CN116041448B 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用 （江苏瑞科生物技术股份有限公司）

本发明提供了一种新型冠状病毒免疫原性S蛋白的受体结合区或受体结合区的一部分，其株选自新型冠状病毒德尔塔(Delta)株和奥密克戎(Omicron)株中的至少一种。本发明的新型冠2含源自免疫优势毒株的第一抗原和源自流行优势毒株的第二抗原，各抗原分别包含S蛋白列如SEQIDNO:19,20,47,48,51,55中任一项所示。2.一种新型冠状病毒免疫原性物质，其特含源自免疫优势毒株的第一抗原和源自流行优势毒株的第二抗原，各抗原分别包含S蛋白白的S1亚基中的N端结构域(NTD)和/或foldon结构域，所述新型冠状病毒免疫原性物质的氨基酸序列如SEQIDNO:22,23,26,27,61中任3.根据权利要求1或2所述的新型冠状病毒病毒免疫原性物质还包含源自所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株的一个或5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，各抗原构成组合6.一种制备权利要求1_5中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的方法，其特征在8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物9.一种编码权利要求1_5中任一项所述新型冠状利要求10所述重组载体或权利要求11所述表达系统细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应314.根据权利要求13所述的新型冠状病毒蛋白疫苗，其特征在于，所述佐剂为AS03或MF59佐剂。一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的DNA任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的mRNA4[0005]本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒免疫原性物质，其包含不同毒株S蛋白[0009]在一些实施方式中，所述流行优势毒株选自新型冠状病毒德尔塔(Delta)株和奥5冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒WH01株S蛋白的受体结合区和奥密克戎(Omicron)新型冠状病毒贝塔(Beta)株S蛋白的受体结合区和德尔塔(Delta)株的受体结合区直接相连而形成；在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒贝塔(Beta)株S蛋白的受体结合区和奥密克戎(Omicron)株的受体结合区直接相连而6广泛传播的毒株以及抗原抗体的交叉反应确定合适含SEQIDNO:42所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQID体结合区包含SEQIDNO:64所示的氨基酸序列。[0024]在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质基酸序列。含SEQIDNO:43所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omic株的S蛋白的N端结构域包含SEQIDNO:67所示的氨基酸序列。[0031]在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQIDNO:22,23,30,49,50,56_59中任一项所示的氨基7NO:25所示的氨基酸序列。[0035]在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含Foldon结构域。[0037]在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包[0038]本发明还提供了一种制备所述新型冠状病毒免疫原性物质的方法，包括以下步[0047]本发明还提供了一种新型冠状病毒DNA疫苗，其包含编码所述新型冠状病毒免疫8出的免疫效果。本发明的研究还表明，利用编码本发明所述免疫原性物质的mRNA制备的mRNA疫苗对不同毒株同样具有很好的免疫效通过比较评估，已被证明与下列一种或多种具有一定全球公共卫生意义的变化相关的9(Delta)株和奥密克戎(Omicron)变异株的受体结合区设计了多种新型冠状病毒免疫原性[0081]源自德尔塔(Delta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、[0082]源自奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQIDNO:42所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的S蛋白NO:64所示的氨基酸序列。中，WH01株S蛋白的S1亚基中的N端结构域包含SEQIDNO:13所示的氨基酸序列，贝塔(Beta)株S蛋白的S1亚基中的N端结构域包含SEQIDNO:14所示的氨基酸序列，德尔塔(Delta)株的S1亚基中的N端结构域包含SEQIDNO:15所示的氨基酸序列，奥密克戎克戎(Omicron)BA.2变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQIDNO:65所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQIDNO:66所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQIDNO:67所示的氨基酸序列。