伴侣动物A型流感主动监测技术规范

T/CVMAxxx—xxxx

伴侣动物A型流感病毒主动监测技术要求

1范围

本文件规定了伴侣动物A型流感病毒主动监测过程中监测对象的范围、监测技术实施规范、样本采

集、样本库建立与管理质量、控制及结果分析的基本原则。

本标准适用于伴侣动物中A型流感病毒的诊断、检测和监测等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489-2008实验室生物安全通用要求。

GB/T42066-2022急性病毒性感染呼吸道样本采集

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

伴侣动物companionanimals

是指能够与人类建立情感联系，提供陪伴和娱乐的动物。

3.2

呼吸道症状sarcopticmange

由呼吸道感染引起的症状，包括打喷嚏、鼻塞、流鼻涕、咳嗽、发热、呼吸急促等症状。

3.3

鼻拭子nasalswab

选择合适规格拭子，将拭子头完全伸入采样对象鼻腔，拭子头靠近粘膜并转动三圈采集分泌物。

3.4

咽拭子throatswabs

选择合适规格拭子，将拭子头完全伸入采样对象咽部，拭子头靠近粘膜并转动三圈采集分泌物。

1

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4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

VTM：病毒载液（VirusTransportSolution）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

cDNA：互补脱氧核糖核酸(complementaryDNA)

Ct值：各反应管内荧光信号达到基线值时所经历的循环数

5监测目的

5.1实时监测国内伴侣动物A型流感病毒活动水平和流行趋势；

5.2实时追踪A型流感病毒变异，及时发现新型流感病毒，并做出预警；

5.3为伴侣动物流感疫情和动物源新型流感病毒向人类溢出风险评估提供本底数据。

6监测实施

6.1监测点设置

应在宠物医院、宠物繁育场点、宠物店、流浪动物收容站等伴侣动物聚集区域设置监测点。设置监

测点时应符合以下条件：

——该区域三年内曾经发生过较大规模伴侣动物相关A型流感病毒疫情；

——长期使用禽肉（特别是生肉）或禽类动物产品饲养动物；

——该区域处于候鸟栖息地或候鸟迁徙路线；

——该区域伴侣动物饲养密度或诊疗密度较大。

6.2监测对象

6.2.1应监测因呼吸道症状于宠物医院就诊病例和全部住院病例。

6.2.2应监测宠物繁育场点、宠物店、流浪动物收容站饲养的伴侣动物。

6.3监测周期

宠物繁育场点、宠物店、流浪动物收容站类型监测点，应在冬季每个月对监测点所有伴侣动物进行

监测，其它季节每两个月对监测点所有伴侣动物进行监测。

7监测方法

7.1监测对象信息收集

收集监测对象的基本情况包括采样点、样本编号、个体编号、物种、性别、年龄、症状、样本类型

和采样日期，填写“监测信息表”（见附录C）。确保监测信息表与监测对象一一对应，表中样本编号务

必与样本采集管上标记编号保持一致。

7.2样本采集

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于各监测点采集符合6.2要求的伴侣动物咽拭子，若采样对象有明显呼吸道症状则加采鼻拭子（体

型较小无法采集鼻拭子的动物可蘸取鼻涕或不采集）。样本采集应使用无菌拭子，拭子采集后装入含

VTM（具体配制见附录A）的采样管中，采样管应预先贴标签或手写样本编号，根据监测对象的基本情

况填写“监测信息表”。

7.3样本保存和运输

样本采集后应立即置于干冰中或于冰箱中冷冻，一周内寄送到实验室进行检测，寄送过程中使用干

冰保存。实验室收到样本后根据“监测信息表”对样本入库，样本保存须于超低温冰箱中。

7.4实验室检测

7.4.1检测方法

样本入库后一周内使用荧光定量PCR方法进行A型流感病毒检测。对检测阳性样品进行测序，确

认核酸阳性样本中A型流感病毒型别。

实时荧光PCR和型别鉴定荧光PCR所用引物、探针组及体系配制见附录B，荧光PCR程序参照

选用试剂盒说明书设置。

7.4.2结果判定

7.4.2.1试验成立条件

每次实施实验室检测均须设置阳性对照和阴性对照，阳性对照使用实时荧光PCR检测20<Ct值<25

的cDNA，阴性对照使用RNaseFreeWater。实时荧光PCR读数时阴性对照检测通道应无Ct值且无特

征性扩增曲线，阳性对照检测通道出现特征性扩增曲线且20<Ct值<25，如不满足上述条件，则该次试

验无效。

7.4.2.2结果判定

阴性对照和阳性对照读数满足7.4.2.1要求时，对检测样本进行判定：

a)阳性：Ct值<35且出现典型扩增曲线，报告为阳性；

b)阴性：Ct值≥38，报告为阴性；

c)疑似：35≤Ct值<38时，为疑似样本。对疑似样本进行重复检测，若重复检测Ct值<38且出现典

型扩增曲线则报告为阳性，否则报告为阴性。

8监测结果分析

8.1阳性率统计

阳性个体数与纳入监测总个体数之比为阳性率，统计全年总体阳性率、各监测点阳性率、各监测时

段阳性率及各监测物种阳性率。

8.2阳性监测点

一个监测周期中至少确诊一个阳性个体的监测点为阳性监测点，统计全年阳性监测点数量、各时段

阳性监测点数量、各监测点出现阳性时段分布。

8.3型别分析

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根据7.4.1测序结果判断样本中A型流感病毒的HA抗原亚型和NA抗原亚型，并记录于结果报告

