后用

0.45um微孔滤膜抽滤，超声脱气即可。

7.4流动相B：用量筒量取700mL甲醇用一级水定容至1000mL，超声处理后备用。梯度洗脱程序

见表1。

7.5进样量：10μL。

表1梯度洗脱程序

时间/min流速/（mL/min）B%

00.80

120.86

170.870

190.870

210.80

300.80

8试样测定

8.1原料样品

在色谱条件下，分别对标准储备液（5.1）和原料样品溶液（6.1）进行检测，记录色谱峰的面

积和保留时间。根据色谱峰的面积，以面积归一化法计算产品纯度，以单点外标定量法计算产品

的含量。

8.2成品样品

在色谱条件下，分别对标准工作液（5.3）和样品溶液（6.2）进行检测，记录色谱峰的面积和

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T/CASME012-2021

保留时间。根据色谱峰的面积，以外标法计算产品含量。

9结果计算

9.1原料样品

9.1.1纯度计算

试样中β-烟酰胺单核苷酸纯度按式(1)计算:

AT

P100%.................................................................（1）

A0

式中：P——原料中β-烟酰胺单核苷酸的纯度，单位为百分比（%）；

AT——原料样品溶液（6.1）中β-烟酰胺单核苷酸主峰面积；

A0——原料样品溶液（6.1）中所有峰的面积和。

9.1.2含量计算

试样中β-烟酰胺单核苷酸含量按式(2)计算:

CTV

X...........................................................（2）

m10000

式中：X——供试品中β-烟酰胺单核苷酸的含量，单位为百分比（%）；

CT——由单点定量外标法得到原料样品溶液（6.1）中NMN的浓度（mg/L）；

V——试样的定容体积（mL）；

m——试样的质量,单位为克(g)。

9.2成品样品

9.2.1每粒成品样品的净含量按式（3）计算

m

W总.......................................................................（3）

N

式中：W——每粒成品样品的净含量（g/粒）；

m总——称取所有数量成品的总质量（g）

N——称取所有成品的数量（粒）

9.2.2试样中β-烟酰胺单核苷酸含量按式（4）计算:

CVf

XW.......................................................（4）

m1000

式中：X——成品样品中β-烟酰胺单核苷酸的含量，单位为（mg/粒）；

C——样品溶液（6.2）中β-烟酰胺单核苷酸浓度（mg/L）；

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V——定容体积（mL）；

f——稀释倍数；

m——成品样品的称样量（g）；

W——每粒成品样品的净含量（g）。

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附录A

（资料性）

图1参考β-烟酰胺单核苷酸液相色谱图

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（EnglishVersion）

Determinationforβ-nicotinamideMononucleotideContentHigh

PerformanceLiquidChromatography

1.Scope

Thisdocumentstipulatesthetermsanddefinition,reagentsandmaterials,instruments,standardsolution

preparation,pre-treatmentforsamples,chromatographconditions,sampletestingandresultcalculationofthe

determinationmethodofβ-nicotinamideMononucleotide.

Thisdocumentisapplicableforthedeterminationmethodofβ-nicotinamideMononucleotidecontentin

rawmaterialsandfinishedproductsproducedwithbiologicalmethod.

2.Termsanddefinition

2.1β-NicotinamideMononucleotide

NMN（Nicotinamidemononucleotide）:Thefullnameis“β-NicotinamideMononucleotide”;itis

anaturallyexistedbiologicalactivenucleotides,existingin2formsofαandβ;βisomeristheactive

formofNMN.

2.2Molecularformula,CASNO.andmolecularmassofβ-NicotinamideMononucleotide

2.2.1Molecularformula:C11H15N2O8P

2.2.2CASNO.:1094-61-7

2.2.3Relativemolecularmass:334.22(aspertheinternationalrelativeatomicmassof2016)

2.3biologicalmethod

Biologicalmethodreferstotheproductionprocesswithfermentation,biotransformation,enzymatic

method,cellcultureandbiologicalextractionasoneormorecombinationmeans.

3.Reagentsandmaterials

Thebelowusedreagentsareallanalyticalreagentsunlessotherwisemarked.

3.1Referenceproductofβ-NicotinamideMononucleotide:Thecontentisnotlowerthan95%.

3.2Methanol:Chromatographygrade

3.3Potassiumdihydrogenphosphate

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3.4Tetrabutylammoniumhydrogensulfate

3.5Potassiumhydroxide

3.6Primarywater

4.Instrument

4.1Highperformanceliquidchromatography:equippedwithultravioletdetectororDADdetectorand

columnheatersystem.

4.2Chromatographiccolumn:C18ODS-BP5um4.6mmx250mm(orchromatographiccolumnwiththe

equivalentanalysiseffect).

4.3Analysisbalance:withtheminimalgraduationvalueas0.01mg

4.4Ultrasonicdissolver

4.5Microporefilter

4.6Microporefilteringmembrane:0.45μm

4.7Grinder

5.Preparationofstandardsolution

5.1Preparationofstandardstocksolution：1000mg/L

Accuratelyweigh100mg(preciseto0.01mg)standardproductofβ-NicotinamideMononucleotideand

dissolveitintoabottleof100mLcompletelythroughultrasonictreatment,makethevolumeconstant,filter

thesolutionwith0.45ummicroporefilteringmembraneforwatersystem,andconcentratethefiltrateinto

standardstocksolutionof1000mg/L.