[0084]在该实施例中，一些免疫原性物质还包括人源IgGFc结或者一些免疫原性物质还包括Foldon结构域以形成三聚体结构，人源IgGFc结构域包含[0086](1)源自WH01株的抗原，由两个SEQIDNO:1串联构成，其氨基酸序列为SEQID[0101](16)源自Delta株的抗原，其包含Delta株的N端结构域，由SEQIDNO:[0105](20)源自贝塔(Beta)株与奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的抗原，其包含贝塔[0106](21)根据主要变异株，进一步设计了源自2_4种变异株的抗原，其氨基酸序列如[0112]将编码以上抗原的DNA序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化后外送合成并克隆后的目的基因DNA片段通过SalI和NotI位点克隆到载体pWX4.1中，得到瞬转表达载体健康是实现最大性能的关键。采用ExpiCHOExpressionMedium继代培养和扩增CHO细胞到95_99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃,将细胞稀释至最终密度为5×试剂和质粒DNA复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μlOPti_PROSFM添加1ug质粒混匀放置WesternBlot图谱如图2_14[0130]利用实施例4_7中制备的疫苗对8～10周龄的BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物技[0133]在佐剂方面，本发明以RBD(Beta)_RBD(Beta)为抗原并联合不同佐剂免疫小鼠时[0137]在抗原方面，本发明首先考察了相同毒株RBD组成的候选抗原针对不同毒株的中(SEQIDNO:21)仅针对Delta株假病毒的几何平均滴度较高，针对WH01株、D614G株和[0141]本发明在进一步的研究中筛选了特定毒株的RBD作为优选抗原组分，其能够提高[0143]该实施例中采用实施例9的方法检测了不同毒株RBD组合针对不同类型假病毒的[0149]与SEQIDNO:21相比，Beta株与De20)针对Delta株假病毒的几何平均滴度稍有下降，但针对D614G株和OmicronBA.1株假病毒的几何平均滴度分别提高了2倍和1倍，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值达到[0150]与SEQIDNO:21相比，WH01株与De19)针对WH01和D614G株假病毒的几何平均滴度变化不大，但针对Delta株和OmicronBA.1假病毒的几何平均滴度更为均衡，Beta株的RBD可以提高抗原对非Beta株变异株的中和抗[0152]本发明进一步研究了在形成Foldon三聚体时不同毒株RBD的组合对中和抗体滴度Foldon(SEQIDNO:61)的5个血清样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度已证明，BA.1与BA.2的抗原性有着显著差别(参见Antigeniccarto2revealsthatOmicronBA.1andBA.2areantigenicaetal.SCIENCEIMMUNO针对该毒株假病毒的滴度会明显提高。结合新型冠状病毒的流行趋势，本发明将德尔塔样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT如表的NTD和RBD组合形成的候选抗原SEQIDNO:45和Delta株的NTD和RBD组合形成的候选抗原平均滴度的平均值分别由38492和46948上升到5RBD组合形成的候选抗原SEQIDNO:22针对不同假病毒的几何平均滴度明显提高，针对四NTD和RBD以及Delta株的RBD组合形成的候选抗原SEQIDNO:23针对D614G株和Delta株假[0171]如表7所示，与SEQIDNO:19相比，WH01株和Delta株的RBD组合中进一步加入Foldon结构域(SEQIDNO:26)或同时加入NTD和Foldon结构域(SEQIDNO:27)以形成三聚[0172]可见，本发明所述由免疫优势毒株和流行优势毒株的RBD组合形成的抗原对不同性化质粒样品，使用T7HighYieldRNATranscriptionKit(Novoprotein，CAT：E131_[0188]将实施例11获得的各mRNA与脂质纳米颗粒混合得到核酸_脂质纳米颗粒复合物，[0190]利用实施例12获得的各mRNA疫苗对8～10周龄的BALB/c小鼠(购自北京华阜康生不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值为31133，且针对Omicron毒株的中和抗体滴度明码RBD(WH01)RBD(BA.1)的mRNA(SEQIDNO:69)和编码RBD(Beta)RBD(Delta)的mRNA(SEQ(Beta)RBD(BA.1)的mRNA(SEQIDNO:71)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体