生物化学甲上氨基酸专家讲座

Chapter3氨基酸

蛋白质是生物功效表达者，而组成蛋白质基本单位是氨基酸。蛋白质在酸、碱或酶作用下，可逐步降解为氨基酸。组成蛋白质氨基酸常见有20种。成千上万不一样蛋白质实际上就是氨基酸种类、数目及排列次序不一样。第1页Section1蛋白质水解

用H+，OH-或酶将蛋白质彻底水解，能够得到许各种氨基酸混合物，说明氨基酸是蛋白质基本结构单位。

蛋白质→蛋白胨→多肽→二肽→氨基酸Mr：

大于1042x1031000—500200100第2页1、酸水解条件：5—10倍20%盐酸煮沸回流16—24小时，或加压于120℃水解2小时。优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为L—α—氨基酸，产物单一，无消旋现象。

缺点：色氨酸破坏，并产生一个黑色物质：腐黑质，水解液呈黑色。2、

碱水解条件：4mol/LBa(OH)2或6mol/LNaOH煮沸6小时。优点：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解液清亮。缺点：产生消旋产物，破坏氨基酸多，普通极少使用。3、

蛋白酶水解条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温37—40℃，pH值5—8优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。缺点：水解不完全，中间产物多。蛋白质酸碱水解惯用于蛋白质组成份析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。第3页Section2氨基酸结构通式2).除甘氨酸外,其它全部氨基酸分子中α-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都含有旋光性。B.每一个氨基酸都含有D-型和L-型两种立体异构体。当前已知天然蛋白质中氨基酸都为L-型。1、氨基酸结构氨基酸是蛋白质水解最终产物，是组成蛋白质基本单位。从蛋白质水解物中分离出来氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上共同特点为：1).与羧基相邻α-碳原子上都有一个氨基，因而称为α-氨基酸COOHH2NCαHRR基团α-氨基酸基本结构通式第4页2、组成蛋白质氨基酸结构特征（1）除Pro外，都属α-氨基酸，Pro为α-亚氨基酸：（2）都属L-氨基酸；（3）除Gly外，都含有旋光性；（4）为两性电解质。因为R基团不一样，各种氨基酸在性质上差异很大，如吸收光谱、等电点（pI）、解离常数（Ka）、颜色反应、稳定性、对金属络合能力等。所以，不一样氨基酸组成蛋白质，性质和功效千差万别。第5页

中性aa（1）按R基团酸碱性分酸性aa

碱性aa（2）按R基团非极性aa（9种）电性质分极性不带电荷aa（6种）极性aa带正电荷aa(3种）带负电荷aa（2种）

脂肪族aa（3）按R基团化学结构分芳香族aa

杂环族aaSection3氨基酸分类第6页

1.组成蛋白质20种氨基酸第7页

2.人体所需八种必需氨基酸

赖氨酸(Lys)缬氨酸(Val)蛋氨酸(Met)

色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)

酪氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)

婴儿时期所需:精氨酸(Arg)、组氨酸(His)

早产儿所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)3.几个主要不常见氨基酸

在少数蛋白质中分离出一些不常见氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由对应基本氨基酸衍生而来。其中主要有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸结构以下第8页

第9页Section4氨基酸主要理化性质1.普通物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异溶解性：各种氨基酸在水中溶解度差异很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸熔点极高，普通在200℃以上。(3)味感：其味随不一样氨基酸有所不一样，有无味、有为甜、有味苦，谷氨酸单钠盐有鲜味，是味精主要成份。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都含有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通惯用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：组成蛋白质20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)都有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光能力。第10页

酪氨酸

max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸max＝280nm，280=5.6x103;第11页

2.氨基酸两性解离性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不一样pH条件下，两性离子状态也随之发生改变pH1710净电荷+10-1

