二次谐波成像技术

第页二次谐波成像技术【摘要】本文介绍了一种新近发展起来的非线性光学成像技术——二次谐波成像技术。该技术具有高空间分辨率、高成像深度、无需荧光标记、光损伤小等优点，被认为是一种理想的非侵入式生物活体成像方法，具有良好的生物医学应用前景。本文分别对二次谐波成像技术研究背景，成像原理，主要特点，成像装置以及在生物医学领域的应用进行简述，最后对该技术在生物医学领域前景进行了展望。【关键词】二次谐波；非线性光学；显微成像；应用；研究背景自从第一台光学显微镜在十七世纪出现以后，光学显微镜就就成为了一个不可替代的认识微观世界的工具。1961年，Franken等使用红宝石激光器，通过利用波长为694nm的激光输入石英晶体的方式，得到了波长为347nm的紫外光[1]，这是最早观察到的光学二次谐波(secondharmonicgeneration,SHG)现象，同时这也是非线性光学诞生的标志。从此以后，二次谐波并不是首先应用于成像领域，而是被用于获得更短波长的激光。1971年，Fine和Hansen第一次在近透明的生物组织中观察到了二次谐波现象[2]。到了1978年，Geannaway和Sheppard首次提出了二次谐波的成像方法[3]。1986年，Freund以二次谐波成像的方法来研究小鼠尾键胶原纤维，这是第一次的对生物样品进行的SHG成像[4]，是SHG成像在生物医学领域应用的开始。近年来，随着计算机技术、检测技术和激光技术的快速发展,以及临床医学和现代生物医学的对生物组织在微观尺度上的进行精准成像和治疗的重大需求，利用SHG对生物组织的成像成为了生物医学成像领域中的热门课题，引起广泛关注。

成像原理二次谐波，也叫倍频，是一种非线性光学过程。两个基频光子入射非线性介质，接着在介质中湮灭的同时，一个新的倍频光子产生。二次谐波产生的过程如图1所示，二次谐波的产生过程中，并没有能量跃迁的发射，因此两个频率为ω光子产生，一个频率为2ω光子发射，它们的能量其能量相等。图1二次谐波能级示意图电极化强度P与入射辐射的场强E可以用来表示非线性介质的光学响应，总的极化强度可表示为:P=ε0其中,χ(1)是一阶电极化率（线性电极化率），χ(2)、χ(3)我设入射光场强：E1cosωt+ϕ,由式（1）可知,入射光产生的二阶非线性电极化强度为：12ε0χ2E12+1SHG成像必须满足两个条件：没有反演对称的介质和满足相位匹配条件。若是不满足这两个条件，SHG无法成像。此外,SHG还与样品的非线性光学系数deff有关,deff越大越能有效产生二次谐波[6]。技术特点与其他的现代光学显微成像技术的原理不同，二次谐波成像技术利用的是样品的非线性特性，由样品的二次谐波信号成像和探测，因此具有以下特点：对比起采用采用共焦小孔成像的传统激光共焦显微镜，二次谐波显微成像的信号光由于非线性效应的强局域特性，非焦点区域的光基本不影响对测量结果，因此无需共焦小孔，同时实现了高分辨率成像，高信噪比，高的三维空间分辨率，并且对具有一定厚度的样品同样也可以进行行层析成像。二次谐波信号是样品自发产生的信号，因此成像过程中不需要使用染料，从而避免了一般染色过程中的光化学毒性及物理损伤，使该技术可以对很多不能进行荧光标记的样品进行成像。另外，红外的飞秒激光器通常在二次谐波成像技术作为激发光源而采用，因此，产生的激光相对来对生物样品的光损伤小，光漂白效应弱，还增加了样品的穿透深度。二次谐波信号因其相干性，对样品局部微观结构具有较高的敏感性。通过分析探测到的二次谐波信号的角度分布或偏振特性，不仅能反映出与样品有关的强度信息，还可以得到样品分子取向、排列方式等重要而本质信息的局部微观结构信息。二次谐波成像显微镜可以和其他的成像技术进行同时探测，这是因为SHG可以收集背向信号。如结合双光子荧光显微镜、光学相干层析成像等技术，实现多通道显微成像，可以比对不同方式探测的结果，实现信号互补。虽然二次谐波显微镜未商品化，但可以通过改造已经商品化双光子荧光显微系统获得SHG成像显微镜可只需要在双光子荧光显微系统进行简单改造，如通过更换滤光片，耗费较小[7]。

