3.2.2基因工程的基本操作程序(第二课时)课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的基本操作程序BASICOPERATINGPROCEDURESFORGENETICENGINEERING3.2|第二课时人教版选择性必修3基因表达载体的构建Step02获得目的基因后，能直接导入受体细胞吗？就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解

不能原因1.构建基因表达载体的目的1让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代。2使目的基因能够表达和发挥作用基因表达载体的构建（核心步骤）2.基因表达载体的组成载体≠基因表达载体各个元件有什么作用？基因表达载体与载体相比增加了________

。

目的基因启动子本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：

识别和结合的部位，驱动基因转录出

。

DNA上游RNA聚合酶mRNA启动子类型：组成型启动子(一直启动)组织特异性启动子(特定组织中启动)诱导型启动子(特定诱导物下启动)终止子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：终止

。DNA下游转录复制原点：

DNA复制的起始位点（DNA聚合酶结合位点）标记基因：便于重组DNA分子的筛选如抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中。目的基因：

改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的

基因。必须插到

和

之间启动子终止子启动子本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：

识别和结合的部位，驱动基因转录出

。

DNA上游RNA聚合酶mRNA终止子：本质：有特殊序列结构的

片段位置：基因的

。功能：终止

。DNA下游转录复制原点：

DNA复制的起始位点（DNA聚合酶结合位点）标记基因：便于重组DNA分子的筛选如抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等限制酶切割位点：供外源DNA片段插入其中。目的基因：

改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的

基因。必须插到

和

之间启动子终止子基因表达载体的构建（核心步骤）

项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA决定转录的结束翻译的起始信号决定翻译过程的结束启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较基因表达载体的构建（核心步骤）3.基因表达载体构建的流程1用限制酶切割载体，使它出现一个缺口2用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。3将目的基因导入受体细胞Step031.转化目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。受体细胞稳定表达由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法会有差别，将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。2.方法1.植物细胞2.动物细胞3.微生物细胞花粉管通道法、农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法(感受态细胞法)常用的受体细胞大肠杆菌土壤农杆菌酵母菌动植物细胞枯草杆菌1.花粉管通道法用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中1我国科学家独创的一种方法将目的基因导入受体细胞在植物受粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。2适用生物：开花植物——将目的基因导入植物细胞将目的基因导入受体细胞2.农杆菌转化法①农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染___________和___________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；b.农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________。双子叶植物裸子植物Ti质粒Ti质粒T-DNA该细胞的染色体DNA上

将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。②利用农杆菌进行转化的思路：Ti质粒的T-DNA植物细胞——将目的基因导入植物细胞将目的基因导入受体细胞③过程：新性状植株第一次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上第二次拼接含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上(非人工操作)第一次导入第二次导入含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌该过程经过____次拼接、____次导入两两——将目的基因导入植物细胞猜测单子叶植物细胞为什么不适用农杆菌转化法？可能损伤时无法分泌酚类物质。为什么农杆菌容易感染双子叶植物和裸子植物？双子叶、裸子植物受损伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物吸引农杆菌向受伤组织集中将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞染色体DNA上。【特点】易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞④农杆菌转化的具体方法可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_________________，然后_______________，并____________；受体细胞为_________ab与农杆菌共培养筛选转化细胞再生成植株体细胞可以将______直接浸没在__________________中一段时间，然后培养植株并获得______，再进行_______、_______等；受体细胞为_______花序含有农杆菌的溶液种子筛选鉴定受精卵将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞受精卵全能性高，高度分化的体细胞全能性受到抑制显微注射法将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入动物细胞构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物受体细胞:受精卵①

体积大，易操作；②

全能性高，易培养成完整个体。Ca2+处理法重组

Ti质粒吸收感受态细胞将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入微生物细胞原因：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。受体细胞：常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态Ca2+处理细胞将重组的基因表达载体导入其中这种细胞称为感受态细胞受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法受体细胞体细胞、受精卵受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T-­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子不一定！如何判断？在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？目的基因的检测与鉴定Step041.目的检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。2.检测内容及方法类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNA目的基因是否翻译成蛋白质个体是否具有相应性状PCR等技术抗原-抗体杂交技术病原体接种实验等目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测方法：

PCR扩增或DNA分子杂交技术目的基因的检测与鉴定（1)检测目的基因是否导入方法①：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作是否扩增出目的基因电泳操作M：marker；1:阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果1.分子水平的检测方法：