正离子两性离子负离子

等电点PI第12页氨基酸既含有氨基，能像碱一样接收H+，又含有羧基，像酸一样可电离出H+，所以氨基酸含有酸碱两性性质，是一类两性电解质。

Asanacid（protondonor）：

Asabase（protonacceptor）：第13页不一样pH时氨基酸以不一样离子化形式存在：氨基酸所带静电荷为“零”时，溶液pH值称为该氨基酸等电点（isoelectricpoint），以pI表示。第14页

试验证实在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少许而且数量相等正、负离子形式，还有极少许中性分子。

当溶液pH=pI时，氨基酸主要以两性离子形式存在。

pH<pI时，氨基酸主要以正离子形式存在。

pH>pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。

第15页

3.氨基酸等电点

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含-NH3+和-COO-数目恰好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团中性氨基酸，其等电点是它pKa1和pKa2算术平均值：pI=(pKa1+pKa2)/2

一样，对于侧链含有可解离基团氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边pKa值算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKaR-COO-)/2

碱性氨基酸：pI=(pKa2+pKaR-NH2)/2

第16页各种aa都有各自等电点。在酸性溶液中（pH<pI)带正电荷；在碱性溶液中（pH>pI)带负电荷。例：在pH=6.0混合溶液中

Ala—兼性离子

Lys—带正电荷

Glu—带负电荷第17页在溶液任一条件下：

pH=pKa+lg[质子受体]/[质子供体]

对于中性aa，加酸pKa取pKa1

加碱pKa取pKa2

知道了溶液pH，即可计算出在任一pH条件下，一个aa中各种离子百分比。第18页4.氨基酸化学性质

(1)与茚三酮反应氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，本身变为少一个碳醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。★★★第19页反应关键点A.该反应由NH2与COOH共同参加B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D.测定范围：0.5~50µg/ml

E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中氨基酸分离，自动定性定量，统计结果。第20页

(2)与甲醛反应

反应特点A.为α-NH2反应B.在常温，中性条件，甲醛与α-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，普通用于测定蛋白质水解速度。第21页

(3)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应

反应特点A.为α-NH2反应B.氨基酸α-NH2一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：判定多肽或蛋白质N-末端氨基酸A.即使多肽侧链上ε-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，轻易与α-DNP氨基酸区分和分离第22页

★首先由Sanger应用，确定了胰岛素一级结构A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其它游离氨基酸C.分离DNP-氨基酸D.由Edman于1950年首先提出为α-NH2反应用于N末端分析，又称Edman降解法肽分子与DNFB反应，得DNP-肽层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸种类、数目(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）反应第23页

Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸次序分析法实际上也是一个N-端分析法。此法特点是能够不停重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标识和解离。第24页

肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少一残基肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法判定Edman降解法改进方法---DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法判定因为DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸定量第25页

用Edman降解法提供逐次降低一个残基肽链灵敏度提升，能连续测定。多肽次序自动分析仪样品最低用量可在5pmol（5）与荧光胺反应

α-NH2反应氨基酸定量（6）与5,5’-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应-SH反应测定细胞游离-SH含量（7）其它反应成盐、成酯、成肽、脱羧反应第26页Section5氨基酸分析分离惯用方法有：滤纸层析法(filter-paperchromatography:FPC)薄层层析法(thin-layerchromatography:TLC)离子交换层析法(Ion-exchangecolumnchromatography:IEC)气液色谱法(gas-liquidchromatography:GLC)高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography:HPLC)电泳技术第27页一、滤纸层析法（FPC)以滤纸作为支持物。滤纸吸附水为固定相（S)

用水饱和有机溶剂作流动相（L)

在互不相溶两相溶剂中，依据分配系数不一样而分离物质方法称为分配系数法。（主要与物质极性相关）分配系数（Ka)=溶剂在流动相中浓度/溶剂在固定相中浓度迁移率（Rf)=原点到层析中心点距离/原点到层析前沿距离即在一定条件下，被分离物质在纸上移动距离与溶剂移动距离之比。在一定条件下，某种aaRf值是一定，不一样aaRf值是不一样。