实验装置及成像系统利用二次谐波的非线性光学特性进行生物组织成像，该成像系统中的SHG信号相比于常见的自发荧光，具有光谱更窄、强度更高且严格倍频等优点。SHG成像需要使用飞秒激光进行双光子激发，即要求两个光子在飞秒量级的时间间隔内击中样品分子[8]。要实现二次谐波显微成像，需要对以下因素进行最优化考虑:超短脉冲激光、高数值孔径的显微物镜、高灵敏度的非解扫面探测器、准相位匹配和具有高二阶非线性的样品[9]。SHG信号的收集方法可分为前向检测和后向检测两种，普遍使用的是后者，就是后向检测。目前有许多商用的多光子共聚焦显微镜可以进行改造，用于SHG成像，同时也有自主组装的SHG成像装置，这些装置一般都会使用图2[10]的系统。图2SHG显微镜装置示意图及小鼠皮肤成像图[10]掺Ti蓝宝石飞秒激光器是最常使用的激光器。因其高重复频率峰值功率,单脉冲能量低，且可在整个近红外区内连续调谐的特性,成为了二次谐波显微成像的理想光源[6]。同时，在系统中可以通过λ/2和λ/4波片调节入射光的相位。对于系统的滤光片，一般采用长波滤光片和窄带滤光片(带宽10nm)的组合，用来过滤任何干扰信号，保证所收集的信号仅为SHG信号。然后是信号收集系统。为减少SHG信号在系统中的损失,提高系统的探测灵敏度,最好采用非解扫的信号。信号收集系统中的主要部件是PMT。首先,探测器的接收面需要足够宽，用来收集整个样品的二次谐波信号；其次,对于系统来说，激光器常为掺Ti蓝宝石飞秒激光器,样品产生二次谐波信号处于350nm至500nm波段。因此系统可采用双碱阴极光电倍增管。由于激发光波长离探测器的响应区很远，所以可有效探测二次谐波信号[6]。最后，偏振方向对于成像结果会产生影响，Chen等使用线偏振光和圆偏振光对胶原蛋白纤维激发得到SHG图像并进行对比，发现圆偏振光可以均匀地激发所有方向，而线偏振光更适用于研究纤维的排列方向[11]。二次谐波成像技术在生物医学中的应用在结构成像中的应用在生物组织中，结构蛋白如胶原、微丝、微管等，能够产生很强的SHG信号。尤其是胶原蛋白，由于其结构的非中心对称性以及强烈的二阶非线性极化率，是生物组织中能够产生SHG信号的重要物质。因此，可以用SHG成像来研究多种组织的纤维状胶原蛋白的形态，这样做不仅可以了解正常组织中的胶原蛋白结构的排列，也有助于研究异常组织的疾病状态。例如，用SHG成像比较成熟皮肤与新生皮肤内不同种类胶原的含量,以及正常皮肤与创伤皮肤内胶原种类的变化[12]。此外，SHG也可用来检测细胞内的微管。作为细胞骨架的重要组成部分之一，。微管为细胞形态提供结构支撑，并在有丝分裂等生命过程中发挥着重要的作用。微管的组成成分—β微管蛋白二聚体，通过聚合组装形成长度为几微米的纤维状结构，能产生SHG信号响应[8]。在生物膜成像和膜电压测量上的应用外源的SHG探针通常被研究者们使用，作为生物膜的造影剂，在生物膜的生命过程中对一些性质进行探测。因为染料分子结合到生物膜上时，在生物膜上的染料分子由与磷脂双分子层的结构，可以使其在液体／膜界面处有序地对齐排列，从而提高了偶极性，使SHG信号得到加强。SHG探针的染料分子要正常工作，必需具有以下特点：一是分子长度与拓扑结构和插入脂质膜相同；二是该分子的一端亲水，另一端疏水，具有两亲性[8]。使用光学探针测量神经元的膜电位比电极方法能提供更多位置的信号。同时，利用SHG染料对膜进行染色，通过探测在膜表面分布时的信号响应性质，可以研究细胞对于小分子的吸收、渗透和积累的过程。Gayen等利用SHG染料孔雀石绿对于表面和界面的敏感性，来分析分子跨膜的运输信息，评估了外部环境pH值对于抗菌小分子穿过革兰氏阴性大肠杆菌细胞包膜的影响[13]。在肿瘤研究中的应用在癌症早期诊断中，SHG成像作为一种高分辨率的光学无损层析成像方法,能后发挥良好作用。例如在黏膜组织,包括、耳、鼻、口腔及食道等,这种病变发生于皮下几百微米的部位，SHG成像完全能够到此深度并进行成像探测。基于此特点，SHG成像可以直接对癌变部位进行成像检测，而不用经过传统的组织切片分析。胶原蛋白可以在近红外光的激发下产生SHG信号，从而激发特定的光敏剂，通过敏化产生的单线态氧实现光动力治疗。相较传统的光动力治疗方法，使用近红外光对胶原蛋白进行二次谐波过程，来产生对应于光敏剂吸收峰的波长来激发光敏剂，这样做可以做到更大的组织穿透深度。利用胶原蛋白产生的SHG信号对特定基团的吸收截面没有依赖，同时不需要特定的激发波长，因此在可用于触发药物释放的基团和可发射的波长方面有着了极大的灵活性。在DNA检测上的应用我们不仅可以利用SHG成像技术，对各种直接可以产生SHG信号或者是通过SHG探针产生信号的生物组织进行无接触无损伤的实时成像，如胶原纤维或肌动球蛋白。而且由于DNA和蛋白质在生物化学和结构生物学中的相似性，由脱氧核糖核苷酸构成的DNA和由氨基酸构成的蛋白质大分子高级结构的形成机制是相似的。