PCR扩增或DNA分子杂交技术过程：①首先取出转基因生物的基因组DNA。②将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。DNA分子杂交结果图目的基因的检测与鉴定（1)检测目的基因是否导入方法②：DNA分子杂交技术方法：

PCR或RNA分子杂交技术1.分子水平的检测目的基因的检测与鉴定2.检测目的基因是否转录RNA分子杂交(NorthernBlot)流程图洗去未结合的探针放射自显影放射自显影杂交RNA提取电泳分离不同大小的RNA被分离样本标记的RNA/DNA探针提取逆转录转膜苏云金杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内Bt抗虫蛋白抗体标记抗体提取蛋白|电泳分离抗体抗原杂交Bt抗虫蛋白方法：抗原-抗体杂交技术1.分子水平的检测目的基因的检测与鉴定3.检测目的基因是否翻译成蛋白质如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译方法：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等正常棉叶子抗虫棉叶子接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果。抗虫或抗病接种实验与天然产品的功能进行活性比较2.个体水平的检测目的基因的检测与鉴定2.个体水平的检测目的基因的检测与鉴定抗性以及抗性程度抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取（前提）2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞（关键）4.目的基因的检测与鉴定（保证）有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。实验原理1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理变性90˚C延伸72˚C复性50˚C探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定2.DNA片段电泳鉴定的原理①DNA分子具有__________________，在一定的________下，这些基团可以带上__________________。在______的作用下，这些___________会向着_____________________的电极移动，这个过程就是电泳。可解离的基团pH正电荷或负电荷带电分子与它所带电荷相反电场一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极移动。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶具有类似孔板的网状结构，当DNA在网状结构中移动时，大的DNA片段受到的阻力大，移动速度慢；小的DNA片段受到的阻力小，移动速度快，故可以根据长度差异分离不同的DNA。2.DNA片段电泳鉴定的原理探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定琼脂糖凝胶的浓度对DNA分子迁移速率的影响琼脂糖凝胶（三维网状结构）形成的孔径会随琼脂糖凝胶的浓度变化而变化。浓度越低，凝胶孔径越大，DNA分子在电场作用下迁移时受到的阻力越小，迁移速率就越快；反之，凝胶浓度越高，孔径越小，DNA分子通过凝胶孔时受到的阻碍越大，迁移速率越慢。在DNA电泳实验中，可根据待分离DNA片段的大小范围选择合适的琼脂糖凝胶浓度。要分离较大的DNA片段，如大于10kb，通常会选用较低浓度（0.5%-0.8%）的琼脂糖凝胶，以便使DNA片段有足够空间迁移并分开；若要分离较小的DNA片段，如小于1kb，常采用较高浓度（1.2%-2.0%）的凝胶，能更清晰地分辨不同大小的片段。实验原理2.DNA片段电泳鉴定的原理在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定以右图中展示的核酸电泳结果为例，最左侧一列“M”（Marker）所在加样孔，添加的是已知分子量大小不同的DNA片段混合物，其作为“标尺”在电泳检测中必不可少，一是检测琼脂糖凝胶是否有问题，二是可以用来粗略估算样品DNA分子量的大小。材料用具PCR仪自动控温，实现DNA的扩增微量离心管实际上是进行PCR反应的场所微量移液器用于向微量离心管转移PCR配方中的液体一次性吸液枪头微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头电泳装置包括电泳仪、电泳槽等12345探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定64种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管)7电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等8PCR反应体系的配方探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液(含Mg2+)5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液(实为dNTP)1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶(即为耐高温的DNA聚合酶)1～2U模板DNA(1pg～1μg)5～10μL总体积50μL方法步骤（1）DNA片段的扩增→PCR技术

移液离心扩增用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定[思考]为什么最后1次变性时间延长？TaqDNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。（2）DNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液制备琼脂糖凝胶根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定方法步骤加样电泳观察将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（2）DNA片段的电泳鉴定探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定方法步骤探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA电泳鉴定中的“两液”（P117)（1）电泳缓冲液：维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率，整个电泳过程中都需要。（2）凝胶载样缓冲液：主要用于样品的稀释和保护，在样品加样前与样品混合使用。（内含指示剂）凝胶载样缓冲液中指示剂通常是一种颜色较深的染料（如溴酚蓝)，可以作为电泳进度的指示分子，但其迁移速率与DNA分子不同，不能指示DNA分子的具体位置。特别注意1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3