可利用两种不一样展层剂，进行双相层析（详见P151图3-25）。第28页二、离子交换层析（IEC)离子交换剂是一个不溶于水、不溶于有机溶剂、不溶于酸碱高分子化合物。依据所带基团又可分为：

1、阳离子交换剂含-SO3H（强酸型）

H型

-COOH（弱酸型）若以Na+置换H+:-SO3NaNa型

-COONa第29页

2、阴离子交换剂：含-N+(CH3)3OH（强碱型）

OH型

-N+H3OH（弱碱型）若以Cl-置换OH-,-N+(CH3)3ClCl型

-N+H3Cl

如：732型阳离子交换树脂（pH1-2)分离aa:

(1)转型：由H型→Na型（2）上样：混合aa

（3）洗脱：提升洗脱液pH或离子强度

aa洗脱次序：先酸性aa、再中性aa、后碱性aa。若用阴离子交换树脂分离aa，洗脱次序则相反。第30页蛋白质存在于全部生物细胞中，是组成生物体最基本结构物质和功效物质。蛋白质是生命活动物质基础，它参加了几乎全部生命活动过程。Chapter4蛋白质共价结构第31页Section1概述一、蛋白质定义蛋白质：是一切生物体中普遍存在，由天然氨基酸经过肽键连接而成生物大分子；其种类繁多，各含有一定相对分子质量，复杂分子结构和特定生物功效；是表示生物遗传性状一类主要物质。

二、蛋白质在生命中主要性

早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体化学组成部分不停自我更新。”能够看出，第一，蛋白体是生命物质基础；第二，生命是物质运动特殊形式，是蛋白体存在方式；第三，这种存在方式本质就是蛋白体与其外部自然界不停新陈代谢。当代生物化学实践完全证实并发展了恩格斯论断第32页

1.蛋白质是生命机体主要组成成份

蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水55%

细菌50%~80%蛋白质19%

真菌14%~52%脂肪19%

酵母菌14%~50%糖类＜1%

白地菌50%无机盐7%2.蛋白质是一个生物功效主要表达者

（1）酶催化作用（2）调整作用(多肽类激素)

（3）运输功效（4）运动功效（5）免疫保护作用(干扰素)

（6）接收、传递信息受体（7）毒蛋白第33页3.外源蛋白质有营养功效，可作为生产加工对象.三、蛋白质组成1.元素组成

蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少许硫。一些蛋白质还含有其它一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中组成百分比约为：碳50％氢7％氧23％氮16%

硫0—3％其它微量第34页

氮占生物组织中全部含氮物质绝大部分。所以，能够将生物组织含氮量近似地看作蛋白质含氮量。因为大多数蛋白质含氮量靠近于16%，所以，能够依据生物样品中含氮量来计算蛋白质大约含量

★蛋白质含量测定：

凯氏定氮法

(测定氮经典方法)

优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中氮)

都归入蛋白质中,不准确。普通，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质）；故：※蛋白质含量=氮量×100/16×6.25

第35页

除了上述法方外，还有

紫外比色法

双缩脲法

Folin—酚

考马斯亮兰G—250比色法（条件：蛋白质必须是可溶）

2.化学组成（两种类型）单纯蛋白质：水解为α-氨基酸结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基

第36页

四、蛋白质分类一.依据蛋白质外形分类按照蛋白质外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质：（globularprotein）外形靠近球形或椭圆形，溶解性很好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrousprotein)分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。二.依据蛋白质组成份类

按照蛋白质组成，能够分为1.简单蛋白(simpleprotein)

：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由

-氨基酸组成肽链，不含其它成份。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。第37页2.结合蛋白(conjugatedprotein)：由简单蛋白与其它非蛋白成份结合而成（1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。（2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中糖蛋白等。（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清

-，

-脂蛋白等。（4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中核糖核蛋白等。（5）色蛋白：由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。（6）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。第38页