中。

9结果报告

结果报告中项目应包括样本编号、采样日期、采样地址、宿主类型、宿主健康状态、病毒HA亚型

和病毒NA亚型，并展示在该监测点、该次监测中检出的阳性数、阳性率、检出亚型和阳性宿主（监测

结果报告单见附录D）。

4

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附录A

（规范性）

试剂的配制

A.1VTM配制

A.1.1准备两个1L容积可高压的玻璃瓶，使用纯水洗净后，分别加入100mL去核酸试剂和去核酸酶

试剂，平放于摇床上，常温、200r/min摇晃1h。

A.1.2取出玻璃瓶，倒出去核酸试剂和去核酸酶试剂后用DEPC水洗三次，高压灭菌玻璃瓶。

A.1.3配置环境应包含生物安全柜或超净台，使用去核酸试剂和去核酸酶试剂擦拭后再用7.5%乙醇

擦拭，后将0.22μm过滤器、1.5mL冻存管、天平、磁力搅拌器（转子提前使用去核酸试剂和去核酸酶

试剂浸泡30min后使用DEPC水洗净）分液器经高压灭菌的玻璃瓶置于其中，紫外照射1h。

A.1.4按照下述配方配置1LVTM：于玻璃瓶1中加入800mLpH7.4的Hank’s平衡液、10gBSA、

15mg两性霉素、100000单位青霉素G和50mg链霉素，磁力搅拌器混匀。完全溶解后加入pH7.4的

Hank’s平衡液定容至1L。

A.1.5将过滤器安装在玻璃瓶2上并连接真空泵，设置压强为30kpa，将玻璃瓶1中溶液倒入过滤器。

A.1.6待溶液全部过滤进入玻璃瓶2后，使用分液器将过滤后VTM分装至1.5mL冻存管中，每管1

mL，分装完成后将VTM置于4℃避光保存。

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附录B

（规范性）

实时荧光PCR和型别鉴定荧光PCR反应引物、探针及反应体系

B.1实时荧光PCR

B.1.1引物序列

参见表B.1序列合成实时荧光PCR的引物探针。

表B.1引物探针序列

引物/探针名称碱基组成

正向引物5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'

反向引物5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'

探针5'-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3'

B.1.2引物配制

将新合成的引物瞬时离心后依照说明书用RNaseFreeWater溶解为100μM的储存液。使用时将储存

液2.5倍稀释为40μM的工作液。

B.1.3探针配制

将新合成的探针瞬时离心后，依照说明书用RNaseFreeWater溶解为100μM的储存液。使用时将储

存液10倍稀释为10μM工作液。

B.1.4反应体系

将配制好的正向引物工作液、反向引物工作液和探针工作液按照体积比1：1：1混合，可选用商品

化的“一步法”实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制相应反应体系。

B.2型别鉴定荧光PCR

B.2.1引物探针序列

参见表B.2序列合成型别鉴定荧光PCR的引物探针。

表B.2引物探针序列

引物/探针名称碱基组成

HA正向引物5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3'

HA反向引物5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'

NA正向引物5'-TATTCCTCTCACCCAGCAAAAGCAGGAGT-3'

NA反向引物5'-ATATCCTCTCCTATTAGTAGAAACAAGGATTTTTT-3'

B.2.2引物配制

将新合成的引物瞬时离心后依照说明书用RNaseFreeWater溶解为100μM的储存液。使用时将储存

液2.5倍稀释为40μM的工作液。

B.2.3探针配制

6

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将新合成的探针瞬时离心后，依照说明书用RNaseFreeWater溶解为100μM的储存液。使用时将储

存液10倍稀释为10μM工作液。

B.2.4反应体系

将配制好的正向引物工作液、反向引物工作液和探针工作液按照体积比1：1：1混合，可选用商品

化的“一步法”实时荧光定量PCR试剂盒说明书配制相应反应体系。

B.2.5反应条件

参照选用的商品化“一步法”实时荧光定量PCR试剂盒说明书。

7

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附录C

（规范性）

监测信息记录表

监测信息记录表见表C.1。

表C.1监测信息记录表

采样点

样本编号个体编号物种性别年龄症状样本类型采样日期

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附录D

（规范性）

监测结果报告单

监测结果报告单见表D.1。

表D.1监测结果报告单

监测点

采样日期

样本编号宿主健康状态HA亚型NA亚型

阳性数：阳性率：

检出亚型：

阳性宿主：

_________________________________

9

ICS11.220

CCSB41

团体标准

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伴侣动物A型流感主动监测技术规范

TechnicalSpecificationsforSurveillanceofInfluenzaAinCompanion

Animals

征求意见稿

2025-xx-xx发布2025-xx-xx实施

中国兽医协会发布

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伴侣动物A型流感病毒主动监测技术要求

1范围

本文件规定了伴侣动物A型流感病毒主动监测过程中监测对象的范围、监测技术实施规范、样本采

集、样本库建立与管理质量、控制及结果分析的基本原则。

本标准适用于伴侣动物中A型流感病毒的诊断、检测和监测等。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489-2008实验室生物安全通用要求。

GB/T42