5.2Preparationofstandardintermediatesolution：250mg/L

Accuratelyweigh25mLstandardstocksolution(A.3.1)anddiluteitintoabottleof100mLwith

primarywatertothescale,andprepareitintostandardintermediatesolutionwiththeconcentrationas

250mg/L.

5.3Preparationofstandardworkingsolution

Accuratelyweighstandardstocksolution(A.3.2)of0,1,2.5,5,10,25mLintobottlesof25mL

respectivelyanddilutethemtothescalewithprimarywater,andpreparethemintothestandardworking

solutionof0,1,2.5,5,10,25mg/Lrespectively.

6.Pre-treatmentofsample

6.1Sampleofrawmaterial

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Weight100mg(preciseto0.01mg)samplefortestingintoabottleof100mL,dissolveitwithprimary

watercompletelythroughultrasonictreatment,makethevolumeconstant,andfilterthesolutionwith

0.45ummicroporefilteringmembraneforwatersystem.Theobtainedfiltrateisthesolutionofthesample

fortesting.

6.2Sampleoffinishedproduct

Weightabout50mgofthefinishedproductpowderorsampleaftergrinding(preciseto0.01mg)and

dissolveitintoabottleof100mLwith50mLofprimarywaterfor20minthroughultrasonictreatment,and

makethevolumeconstanttothescalewithprimarywater,filterthesolutionwith0.45ummicroporefiltering

membraneforwatersystem,movethefiltrateintothesamplebottleofliquidchromatographyfortesting.In

casethesampletestingconcentrationexceedstheworkingcurvescope,testafterdilutingaccordingly.

7.Chromatographanalysisconditions

7.1Columntemperature:30℃.

7.2Testingwavelength:254nm

7.3MobilephaseA:Weight13.6gpotassiumdihydrogenphosphateand2.7gtetrabutylammoniumhydrogen

sulfateanddissolvetheminto800mLofprimarywater,mixuntiltheyarecompletelydissolved.Usethe

potassiumhydroxidesolutiontoregulatethepHvalueofthesolutionto3.5±0.05,supplementthesolution

withwaterto1000mL,add64mLofmethanol,mixitevenly,leachwith0.45ummicroporefiltering

membrane,andfinallyhaveultrasonicdegassing.

7.4MobilephaseB:Usethemeasuringcylindertoweigh700mLofmethanolandmakeitsvolumeconstant

at1000mLwithprimarywater,andkeepitforlaterafterultrasonictreatment.Thegradientelutionprogram

isasshowninTable1

7.5Samplevolume:10μL

Table1.Gradientelutionprogram

Time/minFlowingspeed/(mL/min)B%

00.80

120.86

170.870

190.870

210.80

300.80

8.Sampletesting

8.1Sampleofrawmaterial

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Underchromatographconditions,testthestandardstocksolution(5.1)andrawmaterialsample

solution(6.1)respectively,recordtheareaandpreservationtimeofchromatographpeak.Asperthearea

ofthechromatographpeak,calculatetheproductcontentwithareanormalizationmethod.

8.2Sampleoffinishedproduct

Underchromatographconditions,testthestandardworkingsolution(5.3)andsamplesolution(6.2)

respectively,recordtheareaandpreservationtimeofchromatographpeak.Aspertheareaofthe

chromatographpeak,calculatetheproductcontentwithexternalstandardmethod.

9.Resultcalculation

9.1Sampleofrawmaterial

9.1.1Theβ-NicotinamideMononucleotidecontentinthesampleiscalculatedperFormula(1)

AT

P100%.................................................................（1）

A0

Inwhich,P——thecontentofβ-NicotinamideMononucleotideintherawmaterial,withtheunitas

percentage(%)。

AT——Mainpeakareaofβ-NicotinamideMononucleotideinthestandardstocksolution

A0——Theareasumofallthepeaksinsamplesolutionofrawmaterial.

9.1.2Theβ-NicotinamideMononucleotidecontentinthesampleiscalculatedperFormula(2)

CTV

X10000...........................................................（2）

m

Where:X--inthetestsampleβ-Thecontentofnicotinamidemononucleotidewasexpressedin

percentage(%);

CT--concentrationofNMNinrawmaterialsamplesolution(6.1)obtainedbysinglepoint

quantitativeexternalstandardmethod(mg/L);

V--constantvolumeofsample(mL);

m--massofsample,ingram(g).

9.2Sampleoffinishedproduct

9.2.1Thenetcontentofeachfinishedproductsampleshallbecalculatedaccordingtoformula(3)

mtotal

W.......................................................................（3）

N

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Onecapsule:W-netcontentofeachfinishedproductsample(g/capsule);

Mtotal--weighthetotalmassofallfinishedproducts(g)

N--thequantityofallfinishedproducts(grains)

9.2.2Theβ-NicotinamideMononucleotidecontentinthesampleiscalculatedperFormula(4)

CVf

X=.......................................................（4）

m10000

Inwhich:X——Thecontentofβ-NicotinamideMononucleotideinthesampleoffinishedproduct,

withtheunitaspercentage(%)

C——β-NicotinamideMononucleotideconcentration(mg/L)inthesamplesolution(6.2).

V--constantvolumeofsample(mL);

f——Dilutionfactor

m——Weightofthesampleofthefinishedproduct（g）.

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AppendixA

(informative)

Figure1referenceβ-Liquidchromatographyofnicotinamidemononucleotide

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ICS67.050

C149

团体标准

T/CASME012-2021

β-烟酰胺单核苷酸纯度和含量的测定高效液相色谱法

Determinationforβ-nicotinamidemononucleotidecontentHigh

performanceliquidchromatography

（征求意见稿）