Section2肽(peptide)蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成生物大分子。蛋白质与多肽并无严格界限，通常是将分子量在6000道尔顿以上多肽称为蛋白质。蛋白质分子量改变范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大

一.肽一个氨基酸氨基与另一个氨基酸羧基之间失水形成酰胺键称为肽键，所形成化合物称为肽。由两个氨基酸组成肽称为二肽，由多个氨基酸组成肽则称为多肽。组成多肽氨基酸单元称为氨基酸残基。

1.肽链第39页

在多肽链中，氨基酸残基按一定次序排列，这种排列次序称为氨基酸次序通常在多肽链一端含有一个游离

-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离

-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸次序是从N-端氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点排列次序。如上述五肽可表示为：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第40页

2.肽键

肽键特点是氮原子上孤对电子与羰基含有显著共轭作用。组成肽键原子处于同一平面。肽键中C-N键含有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。第41页

3.天然存在主要多肽

在生物体中，多肽最主要存在形式是作为蛋白质亚单位。不过，也有许多分子量比较小多肽以游离状态存在。这类多肽通常都含有特殊生理功效，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。第42页

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽

Leu-脑啡肽第43页二.蛋白质一级结构1.蛋白质一级结构(Primarystructure)包含：

(1)组成蛋白质多肽链数目.(2)多肽链氨基酸次序，

(3)多肽链内或链间二硫键数目和位置。★其中最主要是多肽链氨基酸次序，它是蛋白质生物功效基础。2.蛋白质一级结构测定

蛋白质氨基酸次序测定是蛋白质化学研究基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素一级结构以来，现在已经有上千种不一样蛋白质一级结构被测定。(1)测定蛋白质一级结构要求

第44页A.样品必需纯（>97%以上）；B.知道蛋白质分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质氨基酸组成；并依据分子量计算每种氨基酸个数。E.测定水解液中氨量，计算酰胺含量。(2)测定步骤

①多肽链拆分：由多条多肽链组成蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).第45页

②测定蛋白质分子中多肽链数目：经过测定末端氨基酸残基摩尔数与蛋白质分子量之间关系，即可确定多肽链数目。

③二硫键断裂：几条多肽链经过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量

-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成巯基，以预防它重新被氧化。能够经过加入盐酸胍方法解离多肽链之间非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间二硫键。第46页

★巯基保护④测定每条多肽链氨基酸组成，并计算出氨基酸成份分子比；⑤分析多肽链N-末端和C-末端

★末端氨基酸测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸次序分析中，最主要是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定主要方法有：第47页

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）能够与N-端氨基酸游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法优点是丹磺酰-氨基酸有很强荧光性质，检测灵敏度能够到达1

10-9mol。第48页肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水物质而与C-端氨基酸分离。第49页

氨肽酶法：氨肽酶是一个肽链外切酶，它能从多肽链N-端逐一向里水解。根基不一样反应时间测出酶水解所释放出氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质N-末端残基次序。最惯用氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端肽键速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一个肽链外切酶，它能从多肽链C-端逐一水解。根基不一样反应时间测出酶水解所释放出氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质C-末端残基次序。当前惯用羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外全部C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基肽键。⑥多肽链断裂成多个肽段，可采取两种或各种不一样断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽选择性降解方法有：第50页酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽键。第51页⑦测定每个肽段氨基酸次序。⑧确定肽段在多肽链中次序：利用两套或多套肽段氨基酸次序彼此间交织重合，拼凑出整条多肽链氨基酸次序。⑨确定原多肽链中二硫键位置：普通采取胃蛋白酶处理没有断开二硫键多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及次序分析，然后同其它方法分析肽段进行比较，确定二硫键位置。第52页Chapter5蛋白质空间结构