因此我们也可以利用SHG成像技术对细胞核提取物、培养细胞的细胞核等不同DNA样品进行检测，获取样品的SHG信号进行高解析度成像[14]。展望由于研究人员发现SHG成像在动态成像中可以作为很好的辅助工具，同时在活体生物组织成像中占据着至关重要的地位，其作为一种新的无接触光学成像手段，受到了研究者的广泛关注。二次谐波成像技术因为它自身所具有高空间分辨率、高成像深度、光漂白区域小、光损伤小、成像的亮度和信噪比高等优点，在细胞生物学、生物医学、临床医学等领域均显示出优秀的应用前景。但是SHG成像在实际的应用中，如生物医学和临床医学领域仍然不能得到广泛的应用，存在一定的制约。在各方面的原因里面，最不能忽略的是，SHG对于散射介质的要求，只有满足非中心对称性质的介质才能产生SHG信号。若想进行SHG成像，观测的样品中的生物组织/探针材料的二阶非线性光学系数一定不为零。在实际应用中，生物组织的胶原蛋白最容易产生SHG信号，因此在结构信息相关的疾病成像诊断外上，SHG成像应用最广泛。与此同时，生物体大部分组织可以发出的SHG信号相对难以获得，因此在许多的疾病成像诊断上存在限制。基于此原因，需要研究人员继续开发二次谐波成像探针，使其扩大应用范围。此外，SHG成像的成功与否与以下因素有关，需要对许多因素都进行优化。这些因素包括飞秒激光器的输出功率和稳定性、恰当的高数值孔径物镜、合适的探测器、合理的发射波长以及观测样本的选择(可产生强烈SHG信号的样品，例如样品内部具有数量巨大的胶原蛋白)。在SHG成像上，操作者需要在各方面小心翼翼的的进行试探与选择，这提高了操作的门槛。因此，对于SHG成像技术来说，稳定性的激光、更好的扫描方式、更高里面的的检测技术等方面需要研究人员的不停投入。可以预见,在不久的将来,随着SHG成像技术的不断发展个成熟，其优点将被进一步挖掘，SHG成像将成为生物医学研究和临床诊断中强有力的工具，且将广泛应用于各个领域。

【参考文献】[1]FrankenPA.HillAE.PetersCW.etal.Generationofopticalharmonics[J].PhysRevLett，1961.7(4):118－119.[2]Fine,S.,Hansen,W.P.Opticalsecondharmonicgenerationinbiologicalsystems.Appl.Optics,1971,10(10):2350-2353.[3]GannawayJ,S.C.Second-harmonicimaginginscanningopticalmicroscopy.Opt.QuantumElectron.,1978,10(5):435-439.[4]Freund,I.,Deutsch,M.,Sprecher,A.Connectivetissuepolarity.Opticalsecond-harmonicmicroscopy,crossed-beamsummation,andsmall-anglescatteringinrat-tailtendon.Biophys.J.,1986,50(4):693-712.[5]王楚,汤俊雄.光学[M].北京:北京大学出版社.2001[6]屈军乐,陈丹妮,杨建军,许改霞,林子扬,刘立新,牛憨笨.二次谐波成像及其在生物医学中的应用[J].深圳大学学报,2006(01):1-9.[7]郝淑娟,崔海瑛,何巍巍,邱忠阳,丁军荣.二次谐波成像技术[J].教育教学论坛,2017(52):194-195.[8]张子一,王明雪,刘志贺,房晓峰,吴长锋.二次谐波在生物医学成像中的应用[J].中国激光,2020,47(02):120-131+2.[9]GauderonR,LukinsPB,SheppardCJ.Optimizationofsecond-harmonicgenerationmicroscopy.[J].Micron(Oxford,England:1993),2001,32(7).[10]Mostaço-Guidolin,L.;Rosin,N.L.;Hackett,T.-L.ImagingCollageninScarTissue:DevelopmentsinSecondHarmonicGenerationMicroscopyforBiomedicalApplications.Int.J.Mol.Sci.2017,18,1772.[11]ChenXiyi,Nadi