Section1蛋白质三维结构内容及研究方法

Protein分子中原子或基团在三维空间分布、排列及肽链主链在空间走向。蛋白质这种天然结构决定于3个原因：（1）与溶剂分子相互作用（2）溶剂pH与离子组成（3）蛋白质aa序列（主要原因）第53页一、蛋白质结构水平一级结构(primarystructure)：蛋白质分子中肽键、肽链、aa序列和二硫键位置。二级结构(secondarystructure):蛋白质主链在空间走向。三级结构(tertiarystructuer):由多个三维实体（结构域）组成近似球状构象。四级结构(quaternarystructure):寡聚蛋白构象。第54页在二级结构和三级结构之间还可细分为：超二级结构和结构域。超二级结构(supersecondarystructure)：若干相邻二级结构单元相互作用，形成有规则组合体。结构域(structuredomain)：多肽链中相对独立三维实体。第55页蛋白质空间结构研究方法旋光色散法重氢交换法紫外差示光谱法核磁共振光谱激光拉曼光谱X-晶体衍射质子光谱色质联用圆二色散荧光偏振光谱第56页X-射线衍射法

第57页Section2蛋白质二级结构蛋白质二级(Secondary)结构是指肽链主链在空间排列,或规则几何走向、旋转及折叠。它只包括肽链主链构象及链内或链间形成氢键。主要有

-螺旋、-折叠、-转角。不一样蛋白质二级结构是不一样。第58页肽平面（酰胺平面）第59页

多肽链主链由许多酰胺平面组成，平面之间以α碳原子相隔。而Cα-C键和Cα-N键是单键，能够自由旋转，其中Cα-C键旋转角度称ψ，Cα-N键旋转角度称φ。ψ和φ这一对两面角决定了相邻两个酰胺平面相对位置，也就决定了肽链构象。第60页第61页第62页第63页早在20世纪30年代，Pauling和Corey就开始有X-射线衍射方法研究了氨基酸和肽结构，他们得到了主要结论:(1)肽键键长介于C-N单键和双键之间，含有部分双键性质，不能自由旋转。(2)参加肽键形成两个原子及相邻四个原子处于同一平面，形成了酰胺平面，也称肽键平面，又称一个肽单位。

(3)酰胺平面中键长、键角是一定（4）在酰胺平面中C=0与N-H呈反式。（5）相邻肽平面组成二面角第64页在

-螺旋中肽平面键长和键角一定,肽键原子排列呈反式构型,相邻肽平面组成两面角.①多肽链中各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间距离0.15nm.②肽链内形成氢键，氢键取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基酰胺基团-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团-NH基形成氢键。③蛋白质分子为右手

-螺旋。左手和右手螺旋

1.-螺旋第65页α-螺旋结构关键点以下：

①蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，每圈螺旋高度为0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100º。②维系这种螺旋结构作用力是氢键，多肽主链上第n个残基羰基和第n+4个残基酰氨基形成氢键。③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白质绝大部分是右手螺旋，到当前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发觉了一段左手螺旋。α-螺旋稳定性主要靠氢键来维持。

第66页第67页

除了上面这种经典α-螺旋外，还有一些不经典α-螺旋，所以要求了相关螺旋写法，用“nS”来表示，n为螺旋上升一圈氨基酸残基数，S为氢键封闭环内原子数，经典α-螺旋用3.613表示，非经典α-螺旋有3.010，4.416（π螺旋）等。第68页第69页一些侧链基团即使不参加螺旋，但他们可影响α-螺旋(1)、在多肽链中连续出现带同种电荷极性氨基酸，α-螺旋就不稳定。在多肽链中只要出现pro，α-螺旋就被中止，产生一个弯（bend）或结节（kink）（不能形成氢键，侧链占据相邻残基空间），Pro常出现在α-螺旋末端；(2)、GlyR基太小，难以形成α-螺旋所需两面角，所以和Pro一样也是螺旋最大破坏者。(3)、肽链中连续出现带庞大侧链氨基酸如Ile，因为空间位阻，也难以形成α-螺旋。第70页α-螺旋在不一样蛋白质中情况α-角蛋白：全部由α-螺旋组成肌红蛋白：大部分由α-螺旋组成溶菌酶：仅含一部分α-螺旋铁氧还蛋白：完全不含有α-螺旋第71页

-折叠是由两条或多条几乎完全伸展肽链平行排列，经过链间氢键交联而形成。肽链主链呈锯齿桩折叠构象。①在

-折叠中，

-碳原子总是处于折叠角上，氨基酸R基团处于折叠棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间轴心距为0.35nm.②

-折叠结构氢键主要是由两条肽链之间形成；也能够在同一肽链不一样部分之间形成。几乎全部肽键都参加链内氢键交联，氢键与链长轴靠近垂直。③

-折叠有两种类型。一个为平行式，即全部肽链N-端都在同一边。另一个为反平行式，即相邻两条肽链方向相反。2.

-折叠第72页β-折叠有平行和反平行两种形式:平行：两条肽链或肽段走向相同；反平行：走向相反第73页在

-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角残基中，第三个普通均为甘氨酸残基．弯曲处第一个氨基酸残基-C=O和第四个残基–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。４.自由回转没有一定规律涣散肽链结构，但仍是紧密有序稳定结构，经过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象．不一样蛋白质，自由回转数量和形式各不相同．分两类：①紧密环②连接条带3.

-转角第74页１、超二级结构在蛋白质分子中，由若干相邻二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能识别二级结构组合体。几个类型超二级结构：αα；ββ；βαβ；βββ．

★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成含有功效结构域．ααβββαβSection3超二级结构和结构域第75页

对于较大蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构组合，对于较小蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域普通由100~200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400个残基。氨基酸能够是连续，也能够是不连续．结构域之间常形成裂隙，比较涣散，往往是蛋白质优先被水解部位。酶活性中心往往位于两个结构域界面上．结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定柔性，经过结构域之间相对运动，使蛋白质分子实现一定生物功效。在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立运动，水解出来后仍能维持稳定结构，甚至保留一些生物活性．２、结构域第76页常见结构域：EF-hand(EF-handCa2+-bindingmotif)EF手型钙结合性模体（基序）Zincfinger（锌指结构）Leucinzipper（亮氨酸拉链结构）第77页：有时一个结构域就是蛋白质功效域。包含一个但通常是多个结构域。★结构域与功效域关系第78页Section4蛋白质三级结构1、定义：蛋白质三级结构是指多肽链在各种二级结构基础上深入盘旋、折叠，从而生成特定空间结构（球状）。包含主链和侧链全部原子空间排布．普通非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面．第79页2、特点：球状蛋白质溶于水。

亲水R基位于球状表面，疏水R基位于球状内部，含有两个以上相对独立三维结构实体（结构域）。

3、经典代表：肌红蛋白

是哺乳动物肌肉中储存O2蛋白质，由153个氨基酸组成单链蛋白，分子量17.8KD（人），16.7KD（鲸）。第80页结构（1）球型结构4×3.5×2.5nm。（2）肽链75%组成α-螺旋，具8个α-螺区。（3）Pro,Ile,Ser,Thr,Asn都出现在拐弯处。（4）分子疏水基都聚集在内部，整个分子致密坚固，分子内部只有一个适于包含4个水分子空间。（5）含有一个血红素辅基，垂直伸出表面，卟啉Fe有6个配位键，其中4个与卟啉环上N原子相连，1个与蛋白肽链中His咪唑基相连，另1个用于结合氧气。第81页一、定义：

许多蛋白质是由两个或两个以上独立三级结构经过非共价键结合成多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质四级结构是指亚基种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中空间排布和亚基间相互作用。四级结构中，肽链之间是以非共价键相连。包含均一寡聚蛋白：相同亚基组成非均一寡聚蛋白：由不一样亚级组成。Section5蛋白质四级结构第82页二、实例：血红蛋白血红蛋白四级结构测定由佩鲁茨1958年完成，其结构关键点为：球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基两条α链，两条β链，α2β2α链：141个残基；β链：146个残基分子量65000含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部第83页血红蛋白性质：

1、协同效应

2、别构效应

3、玻尔效应第84页

一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构三．蛋白质空间结构作用力第85页维系蛋白质分子一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子二级结构：氢键维系蛋白质分子三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子四级结构：范德华力、盐键a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力

d范德华力e二硫键f酯键第86页氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力即使键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构尤其主要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很主要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定离子键氢键范德华力疏水相互作用力第87页四、aa次序与空间构象关系1、核糖核酸酶复性试验

在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理，是4个二硫键断裂，整个肽链涣散无规则，酶活性散失。用透析法除去尿素和巯基乙醇，此酶又恢复活性达原来95%以上，复性后酶理化性质与原来也一样。在105中组合中，只选择了其中一个（天然构象）。此试验证实：蛋白质一级结构决定它高级结构。即一维信息决定三维构象。第88页2、aa种类、次序与空间构象关系：

Pro,Hyp不参加α-螺旋形成。

Ile,Asn,Ser,Thr形成α-螺旋不稳定。

Gly形成α-螺旋不规则。侧链R基对α-螺旋有影响，带同种电荷R基相互排斥。第89页Chapter6蛋白质分子结构与功效关系一.蛋白质一级结构与功效关系研究蛋白质一级结构与功效关系主要是：研究多肽链中不一样部位残基与生物功效关系。进行这方面研究惯用方法有：同源蛋白质氨基酸次序相同性分析、氨基酸残基化学修饰及切割试验等。例1镰刀形贫血病患者血红细胞合成了一个不正常血红蛋白（Hb-S）它与正常血红蛋白（Hb-A）差异：仅仅在于β链N-末端第6位残基发生了改变（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性缬氨酸残基使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血这说明了蛋白质分子结构与功效关系高度统一性第90页例2一级结构局部断裂与蛋白质激活

体内一些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原部分肽链以特定方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟胰岛素分子大一倍多单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链胰岛素分子单体.第91页

同源蛋白：是指在不一样有机体中实现同一功效蛋白质.同源蛋白中一级结构中有许多位置氨基酸对全部种属来说都是相同，称为不变残基；其它位置氨基酸称可变残基.不一样种属可变残基有很大改变.可用于判断生物体间亲缘关系远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功效所必要部位，属于不变残基.可变残基可能伴随进化而变异，而且不一样种属细胞色素C氨基酸差异数与种属之间亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.例3同源蛋白第92页黄色：不变残基（invariableresidues）蓝色：保守氨基酸（conservativeresidues）未标识：可变残基（variableresidues）二.蛋白质构象与功效关系

别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，造成蛋白质生物活性改变现象.它是细胞内最简单调整方式.例：血红蛋白别构效应一个亚基与氧结合后，引发该亚基构象改变进而引发另三个亚基构象改变整个分子构象改变与氧结合能力增加第93页Chapter7蛋白质性质及分离纯化一.蛋白质分子大小蛋白质是分子量很大生物分子，相对分子质量大于10000.最高可达40000000（烟草花叶病毒）．

蛋白质相对分子质量测定方法1.依据化学成份测定最小相对分子质量此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成份百分含量然后，假定蛋白质分子中该成份只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量＝（已知成份相对分子、原子质量）/已知成份百分含量假如蛋白质分子中所含已知成份不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量倍数。2.

超离心法在60000～80000r/min高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动用光学方法测定界面移动速度即为蛋白质离心沉降速度蛋白质沉降速度与分子大小和形状相关第94页沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质沉降系数：1～200S

由沉降系数S可依据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子相对分子质量：

M=RST/D〔1－vρ〕R：气体常数T：绝对温度

D：扩散系数ρ：溶剂密度3.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号凝胶网孔大小一定，只允许对应大小分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大测定蛋白质分子量普通用葡聚糖，商品名：Sephadex第95页测得几个标准蛋白质洗脱体积〔Ve〕以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕从标准曲线上可查出样